游海星，林 堅，林魯飛

(海南省?？谑械谌嗣襻t(yī)院兒科 570102)

支氣管哮喘是一種常見的兒童呼吸道疾病。據(jù)WHO統(tǒng)計，近年來美國、澳大利亞及歐洲發(fā)達國家兒童哮喘的發(fā)病率和病死率均有所上升。在中國，兒童哮喘患病率也呈現(xiàn)上升的趨勢[1]。哮喘嚴重影響兒童的身心健康，已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的一個重要的公共衛(wèi)生問題[2]。香草醛亞型1(TRPV1)受體是由辣椒素激活的辣椒素受體，它為陽離子通道超家族成員并廣泛表達于哺乳動物呼吸系統(tǒng)[3]。研究表明TRPV1在兒童支氣管哮喘發(fā)病調(diào)控中有重要影響[4]。隨著對呼吸系統(tǒng)炎癥機制的深入了解，哮喘中TRPV1基因信號調(diào)節(jié)已成為一個研究熱點。眾所周知，支氣管哮喘是一種由多種細胞和細胞因子共同參與的慢性呼吸道炎癥性疾病[5]。然而，目前TRPV1及相關(guān)細胞因子信號轉(zhuǎn)導通路，在兒童支氣管哮喘的發(fā)病機制中尚不清楚。本研究擬通過臨床數(shù)據(jù)，KEGG數(shù)據(jù)庫及回顧性分析篩選兒童支氣管哮喘相關(guān)的細胞因子，建立兒童支氣管哮喘TRPV1及相關(guān)細胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為研究兒童支氣管哮喘的發(fā)病機制提供一定的線索。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2016年12月在本院兒科就診的3～14歲哮喘患兒100例作為病例組，其中男57例，女43例，體質(zhì)量(18.2±5.4)kg。選擇同期來本院做健康體檢的兒童100例作為對照組，其中男59例，女41例，體質(zhì)量(17.7±4.8)kg。病例組患兒的哮喘診斷均符合國際哮喘指南。對照組兒童無哮喘家族史、個人過敏史及支氣管哮喘病史。所有研究對象的監(jiān)護人均簽訂知情同意書，本研究獲得?？谑械谌嗣襻t(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2方法

1.2.1血液標本采集 接受哮喘治療前，采集兩組兒童的5 mL外周靜脈血，吸取1 mL標本與乙二胺四乙酸(EDTA)混合抗凝用于提取總RNA，其余血液標本以2 000 r/min離心10 min后放于-70 ℃冰箱用于檢測。

1.2.2受試者TRPV1 mRNA水平實時定量PCR檢測 將1 mL外周靜脈血與EDTA混合抗凝，用總RNA快速提取試劑盒從外周血淋巴細胞中提取RNA 。根據(jù)試劑盒操作手冊使用Oligo DT作為引物，總RNA作為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank所列的TRPV1基因序列，合成TRPV1 mRNA上游引物序列和下游引物序列。上游引物序列:5′-GGC TGT CTT CAT CAT CCT GCT GCT-3′;下游引物序列:5′-GTT CTT GCT CTC CTG TGC GAT CTT GT-3′;PCR產(chǎn)物的大小是117 bp 。以GAPDH作為內(nèi)參，實時定量PCR合成的GAPDH上游引物序列和下游組成引物序列為：上游引物序列:5′-TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC-3′,下游引物序列:5′-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3′GAPDH PCR產(chǎn)物大小為87 bp。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：預變性94 ℃ 10 min；變性94 ℃ 30 s；退火56 ℃ 30 s；延伸72 ℃ 30 s，總共40個循環(huán)，30個循環(huán)后延伸溫度改為7 min，由Wilcoxon秩和檢驗計算置信區(qū)間和相對定量，用2-ΔΔCT比較病例組和對照組的TRPV1的相對表達水平。

表1 兩組rs4790521和rs4790522基因型分布差異(n)

1.2.3篩選和檢測目標SNP位點 參考美國國家生物技術(shù)信息中心NCBI SNP數(shù)據(jù)庫，設(shè)定MAF(minor allele frequency)> 5%且r2>0.8，篩選出UTR-3基因的特定SNP。SNP檢測:上海英駿生物技術(shù)有限公司測序PCR反應(yīng)產(chǎn)物。

1.2.4血涂片細胞計數(shù)和全血清IgE檢測 在400倍鏡下進行嗜酸性粒細胞的計數(shù)，總血清IgE水平則通過雙抗夾心的ELISA檢測。

1.2.5細胞因子檢測 ELISA檢測病例組患兒治療前后及對照組兒童血清中γ-干擾素(IFN-γ)，IL-2，IL-17A，IL-4 和IL-5的水平，所有的檢測步驟均按試劑說明書進行。

2 結(jié) 果

2.1兩組TRPV1基因表達水平和SNP位點分析 病例組患兒外周血中的TRPV1基因表達水平為6.27±2.13高于健康兒童的3.08±1.25(t=12.92，P<0.01)。根據(jù)基因測序，兩組間兩個SNP位點(rs4790521和rs4790522)基因型分布也不同。根據(jù)基因測序結(jié)果rs4790521位點的分布，病例組與對照組的CC、CT、TT 3個基因型比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；等位基因C在病例組中遠多于對照組(P<0.05)。而rs4790522位點的CC、CA、AA 3個基因型分布在兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，等位基因C在病例組中遠多于對照組(P<0.05)。見表1。

2.2兒童支氣管哮喘的相關(guān)細胞因子水平和嗜酸性粒細胞計數(shù) 病例組患兒血清中IgE水平，嗜酸性粒細胞(EOS)計數(shù)，IFN-γ、IL-2、IL-17、IL-4和IL-5水平與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 兩組哮喘的相關(guān)細胞因子水平和嗜酸性粒細胞計數(shù)比較

2.3兒童支氣管哮喘相關(guān)的細胞因子和TRPV1基因Logistic回歸分析 通過Logistic回歸分析結(jié)果顯示：外周血嗜酸性粒細胞計數(shù)、TRPV1 mRNA表達水平、IL-4和IL-5水平是兒童支氣管哮喘的危險因素。見表3。

表3 兒童哮喘相關(guān)細胞因子和TRPV1基因的Logistic回歸分析

2.4建立TRPV1基因的兒童支氣管哮喘調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 根據(jù)KEGG信號通路數(shù)據(jù)庫，對TRPV1和兒童支氣管哮喘相關(guān)的細胞因子包括IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-17A進行了分析，繪制出一個初步的兒童支氣管哮喘的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，見圖1。兒童支氣管哮喘調(diào)控網(wǎng)絡(luò)非常復雜，且TRPV1與TH1、Th2和Th17等細胞因子均能引發(fā)兒童支氣管哮喘。Th1可能提升腫瘤壞死因子(TNF)-β，IFN-γ和IL-2水平，Th2可能提升IL-4、IL-5和IL-10水平，Th17可能提升IL-17A水平，而IL-17A會影響IL-1β從而影響TRPV1。此外，某些可能導致免疫功能紊亂或外周敏感性增加、氣管黏膜損傷的因素都會影響TRPV1水平，最后導致兒童支氣管哮喘。

2.5突變位點rs4790522和rs4790521的具體定位 突變位點rs4790522和rs4790521均定位于TRPV1基因的3′非翻譯區(qū)，見圖2。

圖1 兒童支氣管哮喘部分調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

兩條豎紅線間的基因序列為TRPV1基因的CDS區(qū)基因序列;藍色盒子中的為突變堿基；點線區(qū)的基因序列正是突變后消失的miRNA結(jié)合位點；直線區(qū)基因序列則為突變后新的miRNA結(jié)合位點

圖2 突變位點rs4790522和rs4790521的具體定位

3 討 論

近年來，TRPV1與兒童支氣管哮喘的關(guān)系已成為哮喘病理機制研究的熱點，且取得了一定的進展。如BAKER等[4]研究表明TRPV1可能是誘導兒童哮喘的重要信號調(diào)節(jié)因子。此外，TRPV1在支氣管狹窄、蛋白分泌、氣管黏膜水腫、炎性細胞趨化、咳嗽反射等方面也起著重要作用[6]。最近的研究表明TRPV1存在于免疫組化的T細胞中，且能調(diào)節(jié)CD4+T細胞活性及炎癥細胞的特異性[7]。MCGARVEY等[8]在人氣道上皮細胞發(fā)現(xiàn)功能性的TRPV1在難治性支氣管哮喘患者氣道中高表達。本研究對TRPV1基因測序發(fā)現(xiàn)病例組和對照組兩個SNP位點基因型分布存在明顯差異。TRPV1的mRNA水平和兩個SNP位點可能是兒童哮喘發(fā)病的反映指標。

哮喘的另一個重要的致病機制與 Th1、Th2、Th17、Treg細胞因子不平衡有關(guān)。Th1型細胞因子主要參與細胞免疫。Th2型細胞因子主要引起一些病理反應(yīng)，如增加血漿IgE水平，升高氣道EOS，引起氣道平滑肌的增生和肥大等。細胞因子Th17在促炎癥反應(yīng)和自身免疫中起重要作用。Treg型細胞因子可以通過分泌IL-10或細胞接觸機制(CTLA-4和GITR)調(diào)節(jié)和抑制免疫反應(yīng)。本研究顯示兩組外周血IgE水平、嗜酸性粒細胞計數(shù)均存在差異，這也表明了IgE水平和嗜酸性粒細胞計數(shù)在兒童支氣管哮喘中起重要作用。此外，兩組IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5和IL-17A水平也差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示嗜酸性粒細胞計數(shù)、IL-1、IL-5和TRPV1 mRNA水平是兒童支氣管哮喘的危險因素。

本研究中建立調(diào)控網(wǎng)絡(luò)包含的基因和細胞因子是通過搜索KEGG數(shù)據(jù)庫結(jié)合其他的文獻所構(gòu)建的。兒童支氣管哮喘調(diào)控機制十分復雜，且其中TRPV1、Th1、Th2、Th17之間又相互影響共同導致免疫功能紊亂或外周敏感增加引起兒童支氣管哮喘。本研究建立的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)僅為兒童支氣管哮喘調(diào)控機制的一部分。 國內(nèi)外關(guān)于miRNA和兒童支氣管哮喘的研究大多數(shù)集中于miRNA在支氣管哮喘信號通路或者miRNA作為哮喘診斷標志等方面。HUO等[9]發(fā)現(xiàn)上皮細胞和血漿的miR-181b-15p是呼吸道嗜酸性增多的標志物，且能通過靶向調(diào)節(jié)促炎因子的表達產(chǎn)生嗜酸細胞性氣道炎癥。MAES等[10]的研究發(fā)現(xiàn)miR-223-3p、miR-142-3p及miR-629-3p在嚴重哮喘患者痰液中高表達。本研究顯示TRPV1miRNA能作為氣道炎癥標志物。另外，rs4790522和rs4790521兩個位點的突變在TRPV1的3′UTR端，3′調(diào)控區(qū)在基因表達方面起重要作用，在這個區(qū)域突變可能影響基因的表達。TRPV1基因rs4790521和rs4790522突變位點介導相應(yīng)miRNA的改變可能是病例組和對照組間存在顯著差異的潛在分子機制。本研究建立的兒童支氣管哮喘調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為兒童支氣管哮喘機制研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。