蘇 偉,賀菊香

(1青海仁濟(jì)醫(yī)院普通外科,西寧 810021;2青海大學(xué)病理研究室)

胃癌是全球常見的的惡性腫瘤,在我國各種惡性腫瘤中發(fā)病率居首位。胃癌預(yù)后相對較差,在我國胃癌死亡率居惡性腫瘤第二位[1]。近年隨著飲食結(jié)構(gòu)改變和工作壓力增大,胃癌發(fā)病率越來越高,且呈年輕化趨向。胃癌早期無明顯癥狀,缺乏有效的篩查技術(shù)手段,致使早期診斷率較低,確診時多為中晚期,錯失了最佳治療時期[2]。胃癌病因尚未明確,加之缺乏特異的分子標(biāo)記物,導(dǎo)致以手術(shù)為主、化療為輔的綜合治療也未能顯著提高患者存活率[3]。因此,探尋胃癌的特異分子標(biāo)記物,對胃癌早期的診斷和存活率提升有重要意義。微小RNA(miRNA)是近年發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源小RNA,主要在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá),在腫瘤的發(fā)展過程中起著促癌或抑癌作用[4]。GTP酶激活蛋白SH3功能結(jié)合蛋白2(Ras-GAP SH3-binding protein 2,G3BP2)是一種能與Ras-GAP SH3結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合的蛋白,在胚胎組織中廣泛表達(dá),且在不同進(jìn)展期的膀胱癌腫瘤組織中高表達(dá)[4]。本研究通過檢測胃癌組織miR-200a-3p與G3BP2的表達(dá)情況,分析二者與胃癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系,以期為胃癌診斷、治療和改善預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取青海仁濟(jì)醫(yī)院普通外科收治的102例胃癌患者為研究對象,患者男56例,女46例,年齡36-68歲,平均年齡(56.24±11.36)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)數(shù)字化X線胃腸造影和多排螺旋CT掃描等技術(shù)確診為胃癌患者。②入院前未接受過放、化療等抗腫瘤相關(guān)治療。③患者及其家屬知情并簽署自愿協(xié)議書。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并消化出血或嚴(yán)重并發(fā)癥需立即治療者;②術(shù)中發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或腫瘤擴(kuò)散者;③患有嚴(yán)重心、腎等重要器官基礎(chǔ)疾病者。收集胃癌患者臨床病理資料,包括性別、年齡、腫瘤T分期、TNM分期、腫瘤轉(zhuǎn)移情況和組織分化情況。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR法檢測胃癌組織miR-200a-3p和G3BP2 mRNA表達(dá)水平 取胃癌患者胃癌組織標(biāo)本及對應(yīng)距腫瘤組織5 cm以上的癌旁正常組織標(biāo)本,部分標(biāo)本取下后立即放入液氮中速凍10 min,放置-80 ℃冰箱保存用于RNA提取。采用TaKaRa公司的RNAiso Plus試劑盒提取胃癌組織和癌旁正常組織總RNA。按照miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)操作說明將2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,參照SYBR Green PCR master mix(TaKaRa)試劑說明加配反應(yīng)體系。體系總體積20 μl,SYBR Green Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl,上下游引物各0.8 μl,cDNA 2 μl,ROX reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μl,ddH2O 6.0 μl。每個樣品設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。miR-200a-3p以U6為內(nèi)參基因,G3BP2以GAPDH為內(nèi)參基因。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成,引物見表1。體系加配完成后,放入Bio-Rad熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng),程序設(shè)定為:95 ℃ 30 s,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 15 s,共40個循環(huán),72 ℃終延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù),并對所得Ct值進(jìn)行分析,以2-ΔΔCt算法計算miR-200a-3p和G3BP2的相對表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

Table 1 Primer sequences of qRT-PCR

基因正向引物(5′-3′)反向引物(5′-3′)miR-200a-3pGTGCAGGGTCCGAGGTTATCTGTGCGTGTGACAGCGGCTU6ATTGGAACGATACAGAGAAGATTGGAACGCTTCACGAATTTGG3BP2TTCAGCCAAACGACCATCTGCACGAGGGTTTCTGCTTTGCGAPDHCAATGACCCCTTCATTGACCGACAAGCTTCCCGTTCTCAG

1.2.2 免疫組化方法 所有樣本在10%的中性甲醛緩沖液固定24 h,后以常規(guī)蠟質(zhì)包埋,將石蠟樣本切片后以二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化。采用美國GBI公司推出的PV-9000試劑盒進(jìn)行免疫組化實驗,實驗操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3 隨訪

通過復(fù)診或電話對所有患者進(jìn)行為期40月隨訪,隨訪時間自確診之日開始,末次隨訪時間為2018年2月,統(tǒng)計每組患者3年生存率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 胃癌患者miR-200a-3p和G3BP2 mRNA表達(dá)水平分析

與癌旁正常組織相比,胃癌組組織中miR-200a-3p表達(dá)水平降低,G3BP2表達(dá)水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表2)。

2.2 胃癌組織中G3BP2蛋白表達(dá)水平分析

免疫組化結(jié)果顯示G3BP2蛋白位于細(xì)胞核中,染色呈淺黃色、棕黃色(見圖1)。與癌旁正常組織相比,胃癌組織G3BP2蛋白陽性表達(dá)率顯著升高(P<0.05,見表3)。

組別nmiR-200a-3p/U6G3BP2/GAPDH癌旁正常組織1021.03±0.141.02±0.12胃癌組織 1020.42±0.084.37±1.09t 38.20730.583P 0.0000.000

圖1 癌旁正常組織和胃癌組織中G3BP2蛋白表達(dá)情況 (SP法染色,×200)Figure 1 The expression of G3BP2 protein in normal tissues adjacent to cancer and gastric cancer tissues (SP,×200)

表3 胃癌組織中G3BP2蛋白表達(dá)

Table 3 Expression of G3BP2 protein in gastric cancer

組別nG3BP2陽性陰性陽性率(%)χ2P癌旁正常組織102158714.7173.820.021胃癌組織102762674.51

2.3 胃癌組織miR-200a-3p與G3BP2表達(dá)相關(guān)性分析

胃癌組織中miR-200a-3p和G3BP2表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.417,P<0.05,見圖2)。

2.4 胃癌組織miR-200a-3p、G3BP2表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)miR-200a-3p相對表達(dá)(0.89±0.11)將其分為高表達(dá)組共72例,低表達(dá)組共30例;根據(jù)G3BP2相對表達(dá)(2.56±0.48)將其分為高表達(dá)組共34例,低表達(dá)組共68例。miR-200a-3p、G3BP2表達(dá)與組織分化程度和TNM分期水平相關(guān)(P<0.05)。miR-200-3p、G3BP2表達(dá)水平與性別、年齡、T分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05,見表4)。

2.5 胃癌組織miR-200a-3p、G3BP2表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

圖2 胃癌組織中miR-200a-3p與G3BP2表達(dá)的相關(guān)性Figure 2 Correlation between the expression of microRNA-200a-3p and G3BP2 in gastric cancer

Kaplan-Meier法分析結(jié)果顯示,miR-200a-3p低表達(dá)組3年生存率為(23.33%)低于高表達(dá)組3年生存率(37.50%),G3BP2低表達(dá)組3年生存率為(44.12%)高于高表達(dá)組3年生存率(23.51%),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖3)。

表4 胃癌組織miR-200a-3p、G3BP2表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系例(%)

Table 4 Relationship between the expression of microRNA-200a-3p and G3BP2 in gastric cancer tissues and the clinicopathological characteristics of gastric cancer patientscases(%)

臨床病理特征nmiR-200a-3p低表達(dá)(n=30)高表達(dá)(n=72)χ2PG3BP2低表達(dá)(n=68)高表達(dá)(n=34)χ2P性別0.0420.8370.0200.888 男5616403719 女4614323115年齡2.1770.1400.5030.478 <60歲5914454118 ≥60歲4316272716組織分化9.5920.0027.2140.007 高分化4420242321 低分化5810484513T分期0.1710.6800.5000.480 T1-T25818403721 T3-T44412323113TNM分期14.5470.0004.6700.031 Ⅰ-Ⅱ3920192118 Ⅲ-Ⅳ6310534716淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1.3840.2390.2940.587 有5218343022 無5012383834

2.6 影響胃癌患者預(yù)后的危險因素分析

單因素分析顯示,miR-200a-3P、G3BP2表達(dá)、TNM分期、組織分化程度均是影響胃癌患者預(yù)后的危險因素;多因素分析顯示,miR-200a-3p、G3BP2表達(dá)是影響胃癌患者預(yù)后的獨立危險因素(見表5,6)。

3 討論

胃癌是臨床常見惡性腫瘤,在我國發(fā)病率和死亡率較高,據(jù)統(tǒng)計胃癌5年生存率僅為24%-25%[5],是嚴(yán)重危害國民健康的主要疾病。胃癌發(fā)病機制復(fù)雜,地域差異、飲食結(jié)構(gòu)、遺傳因素等均可能誘發(fā)胃癌,且大多數(shù)患者前期無明顯癥狀或癥狀不明顯,患者不夠重視,導(dǎo)致確診的胃癌病例多為進(jìn)展期,嚴(yán)重影響患者治療和術(shù)后生存[6]。隨著分子生物學(xué)迅速發(fā)展,越來越多的研究開始關(guān)注miRNA與胃癌的關(guān)系。miRNA是一種小分子RNA,主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá),參與動植物的生長發(fā)育以及包含腫瘤在內(nèi)的多種疾病進(jìn)程,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、分化、侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[7]。胃癌是常見的惡性腫瘤,推測miRNA在胃癌發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用。因此研究miRNA等在胃癌中的表達(dá)及與臨床癥狀的關(guān)系有重要意義。

表5 影響胃癌患者預(yù)后的單因素分析結(jié)果

Table 5 Univariate analysis of prognostic factors in patients with gastric cancer

臨床病理特征 HR95%置信區(qū)間P性別(男/女)1.4360.547-2.3760.243年齡(<60歲vs≥60歲)1.6720.863-2.1160.217miR-200a-3p(高表達(dá)vs低表達(dá))4.0121.675-8.6370.000G3BP2(高表達(dá)vs低表達(dá))3.9821.543-8.5240.000組織分化(高vs低)3.876 1.458-10.3040.000T分期(T1-T2 vs T3-T4)1.0670.672-3.4700.356TNM分期(Ⅰ-Ⅱ vs Ⅲ-Ⅳ)2.8431.924-4.2010.000淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有vs無)1.8320.976-4.3580.096

表6 影響胃癌患者預(yù)后的多因素分析結(jié)果

Table 6 Multivariate analysis of prognosis in patients with gastric cancer

臨床病理特征 HR95%置信區(qū)間P性別(男/女)1.2170.375-5.7860.341年齡(<60歲vs≥60歲)1.1730.651-4.6830.326miR-200a-3p(高表達(dá)vs低表達(dá))3.2591.513-6.5760.000G3BP2(高表達(dá)vs低表達(dá))3.6731.441-7.3520.000組織分化(高vs低)2.4350.967-5.2150.095T分期(T1-T2 vs T3-T4)1.0620.513-3.3540.375TNM分期(Ⅰ-Ⅱ vs Ⅲ-Ⅳ)2.1150.893-5.0090.125淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有vs無)1.7860.683-4.6700.191

在不同類型的腫瘤中,miRNA的表達(dá)存在很大差異。miR-199a-3p在乳腺癌中下調(diào)表達(dá),通過調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡發(fā)揮抑癌作用[8]。miR-150-5p在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)抑制癌細(xì)胞遷移和侵襲[9]。在同類型腫瘤中,不同miRNA表達(dá)水平也存在差異。miR-199a-3p與ZHX1在胃癌組織中高表達(dá),影響胃癌發(fā)病[10]。miR-145-5p在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)與預(yù)后不良有關(guān)[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌組織miR-200a-3p表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織,表明miR-200a-3p表達(dá)與胃癌發(fā)病有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)與miR-200a-3p同屬于miR-200家族成員的miR-200c在胃癌組織中低表達(dá),與本研究結(jié)果相一致[12]。同時本研究發(fā)現(xiàn)miR-200a-3p表達(dá)與胃癌臨床組織分化程度、T分級和TNM分期顯著相關(guān),進(jìn)一步提示miR-200a-3p影響胃癌發(fā)展。唐峰波等[13]研究報道m(xù)iR-200在家族成員通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程和Wnt/β-catenin信號通路在食管癌、胃癌、胰腺癌、膽管癌等消化道腫瘤中發(fā)揮重要作用。據(jù)此推測miR-200a-3p可能通過上述方式參與胃癌的發(fā)展進(jìn)行。本研究結(jié)果顯示miR-200a-3p不同表達(dá)水平與胃癌臨床病理特征相關(guān)。miR-200a-3p低表達(dá)患者的TNM分期和組織分化程度均顯著增高,表明miR-200a-3p表達(dá)水平與胃癌的發(fā)展有關(guān)。檢測miR-200a-3p表達(dá)水平可以為胃癌TNM分期和胃癌組織分化提供參考。COX回歸分析結(jié)果顯示miR-200a-3p表達(dá)水平是影響胃癌預(yù)后的獨立危險因素,表明miR-200a-3p低表達(dá)有更大可能產(chǎn)生不良預(yù)后。進(jìn)一步證實miR-200a-3p低表達(dá)參與胃癌的發(fā)生和發(fā)展,與不良預(yù)后發(fā)生有關(guān)。

Ras與GTP結(jié)合后才能啟動下游通路,在腫瘤發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究表明Ras-GAP的SH3結(jié)構(gòu)在Ras信號傳導(dǎo)中發(fā)揮著不可或缺的作用。G3BP2是能與Ras-GAP的SH3結(jié)構(gòu)進(jìn)行特異性結(jié)合蛋白[14]。Dou等[15]研究表明G3BP1與肝癌轉(zhuǎn)移有關(guān),可作為肝癌預(yù)后的預(yù)測因子。G3BP2在乳腺腫瘤發(fā)揮著關(guān)鍵作用,且高表達(dá)對乳腺癌患者造成更不好的預(yù)后影響[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌組織G3BP2 mRNA表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織,表明G3BP2與胃癌發(fā)病有關(guān)。免疫組化結(jié)果表明,胃癌組織G3BP2蛋白的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織,與G3BP2 mRNA表達(dá)一致。同時胃癌組織G3BP2表達(dá)陽性率顯著高于癌旁正常組織,表明G3BP2可能參與胃癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞存活。G3BP2表達(dá)水平與組織分化程度和TNM分期有關(guān),提示G3BP2高表達(dá)可能促進(jìn)胃癌組織分化,加快TNM分期進(jìn)程,可能產(chǎn)生不良預(yù)后,與Takayama等[17]對G3BP2在前列癌細(xì)胞生長和存活中作用的研究結(jié)果一致。采用Kaplan-Meier法分析發(fā)現(xiàn)G3BP2高表達(dá)患者總存活率顯著降低,表明胃癌組織中G3BP2高表達(dá),促進(jìn)胃癌發(fā)展,與不良預(yù)后產(chǎn)生有關(guān),與以往研究結(jié)果類似[15]。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,miR-200a-3p表達(dá)水平與G3BP2呈顯著負(fù)相關(guān)。Zhao等[18]研究發(fā)現(xiàn)miR-23b靶向調(diào)控G3BP2基因減輕了糖尿病腎病的纖維化和蛋白尿。本研究推測miR-200a-3p可能通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程和Wnt/β-catenin信號通路負(fù)向調(diào)控G3BP2的表達(dá),影響胃癌發(fā)生、發(fā)展,導(dǎo)致不良預(yù)后。COX回歸分析結(jié)果顯示miR-200a-3p和G3BP2是影響胃癌發(fā)生的獨立危險因素。

綜上所述,胃癌組織中miR-200a-3p表達(dá)下調(diào),G3BP2表達(dá)上調(diào),二者與胃癌發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。臨床檢測miR-200a-3p和G3BP2表達(dá)水平有助于監(jiān)控胃癌患者病情進(jìn)展并有效改善預(yù)后。但是由于本研究納入樣本量較少,且僅僅探討了miR-200a-3p、G3BP2與胃癌病理特征及預(yù)后的關(guān)系,關(guān)于miR-200a-3p與G3BP2在胃癌組織中的具體調(diào)控機制及生物學(xué)行為有待于進(jìn)一步研究。