宮頸癌是嚴重威脅女性健康的第二大惡性腫瘤,是目前世界范圍內(nèi)具有高發(fā)病率和高死亡率的生殖系統(tǒng)的疾病。宮頸癌主要發(fā)生在老年女性,五年生存率極低,宮頸癌復(fù)發(fā)病人的生存期僅為1～2年[1]。文獻報道,高度保守的真核細胞真核翻譯起始因子5A(eIF5A)基因與癌癥發(fā)生機制密切相關(guān)。在所有哺乳動物細胞中,eIF5A-1基因呈現(xiàn)顯著高表達,在增殖細胞中eIF5A-1表達更為豐富[2]。本研究通過構(gòu)建eIF5A-1過表達和沉默表達質(zhì)粒載體作用SiHa細胞,觀察eIF5A-1在宮頸癌細胞生物學(xué)特征改變過程中的功能及作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料收集 選取2015年6月至2016年10月在青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就治的宮頸癌病人40例,宮頸組織病理診斷明確。宮頸癌病人臨床資料收集完整無誤。將宮頸癌病人分為老年組和非老年組,其中老年組18例,年齡62～69歲,平均(66.1±3.2)歲,非老年組22例,年齡27～58歲,平均(42.1±7.1)歲。每例對象均收集癌組織及對應(yīng)癌旁正常組織,取材后置于-79 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細胞培養(yǎng) 宮頸癌細胞株SiHa由中國典型物種保藏中心提供。細胞接種在DMEM培養(yǎng)基中(包含小牛血清20%、鏈霉素100μg/mL、慶大霉素100 U/mL以及非必需氨基酸10 mL/L)。宮頸癌細胞培養(yǎng)及體外實驗在37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進行。

1.3 免疫印跡 取一定體積的宮頸癌組織及癌旁正常組織,分別加入5倍體積的組織裂解液,移液器反復(fù)吹打成糊狀,促使蛋白析出。取蛋白質(zhì)標本與2×loading buffer混勻,100 ℃,20 min后,10 000 r/min,離心15 min;取上清樣本進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE);電泳結(jié)束后,進行電轉(zhuǎn)移至偏二氟乙烯膜(PVDF);加入5%脫脂奶粉稀釋的eIF5A-1一抗,37 ℃孵育4 h,以TBS洗滌PVDF膜,每次15 min,洗滌3次,加入HRP連接的二抗,37 ℃孵育1 h后,加入顯色液,避光反應(yīng)6～12 min后,曝光20 s;Bio-Rad凝膠成像分析儀對免疫印跡條帶進行灰度計算,以下列公式進行計算:目的蛋白/內(nèi)參蛋白。

1.4 構(gòu)建eIF5A-1 siRNA質(zhì)粒載體 siRNA構(gòu)建采用pGenesil-1質(zhì)粒作為載體,BamHⅠ+HindⅢ進行雙酶切后,采用1%瓊脂糖凝膠進行大分子片段回收。pGenesil-1線性化后與合成的eIF5A-1 siRNA(序列為:5′-AAC GGA ATG ACT TCC AGC TGA-3′)(隨機選取一段與目的基因無關(guān)序列作為Negative siRNA),在22 ℃水浴中,與T4DNA連接酶反應(yīng)24 h;取連接產(chǎn)物6 μL轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞,均勻涂布LB平板上(含20μg/mL Kanar抗性),37 ℃,24 h;挑取陽性單克隆菌落5個,轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)液中,37 ℃,400 r/min搖床,24 h;提取質(zhì)粒后,SalⅠ進行酶切,1%瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定;將篩選出的陽性克隆質(zhì)粒由武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司進行DNA序列分析,證實pGenesil-1質(zhì)粒中正確插入目的eIF5A-1基因片段,本研究中,重組質(zhì)粒命名分別為eIF5A-1 siRNA和Negative siRNA。

1.5 構(gòu)建eIF5A-1 vector質(zhì)粒載體 將BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點加入eIF5A-1引物序列中,eIF5A-1引物與探針的設(shè)計,其上游序列為:Primer-F (5′-AAC ATA TGT CCG ATG ATG AGG GAA A-3′)和Primer-R (5′-AAG GAT CCT TAC TTT TCA ACA GCA TTT TTA-3′)。本研究中反應(yīng)體系如下:0.2μg DNA模板,0.1μg質(zhì)粒載體,加ddH2O至7.2μL,45 ℃孵育8 min,冷卻0 ℃。加入10 ng cDNA、100 ng質(zhì)粒載體、1μL T4DNA連接酶,以ddH2O定容至10μL,26 ℃,2 h,構(gòu)建重組eIF5A-1 vector。充分混勻后,10 000 r/min,離心15 min, 12 ℃,24 h,置于-20 ℃保存?zhèn)溆?重組質(zhì)粒分別命名為eIF5A-1 vector和Empty eIF5A-1 vector。

1.6 宮頸癌細胞活力的檢測 分別將構(gòu)建的Negative siRNA、eIF5A siRNA、Empty vector和eIF5A vector轉(zhuǎn)染宮頸癌細胞,培養(yǎng)48 h后,采用甲基噻唑基四唑(MTT)比色法檢測SiHa細胞活力,實驗步驟如下。用0.25%胰蛋白酶消化細胞10 min后,用完全營養(yǎng)液終止消化,調(diào)整細胞密度為1000～10 000個/孔,接種到96孔板,每孔200μL;繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,加入0.5% MTT溶液20μL,培養(yǎng)4 h后,棄去上清。加DMSO溶液200μL,充分震蕩20 min,使形成的結(jié)晶物甲躦徹底溶解,于490 nm波長處,酶標儀讀取各孔OD值。

1.7 宮頸癌SiHa細胞增殖的測定 分別將構(gòu)建的Negative siRNA、eIF5A-1siRNA、Empty vector和eIF5A-1 vector轉(zhuǎn)染宮頸癌細胞,培養(yǎng)48 h后,采用3H-胸腺嘧啶核苷酸(3H-TdR)摻入法檢測SiHa的增殖能力。首先加入0.5～1μci3H-TdR 50μL繼續(xù)培養(yǎng)12～18 h。收集細胞后,10 000 r/min,離心15 min,棄去上清,冷PBS充分洗滌3次,用三氯乙酸、無水乙醇進行充分抽干轉(zhuǎn)移置玻璃纖維濾紙上的細胞膜片,烘干后,剪濾紙片,將膜放入8 mL閃爍液中,暗視野,室溫放置25 min,用Beckman LS-9800型液體閃爍計數(shù)儀進行檢測,采用每分鐘放射性脈沖數(shù)(cpm)進行統(tǒng)計,實驗獨立重復(fù)檢測3次,取平均值。

2 結(jié)果

2.1 eIF5A-1基因在宮頸癌和癌旁組織中的表達 免疫印跡結(jié)果顯示,eIF5A-1蛋白在宮頸癌組織中的表達顯著高于其對應(yīng)的癌旁組織(P<0.01)。其中老年組eIF5A-1蛋白在宮頸癌組織中的表達高于非老年組(P<0.05)。見表1。

表1eIF5A-1蛋白在宮頸組織中的表達

注：與癌旁正常組織比較,**P<0.01;與非老年組比較,△P<0.05.

2.2 宮頸癌SiHa細胞活性檢測 MTT結(jié)果表明,eIF5A-1 vector組與Empty vector組比較,SiHa細胞的活性顯著升高(P<0.01);eIF5A-1 siRNA組與Negative siRNA組進行比較,宮頸癌細胞活性顯著下降(P<0.05)。見圖1。

2.3 宮頸癌SiHa細胞增殖的檢測3H-TdR數(shù)據(jù)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染eIF5A-1 vector組與Empty vector組比較,增殖細胞數(shù)量明顯增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);轉(zhuǎn)染eIF5A-1 siRNA質(zhì)粒組與Negative siRNA組進行比較,增殖宮頸癌細胞數(shù)量顯著減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

3 討論

高危型HPV 16持續(xù)性感染是宮頸上皮鱗狀細胞永生化的重要致病因素,持續(xù)性感染導(dǎo)致E6癌基因的表達對于宮頸癌細胞發(fā)生發(fā)展尤為重要[3]。文獻報道顯示,HPV 16 E6基因是通過誘發(fā)腫瘤抑制蛋白p53的降解,從而引發(fā)宮頸癌的發(fā)生[4]。截至目前, HPV 16 E6引發(fā)宮頸癌發(fā)生的機制眾多,本研究為了探尋HPV 16 E6的下游作用靶標,首先分析了宮頸癌組織及癌旁正常組織中eIF5A-1基因的表達,旨在探索HPV 16 E6基因發(fā)生過程中,與eIF5A-1基因的潛在關(guān)系。免疫印跡結(jié)果顯示,eIF5A-1蛋白的表達在宮頸癌組織中顯著高于其對應(yīng)的癌旁組織,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。其中老年組eIF5A-1蛋白在宮頸癌組織中的表達高于非老年組。因此,本研究推斷在宮頸癌細胞腫瘤轉(zhuǎn)化和永生化過程中,eIF5A-1基因是誘發(fā)宮頸癌細胞發(fā)生發(fā)展的重要下游因子。

注：與Plain medium組比較, *P<0.05; 與Negative siRNA組比較,▲P<0.05; 與Empty vector組比較,△P<0.01圖1SiHa細胞的活性檢測

注：與Plain medium組比較, *P<0.05,**P<0.01; 與Negative siRNA組比較,▲P<0.05; 與Empty vector組比較,△△P<0.01圖2SiHa細胞的增殖檢測

在癌癥發(fā)生發(fā)展中,翻譯作為基因表達途徑中的關(guān)鍵步驟常常處于失調(diào)狀態(tài)[5]。在生物體蛋白質(zhì)合成中,eIF5A基因發(fā)揮重要作用。癌癥發(fā)生過程中與eIF5A的過表達緊密相關(guān)。目前發(fā)現(xiàn)有eIF5A-1和eIF5A-2兩種異構(gòu)體,eIF5A-1主要存在于正常組織中,eIF5A-2局限于腦和睪丸[6]。文獻報道顯示,兩種eIF5A水平增多是腫瘤衍生細胞系以及多種癌癥的特征,尤其eIF5A-1基因與細胞侵襲性，癌癥進展、轉(zhuǎn)移、增殖以及不良的臨床預(yù)后有關(guān)。本研究中,我們著重關(guān)注eIF5A-1另一個生物學(xué)特性:即其作為調(diào)節(jié)因子,在哺乳動物細胞凋亡中的潛在作用。文獻報道,eIF5A-1的過表達可誘發(fā)骨骼干細胞分化[7]和肝癌細胞增殖[8]。本研究結(jié)果顯示,eIF5A-1在老年人宮頸癌中的表達顯著高于非老年人,提示高表達的eIF5A-1基因可能賦予了免疫功能衰退的老年人宮頸癌更強的活力和侵襲能力。采用siRNA有效沉默eIF5A-1基因的表達,宮頸癌細胞的生物學(xué)特性,如細胞的活性和增殖均呈現(xiàn)顯著降低;而過表達eIF5A-1基因,宮頸癌細胞的活性和增殖均呈現(xiàn)顯著增高。以上數(shù)據(jù)提示了eIF5A-1基因在誘發(fā)宮頸癌發(fā)生中的重要作用,以上問題的闡明為宮頸癌的防治提供了新的線索和潛在的干預(yù)靶標。