唐 靜，賈昱嫻，農(nóng) 麗，覃芳卉，鐘武寧，譚愛花，劉 燕，王洪學，王 涵，謝偉敏，陸永奎，周文獻

(廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺及骨軟組織腫瘤內科，南寧 530021)

乳腺癌是分子水平表達高度特異的一類疾病，其中一種分子亞型為三陰型乳腺癌(TNBC)。該類型乳腺癌雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人表皮生長因子受體-2(HER-2)均為陰性，是療效和預后較差的乳腺癌亞型之一[1]。探尋其發(fā)病機制和潛在的生物治療靶點成為近年來的熱點。低氧誘導因子-1(HIF-1)是目前所發(fā)現(xiàn)的唯一特異在低氧條件下介導細胞反應的核轉錄因子。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β兩個亞基組成的異二聚體，其中β亞基不受氧的調節(jié)和影響，而α亞基是缺氧誘導的,是調節(jié)活性的功能亞基。研究證實,HIF-1α在腫瘤組織中大量表達,不僅與腫瘤組織的血管生成、能量代謝、侵襲轉移、放療抵抗性相關，還與藥物耐藥性相關[2]。在缺氧條件下腫瘤組織中的HIF-1α上調使肺腺癌轉移相關轉錄本-1(Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT-1)基因啟動子甲基化，使其在增殖的腫瘤細胞中異常表達[3]。MALAT-1屬lncRNA家族重要成員之一，長度約8.7 kb，基因位于人染色體11q13.1，具有高度保守的核苷酸序列。以往文獻報道，MALAT-1在乳腺癌中異常表達，參與乳腺癌細胞的遷移、侵襲及克隆增殖[4-5]。但目前有關兩者在TNBC的表達與臨床病理特點相關性的研究報道較少。本研究檢測TNBC患者癌組織標本及其對應癌旁組織標本中MALAT-1、HIF-1α mRNA的表達情況，且分析其與TNBC的臨床特征關系。本研究了解MALAT-1、HIF-1α在TNBC的發(fā)生、發(fā)展中的作用，希望為TNBC患者的個體化治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1標本收集 收集廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院2013年1月至2014年6月33例患者手術切除的TNBC及癌旁組織標本，患者均為女性，年齡31～69歲，隨訪至2016年6月。腫瘤臨床分期Ⅰ期4例，Ⅱ期17例，Ⅲ期12例。標本保存于-80 ℃冰箱中。

1.2 方法

1.2.1染色方法 采用免疫組織化學SP法。對33例TNBC癌組織及癌旁組織依次進行低聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，脫蠟，水化，抗原修復，血清封閉，然后進行兔抗人HIF-1α多克隆抗體一抗4 ℃孵育過夜。取出標本后按說明書加入二抗。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復染，沖洗反藍。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。

1.2.2結果判定 采用染色強度與陽性細胞百分數(shù)相結合的判讀標準。采用雙盲法判定染色結果。HIF-1α陽性定位在細胞核或細胞質中。細胞核或細胞質無染色或輕微染色判為陰性。細胞核或細胞質有較強染色，且陽性細胞數(shù)比例大于或等于50%，或者細胞核或細胞質強染色，且陽性細胞數(shù)比例大于或等于10%判讀為陽性。

1.2.3引物設計與合成 使用美國國立生物技術信息中心網(wǎng)絡查詢到相應基因的mRNA序列，用引物設計軟件Premier5.0設計相應基因引物，并用OLIGO 7.0對引物的可行性進行評估。內參選用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。所有引物選擇聚丙烯酰氨凝膠電泳(PAGE)純化級別，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。具體引物序列如下：MALAT-1上游引物5′-TGC CCA TTC ACT GCC TCC T -3′，下游引物5′-TGC CGA CCT CAC GGA TTT T-3′，擴增產(chǎn)物片段長度為93 bp。HIF-1α上游引物5′-TCC AAG CCC TCC AAG TAT-3′；下游引物5′-ATG CTA AAT CGG AGG GTA-3′，擴增產(chǎn)物片段長度為568 bp。

1.2.4實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測 Trizol法提取總RNA，操作按說明書進行，采用ND-2000C微量紫外分光光度計測定總RNA濃度。反轉錄反應(TaKaRa公司產(chǎn)品)：2.0 μL 5×gDNA Eraser Buffer、1.0 μL gDNA Eraser、500 ng總RNA、加入10 μL RNase Free ddH2O。然后在PCR儀42 ℃水浴2 min。按順序加入1.0 μL PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ、1.0 μL RT Primer Mix、4.0 μL 5×PrimeScript Buffer 2、4.0 μL RNase Free ddH2O、總體積20 μL。37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 5 min。水浴1～2 min。反轉錄合成的cDNA在-80 ℃中保存用于PCR。PCR總反應體積為20 μL，包括SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，QNRox Reference Dye 0.2 μL，上下游引物各2 μL，CDNA模版2 μL，RNase-Free水6.8 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共循環(huán)40次。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分離，并采用自動電泳凝膠成像分析儀及分子分析軟件進行圖像掃描和分析。將目的基因的mRNA實際表達水平與GAPDH mRNA實際表達水平比較，用2-△△CT法得到MALAT-1、HIF-1α mRNA相對表達水平。

2 結 果

2.1HIF-1α蛋白在癌組織及癌旁組織陽性表達情況 在33例TNBC組織中，有23例陽性表達HIF-1α蛋白,10例陰性表達HIF-1α蛋白；33例癌旁組織中，有15例陽性表達HIF-1α蛋白，18例陰性表達HIF-1α蛋白，TNBC組織的HIF-1α蛋白陽性表達率(69.7%)明顯高于癌旁組織(45.4%)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=3.97,P<0.05)。

2.2MALAT-1、HIF-1α在癌組織及癌旁組織的表達情況 TNBC組織的MALAT-1的RNA表達水平為2.62±0.23，癌旁組織的表達水平為2.02±0.08，兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義(t=12.73，P<0.05)。TNBC組織的HIF-1α的RNA表達水平為129.79±15.34，癌旁組織的表達水平為43.46±5.14，兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義(t=32.48，P<0.05)。

表1 乳腺癌組織中的MALAT-1、HIF-1α的RNA表達量與臨床病理參數(shù)的相關

2.3TNBC組織中的MALAT-1、HIF-1α的RNA表達水平與臨床病理參數(shù)的相關性 33例TNBC患者有5例分化程度Ⅰ級，16例Ⅱ級，12例Ⅲ級；15例沒性有淋巴結轉移，18例淋巴結轉移陽性；浸潤深度Tis～T1有10例，T2有14例，T3～T4有9例；臨床分期Ⅰ期4例，Ⅱ期17例，Ⅲ期12例。隨訪期間出現(xiàn)復發(fā)14例，沒有出現(xiàn)復發(fā)19例。癌組織中的MALAT-1、HIF-1α mRNA的表達水平與TNBC的分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期相關，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

3 討 論

由于TNBC作為乳腺癌的一種分子亞型，其復發(fā)率高，耐藥性及易轉移的特點是該疾病預后差的主要因素，目前臨床上尚無對于TNBC有效的治療措施。TNBC腫瘤生長微環(huán)境的機制尚不清楚。如何選擇靶點進行靶向治療成為TNBC治療的關鍵和難點。缺氧微環(huán)境常見于快速生長的腫瘤組織中。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤新生血管無法滿足無限增殖的腫瘤細胞，導致細胞氧濃度下降，脯氨酸羥化酶、天冬酰氨胺羥化酶失活，進而激活下游靶基因HIF-1α轉錄。HIF-1α通過與低氧反應元件結合，激活下游靶基因轉錄表達[6]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)HIF-1α可以激活多種靶基因產(chǎn)物，并且大多數(shù)靶基因在腫瘤組織的血管生成、能量代謝、侵襲轉移中扮演重要角色[7]。

MALAT-1是第一個被證實與腫瘤轉移和預后有關的lncRNA，其高表達與早期非小細胞肺癌術后轉移密切相關[8]。研究表明MALAT-1 lncRNA在MCF-7乳腺癌細胞缺氧條件下高度表達[9]。研究證實MALAT-1在多種腫瘤組織出現(xiàn)異常表達，可能參與腫瘤細胞的分化、增殖、凋亡、遷移及侵襲等過程[10-12]。

本研究結果表明，HIF-1α蛋白、MALAT-1、HIF-1α RNA在TNBC癌組織的表達水平明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示MALAT-1、HIF-1α RNA的異常表達可能參與了TNBC的發(fā)生、發(fā)展過程，與近年來相關文獻報道一致[13-18]。提示乳腺癌組織中HIF-1α蛋白、MALAT-1、HIF-1α RNA的表達可作為其向惡性轉化的一個標準。

本研究顯示 MALAT-1、HIF-1α RNA在TNBC的表達與浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移、臨床分期相關,提示MALAT-1、HIF-1α可能在TNBC發(fā)生、發(fā)展和浸潤轉移過程中發(fā)揮了一定的作用,并有可能提示預后，與近年來相關文獻報道一致[19-22]。文獻報道，已有基于HIF-1的靶向治療處于試驗階段，利用 HIF-1為靶點的基因治療主要有反義核酸技術和RNA干擾。其中代表藥物有miR-20b、EZN-2968，均可以抑制腫瘤HIF-1α的表達，將在未來進入臨床階段[23]，有望為TNBC找到新的有效的靶向治療途徑。本研究顯示,MALAT-1、HIF-1α RNA在TNBC中的表達與浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移、臨床分期具有相關性。

本研究尚有許多不足之處,比如樣本量較小,有一定的局限性,MALAT-1和HIF-1α的作用機制缺乏分子水平實驗支持,有待在后續(xù)實驗中進一步補充。