吳昊，王敏，羅賢強(qiáng)，郭建春，鄭斌嬌，2

（溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325035，1.浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.Attardi線粒體生物醫(yī)學(xué)研究院）

現(xiàn)階段常用于細(xì)胞分離的方法主要有密度梯度離心法、磁珠分離法和流式細(xì)胞分選技術(shù)。密度梯度離心法操作簡單，但分選細(xì)胞效率低；磁珠分離法只能進(jìn)行單因素分離，且會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生免疫刺激或機(jī)械損傷[1]。而流式細(xì)胞術(shù)不但能做到無菌分選，而且可多因素正選或負(fù)選，具有定量、高通量、分選純度高等特點(diǎn)。近年來流式細(xì)胞分選技術(shù)越來越廣泛地應(yīng)用于目的細(xì)胞或粒子的快速分離，如外周血原代單核細(xì)胞、精子、蛋白聚合體、腫瘤細(xì)胞等[2-5]。閔智慧等[6]用不同的噴嘴分選Raji等細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)使用不同的噴嘴對細(xì)胞的得率、活性有影響。黃瑩瑩等[7]使用流式分選技術(shù)分選CD8+T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)流式細(xì)胞技術(shù)分選法較免疫磁珠法效率更高，更能得到高活性細(xì)胞。VOROBJEV等[8]通過評估濾光片的性能對流式分選條件進(jìn)行優(yōu)化，用優(yōu)化后的條件分選受寄生蟲感染的紅細(xì)胞，分選純度比只用普通標(biāo)準(zhǔn)濾光片提高了50%～150%。本研究以J774A.1細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)對象，使用攜帶GFP報(bào)告基因的PX458空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染J774A.1細(xì)胞，以GFP熒光強(qiáng)度、7-AAD進(jìn)行雙因素分選，旨在建立富集PX458 空載轉(zhuǎn)染J774A.1細(xì)胞的最佳方案，確立用于篩選J774A.1細(xì)胞的最佳條件。

1 材料和方法

1.1 材料 BD FACSAria II流式細(xì)胞分選儀（美國BD公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國MD公司）；PX458購自北京普如汀生物技術(shù)有限公司；QuickShuttle-Su perfast購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；7-AAD Viability Staining Solution購自美國Biolegend公司；GFP（D5.1）XP?Rabbit mAb購自美國CST公 司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）購自上海碧云天生物技術(shù)公司；J774A.1細(xì)胞株購自ATCC。

1.2 方法

1.2.1 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：J774A.1細(xì)胞是來源于BALB/cN 小鼠網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤的巨噬細(xì)胞株，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將PX458空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染J774A.1細(xì)胞株，加入10% FBS 1640培養(yǎng)基（不添加青霉素及鏈霉素），置于 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1～2 d傳代1次。

1.2.2 Western blot鑒定：提取細(xì)胞蛋白，恒量上樣蛋白20 μg，并在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳。隨后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜。膜用5%的脫脂奶粉封閉2 h，然后孵育相應(yīng)的一抗[GFP（D5.1）XP?Rabbit mAb]和二抗[辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）]。應(yīng)用ECL顯色系統(tǒng)曝光，檢測蛋白信號(hào)。

1.2.3 細(xì)胞上機(jī)前處理及染色：用胰酶消化細(xì)胞，1 500 r/min，4 ℃離心5 min。使用10% 1640培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)5×106個(gè)細(xì)胞，懸浮于500 μL培養(yǎng)基。加入1 μL 7-AAD后，常溫避光孵育15 min。

1.2.4 流式細(xì)胞儀調(diào)試：BD FACSAria II流式細(xì)胞分選儀以BD FACSDiva Software為操作軟件，以1%無菌PBS為鞘液。開機(jī)后啟動(dòng)液流，選擇合適的噴嘴及相應(yīng)鞘液壓力，再打開主液流，調(diào)節(jié)液滴頻率、振幅。待主液流調(diào)節(jié)至適合且穩(wěn)定的狀態(tài)，選中主液流框的“Sweet Spot”鍵，儀器會(huì)自動(dòng)調(diào)節(jié)液滴頻率、振幅使液流穩(wěn)定在設(shè)定狀態(tài)。打開側(cè)液流高壓，可見分選框內(nèi)出現(xiàn)光斑。配制Accudrop微球，選中“Auto Delay”鍵，使儀器自動(dòng)調(diào)節(jié)液滴延遲時(shí)間，側(cè)液流偏轉(zhuǎn)以99.5%以上為佳。更換分選模式只需在分選開始前，選中分選設(shè)置窗口，依次更換single cell、4-way purity、purity、yield、initial或fine tune模式即可。

1.2.5 流式細(xì)胞分選與分選效率檢測：準(zhǔn)備J774A.1 陰性對照管、GFP陽性管、7-AAD單染管、樣本管4組細(xì)胞樣本。用陰性對照管設(shè)門，進(jìn)行流式分析和分選參數(shù)調(diào)試。將樣本管細(xì)胞上機(jī)進(jìn)行分選，將分選所得的細(xì)胞重新上機(jī)回測分析，測定其GFP陽性率。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)與凍存：分選所得的細(xì)胞以1 500 r/min，4 ℃離心5 min，棄上清。用3 mL 10% FPS 1640細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)至6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)。細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，進(jìn)行凍存，保存于液氮中。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，進(jìn)行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 原代J744A.1細(xì)胞培養(yǎng)鏡下觀察見圖1，細(xì)胞形態(tài)飽滿且貼壁牢固，提示細(xì)胞生長狀態(tài)良好。分選后所得細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，熒光顯微鏡下觀察見圖2，細(xì)胞貼壁良好，GFP陽性率約90%，提示分選所得細(xì)胞可繼續(xù)培養(yǎng)且GFP持續(xù)表達(dá)良好。

2.2 GFP蛋白表達(dá)鑒定 將構(gòu)建的PX458空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的J744A.1細(xì)胞用Western blot進(jìn)行GFP蛋白表達(dá)的定性鑒定。如圖3所示，經(jīng)PX458空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的J774A.1細(xì)胞已攜帶GFP報(bào)告基因，提示構(gòu)建成功。

圖1 原代J774A.1細(xì)胞生長狀態(tài)圖

圖2 經(jīng)PX458空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的J744A.1細(xì)胞培養(yǎng)3 d熒光鏡下圖（×100）

圖3 Western blot定性鑒定GFP蛋白表達(dá)結(jié)果

2.3 主液流調(diào)試 100 μm噴嘴的主液流Gap帶適合位置是液流框的上1/3處，以主液滴各滴形狀規(guī)則，小衛(wèi)星點(diǎn)少于6個(gè)且融入液滴良好為佳（見圖4A）。若Gap帶的位置過低或過高都將引發(fā)衛(wèi)星點(diǎn)及液滴分布異常，導(dǎo)致分選效率降低或無法進(jìn)行分選（見圖4B-D）。

2.4 分選模式與分選純度 分選前，帶GFP的J774A.1細(xì)胞株（GFP陽性細(xì)胞）被分成6大組，每組3個(gè)樣本，經(jīng)單因素方差分析，分選前各組GFP陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.85）。將各大組樣本分選后得到的GFP陽性細(xì)胞重新上機(jī)進(jìn)行回測，得到回測GFP陽性率。經(jīng)單因素方差分析，分選后各組GFP陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。由表中可知，分選回測陽性率最高的分選模式為purity模式，可達(dá)95.7%±1.0%?；販y陽性率達(dá)90%以上的有single cell和fine tune模式，分別為91.0%±0.2%和92.0%±0.4%。見表1和圖5。

3 討論

流式分選技術(shù)是指在流式分析技術(shù)基礎(chǔ)上，快速準(zhǔn)確判斷目標(biāo)細(xì)胞所在的液滴并加以特定電荷，使目標(biāo)細(xì)胞在電場中發(fā)生偏轉(zhuǎn)從而進(jìn)行回收的一種現(xiàn)代細(xì)胞分選技術(shù)。分選后的細(xì)胞能直接用于培養(yǎng)、移植、核酸提取、單細(xì)胞PCR擴(kuò)增或原位雜交等。

圖4 BD FACSAria II流式分選儀主液流調(diào)試

表1 不同分選模式下分選前后GFP陽性率（每組n=3，±s，%）

表1 不同分選模式下分選前后GFP陽性率（每組n=3，±s，%）

分選模式 分選前GFP陽性率 分選后回測GFP陽性率purity 4.0±1.8 95.7±1.0 single cell 3.9±1.4 91.0±0.2 4-way purity 4.1±1.6 86.4±1.1 yield 3.6±1.4 80.0±0.3 initial 5.1±0.2 82.7±1.5 fine tune 4.0±1.4 92.0±0.4 F 0.38 141.11 P 0.85 ＜0.01

流式細(xì)胞分選的關(guān)鍵在于參數(shù)的設(shè)定與調(diào)試。細(xì)胞分選的效率、純度直接受參數(shù)設(shè)定的影響，如果不能很好地掌握儀器的參數(shù)和條件設(shè)置技巧，將會(huì)對細(xì)胞分選的得率、純度和細(xì)胞活性產(chǎn)生較大影響[9]。如儀器的狀態(tài)（包括液流的穩(wěn)定性、激光激發(fā)的程度、激光的穩(wěn)定性），樣品的狀態(tài)（包括樣品的處理方式、樣品的濃度、樣品的質(zhì)量）以及分選時(shí)使用的噴嘴孔徑大小，分選時(shí)選擇的分選模式（BD FACSAria II流式細(xì)胞分選儀可使用single cell、4-way purity、purity、yield、initial和fine tune 6種模式進(jìn)行分選）等[10]。此外，細(xì)胞的流速，熒光蛋白的強(qiáng)度、熒光素的組合也會(huì)影響分選的結(jié)果[5]。

圖5 分選前GFP陽性率及不同分選模式分選后回測GFP陽性率

本研究的實(shí)驗(yàn)對象J774A.1細(xì)胞是來源于BALB/cN 小鼠網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤的巨噬細(xì)胞株，主要用于宿主對病原菌免疫應(yīng)答的研究。PX458是一種攜帶GFP報(bào)告基因的空載質(zhì)粒，將目的基因載入PX458質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染J774A.1細(xì)胞能夠構(gòu)建含有GFP報(bào)告基因的BALB/cN小鼠巨噬細(xì)胞株，篩選之后用于后續(xù)功能研究。目標(biāo)細(xì)胞的富集對后續(xù)的功能研究起著至關(guān)重要的作用。本研究使用BD FACSAria II流式細(xì)胞分選儀70 μm、85 μm和100 μm噴嘴對PX458空載轉(zhuǎn)染的J774A.1細(xì)胞進(jìn)行分選。但選用70 μm和85 μm噴 嘴分選所得細(xì)胞細(xì)胞活力低下，無法存活。可能的原因是噴嘴孔徑太小，鞘液包裹的細(xì)胞經(jīng)過噴嘴孔時(shí)受到擠壓，影響細(xì)胞的正常形態(tài)和生理功能，致使分選后培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)大批量死亡。選用100 μm噴 嘴分選后，細(xì)胞能夠正常存活并傳代。因此本實(shí)驗(yàn)選用100 μm的噴嘴進(jìn)行分選調(diào)試。噴嘴大小也會(huì)影響主液流窗口形狀，選定100 μm噴嘴后，通過調(diào)節(jié)振幅和頻率調(diào)節(jié)主液流形狀，以維持適合分選的液流。若液流調(diào)節(jié)不當(dāng)，則會(huì)導(dǎo)致儀器無法正確抓取目標(biāo)細(xì)胞，大大降低分選的純度。為確保主液流的穩(wěn)定性和連續(xù)性，需把握以下3個(gè)方面：超聲清洗噴嘴避免噴嘴小孔堵塞；保證O圈的密封性，在安裝O圈時(shí)避免大幅上下移動(dòng)；準(zhǔn)確調(diào)整適當(dāng)?shù)恼穹皖l率[11]。

劉錫娟等[12]通過優(yōu)化流式分選相關(guān)參數(shù)，分選SMMC7721細(xì)胞，GFP陽性細(xì)胞群的分選純度達(dá)99.6%。SABATH等[13]用流式分選技術(shù)替代藥物篩選法分離Flp介導(dǎo)的GFP標(biāo)記的重組細(xì)胞，結(jié)果顯示，分選后GFP陽性細(xì)胞的比例比未分選前提高了5～30 倍。在本研究中，6 種分選模式分選效率不同，所得的PX458空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的J774A.1細(xì)胞GFP陽性率從80.0%至95.7%不等，與J774A.1原代細(xì)胞相比，分選所得J774A.1細(xì)胞濃度提高了16～24倍。其中選用purity模式進(jìn)行分選，分選效率最高，可達(dá)到95.7%。但該模式下雖分選純度高，卻會(huì)使得機(jī)器丟棄黏連的目標(biāo)細(xì)胞而導(dǎo)致細(xì)胞得率的下降。而yield模式注重得率，因此會(huì)導(dǎo)致非目標(biāo)細(xì)胞的誤選，分選所得細(xì)胞GFP陽性率相對較低，僅為80.0%。一般來說，細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑闇?zhǔn)，高富集實(shí)驗(yàn)以目標(biāo)細(xì)胞分選純度為指標(biāo)。因此，本研究認(rèn)為，當(dāng)使用100 μm的噴嘴對J774A.1細(xì)胞株進(jìn)行分選時(shí)，以purity模式進(jìn)行分選較合適。

本研究調(diào)試優(yōu)化相關(guān)參數(shù)后，分選所得細(xì)胞陽性率較未分選前提高了16～24 倍，分選純度可達(dá)95.7%，符合后續(xù)功能研究的要求。綜上，本研究通過流式分選技術(shù)，建立了富集PX458空載轉(zhuǎn)染的J774A.1細(xì)胞的新方法，可為流式細(xì)胞分選技術(shù)在其他細(xì)胞的分選應(yīng)用上提供良好的參考。