夏虹，張海月，劉媚娜，李小龍，楊麗紅，王明山

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，浙江 溫州 325015）

遺傳性纖溶酶原缺陷癥是由纖溶酶原（plasminogen，PLG）水平降低引起的全身性疾病。該疾病目前分為2種類型，I型缺陷癥患者PLG抗原和活性同步降低，是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾?。籌I型缺陷癥患者PLG抗原水平正常但活性降低，一般呈常染色體顯性或不完全顯性遺傳[1-2]。本研究通過對(duì)1例PLG缺陷癥患者的家系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室表型與基因突變檢測(cè)，初步探討其發(fā)病的分子遺傳學(xué)機(jī)制。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 先證者，女，23歲，漢族，懷孕1月余，因既往不明原因胎停2次，于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診要求相關(guān)檢查?；颊咦允黾韧陆?jīng)規(guī)律，無血栓史，無其他明顯出血癥狀，無長(zhǎng)期服用藥物史，無肝腎功能異常。否認(rèn)父母近親結(jié)婚及其家系成員血栓出血史，該家系3代共4名成員（見圖1）。收集本院100 名健康對(duì)照者的外周血標(biāo)本做對(duì)照，其中男58名，女42名，年齡（35±12）歲，均無肝腎功能異常，無血栓出血史。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，在知情同意的情況下，對(duì)上述人員采集血樣。

圖1 遺傳性纖溶酶原缺陷癥家系圖

1.2 方法

1.2.1 樣本采集與處理：采集該家系3代4名成員的外周靜脈血2.7 mL，以0.109 mol/L枸櫞酸鈉1:9抗凝，3 000 r/min離心10 min，取上層貧血小板血漿用于凝血指標(biāo)檢測(cè)，下層血細(xì)胞用于提取基因組DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序。

1.2.2 凝血指標(biāo)檢測(cè)：凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）、纖維蛋白原（fibrinogen， FIB）、蛋白S活性（protein S activity，PS:A）采用凝固法檢測(cè)；D-二聚體（D-dimer，D-D）、纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物（fibrinogen degradation product，F(xiàn)DP）采用免疫比濁法檢測(cè)；抗凝血酶活性（antithrombin activity，AT:A）、蛋白C活性（protein C activity，PC:A）、纖溶酶原活性（plasminogen activity，PLG:A）采用發(fā)色底物法檢測(cè)。以上指標(biāo)均在STA-R全自動(dòng)血凝儀上測(cè)定。纖溶酶原抗原（plasminogen antigen，PLG:Ag）采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定。以上所有操作步驟僅遵試劑說明書進(jìn)行。

1.2.3 DNA提取及PCR擴(kuò)增：應(yīng)用非離心柱型基因組DNA提取系統(tǒng)抽提先證者及其家系成員外周血基因組DNA，并用DU800核酸蛋白分析儀檢測(cè)基因組DNA的純度和濃度。參照文獻(xiàn)[3]設(shè)計(jì)合成PCR引物（由上海桑尼生物科技有限公司合成）。

1.2.4 DNA測(cè)序分析：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物割膠回收送上海桑尼生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。用Chromas軟件將測(cè)序所得結(jié)果與美國(guó)NCBI基因庫(kù)公布的PLG基因序列（GenBank AY192161.1）進(jìn)行比對(duì)，尋找基因突變位點(diǎn)，反向測(cè)序予以確認(rèn)。其他家系成員在先證者明確基因突變位點(diǎn)后，再進(jìn)行相應(yīng)突變位點(diǎn)區(qū)域的PCR擴(kuò)增及測(cè)序。

1.2.5 生物信息學(xué)技術(shù)分析：應(yīng)用ClustalX-2.1-win軟件將突變氨基酸進(jìn)行同源物種序列保守性分析；利用PolyPhen-2、PROVEAN、SIFT和Mutation Taster 4 個(gè)生物信息學(xué)軟件在線分析突變氨基酸對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響，參考范圍及解釋如下：Poly-Phen-2：0～1，評(píng)分越接近1，有害突變可能性越大；PROVEAN：分?jǐn)?shù)≤-2.5（有害的），＞-2.5（中性的）；SIFT：0～1，≤0.05表明有害突變，＞0.05表明良性突變；MutationTaster：0～1，分?jǐn)?shù)越接近1，該變異對(duì)蛋白序列的影響越“有害”；運(yùn)用Swiss-Pdb Viewer 4.1.0軟件，基于已知的PLG結(jié)構(gòu)模型，對(duì)突變的蛋白建模進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)室表型檢測(cè)結(jié)果 先證者及其家系成員PT、APTT、TT、FIB、D-D、FDP、PLG:Ag、AT:A、PC:A和PS:A基本在正常范圍內(nèi)，其母親PLG:A正常；先證者和其祖父、父親PLG:A均降低為正常值的50%左右，初步認(rèn)為3人均屬于PLG:Ag水平正常但活性水平低的II型缺陷癥患者，見表1。

2.2 DNA測(cè)序結(jié)果 基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)先證者第15號(hào)外顯子編碼第601位氨基酸的堿基發(fā)生c.1858G＞A雜合錯(cuò)義突變，導(dǎo)致丙氨酸轉(zhuǎn)為蘇氨酸（Ala601Thr），見圖2；其祖父和父親具有同樣的基因突變，均為c.1858G＞A雜合錯(cuò)義突變，家系成員基因型檢測(cè)結(jié)果見圖1和表1。

表1 先證者及其家系成員凝血指標(biāo)及基因突變檢測(cè)結(jié)果

圖2 PLG 基因測(cè)序結(jié)果

2.3 生物信息學(xué)技術(shù)分析結(jié)果

2.3.1 同源序列保守性分析結(jié)果：人類PLG基因與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的其他10個(gè)同源物種的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果顯示Ala601在這11個(gè)物種間高度保守，見圖3。

2.3.2 突變對(duì)蛋白影響力評(píng)估：4 個(gè)在線生物信息學(xué)軟件PolyPhen-2、PROVEAN、SIFT和Mutation Taster分析PLG基因錯(cuò)義突變p.Ala601Thr對(duì)蛋白的影響程度，通過評(píng)分進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，4個(gè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果保持一致。PolyPhen-2評(píng)分結(jié)果為0.989分，預(yù)示此突變很可能是有害突變；PROVEAN評(píng)分結(jié)果為-2.774分，預(yù)示此突變是有害的；SIFT評(píng)分結(jié)果為0分，預(yù)示此突變可影響蛋白質(zhì)的功能；Mutation Taster評(píng)分結(jié)果為0.999分，預(yù)示此突變可引起相應(yīng)疾病。

圖3 PLG 基因同源物種多重序列比對(duì)結(jié)果

2.3.3 蛋白質(zhì)模型分析結(jié)果：在野生型PLG蛋白中，Ala601可與相鄰的Thr600形成2個(gè)氫鍵，與Cys604形成1個(gè)氫鍵（見圖4A）；當(dāng)Ala601突變?yōu)門hr601時(shí)，Thr601分子的側(cè)鏈變長(zhǎng)，空間結(jié)構(gòu)模型分析顯示其延長(zhǎng)的側(cè)鏈與空間折疊的Asp646形成2個(gè)氫鍵，并與His603形成1個(gè)氫鍵，見圖4B。突變前后的氨基酸氫鍵發(fā)生變化。

3 討論

編碼PLG的基因位于人類第6號(hào)染色體長(zhǎng)臂6q26- 6q27位置，長(zhǎng)52.5 kb，包含18個(gè)內(nèi)含子和19個(gè)外顯子，共編碼791個(gè)氨基酸[4]。關(guān)于遺傳性纖溶酶原缺陷癥分子發(fā)病機(jī)制的研究目前仍較少，截至到2018年3月為止，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)已報(bào)道了約75種與PLG缺陷有關(guān)的基因突變。該病例研究在國(guó)內(nèi)較為罕見，在我國(guó)報(bào)道過的該類遺傳性疾病僅有1例[3]。

圖4 Ala601Thr突變蛋白質(zhì)模型分析圖

本研究對(duì)一個(gè)遺傳性纖溶酶原缺陷癥的罕見病例家系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)PLG基因第15號(hào)外顯子存在c.1858G＞A雜合錯(cuò)義突變，導(dǎo)致p.Ala601Thr。該家系的先證者是一名23 歲已婚中國(guó)女性，因既往不明原因胎停2次，經(jīng)生殖中心做試管嬰兒，孕1個(gè)月余，特于門診要求相關(guān)檢查。檢查結(jié)果顯示其PLG:A降低，PLG:Ag水平正常；基因分析發(fā)現(xiàn)其為Ala601Thr突變雜合子。對(duì)其家系成員進(jìn)行檢查，發(fā)現(xiàn)其祖父和父親PLG:A均降低為正常值的50%左右，PLG:Ag含量正常；基因測(cè)序結(jié)果顯示祖孫3人均攜帶Ala601Thr雜合突變。先證者母親凝血各項(xiàng)指標(biāo)正常，PLG:A和PLG:Ag水平也均正常，基因測(cè)序結(jié)果顯示為此突變野生型。由于祖孫三代PLG:A降低，而PLG:Ag水平正常，初步認(rèn)為3人均屬于PLG:Ag水平正常但活性水平降低的II型缺陷癥患者。其父親和祖父既往亦無血栓史，符合常染色體不完全顯性遺傳的方式。

第1 例II型PLG缺陷癥導(dǎo)致血栓形成的病例由AOKI等[5]于1978年報(bào)道，該先證者自15歲腳部挫傷后，不間斷地出現(xiàn)血栓復(fù)發(fā)的癥狀16年有余。第1 例I型PLG缺陷癥導(dǎo)致血栓復(fù)發(fā)形成的病例由 LOTTENBERG等[6]于1985年報(bào)道，該先證者為一名24歲美國(guó)男性，其患有深靜脈血栓和肺動(dòng)脈高壓，PLG:Ag的含量和活性均降低為正常值的30%。大家普遍認(rèn)為這2種PLG缺陷癥的類型與血栓復(fù)發(fā)形成密切相關(guān)[7-10]。本研究先證者孕1個(gè)月余，既往不明原因停胎2 次，此次受孕，B超顯示子宮螺旋動(dòng)脈的血流阻力指數(shù)增高。國(guó)外有研究發(fā)現(xiàn)，在受精卵成功著床后，子宮螺旋動(dòng)脈開始被滋養(yǎng)細(xì)胞不斷侵蝕，進(jìn)而導(dǎo)致管腔擴(kuò)大，隨之子宮動(dòng)脈血流阻力進(jìn)行性降低來滿足妊娠時(shí)期的血氧供應(yīng)[11-12]。特別在早孕時(shí)期，胚胎的發(fā)育依賴于子宮動(dòng)脈的血流灌注，子宮動(dòng)脈血流若灌注不足，即可能導(dǎo)致妊娠期高血壓、胚胎停育等不良妊娠結(jié)局，但是如果異常血流能夠在早期得到糾正，妊娠結(jié)局會(huì)顯著改 善[13]。該先證者為II型PLG缺陷癥，前2 次早孕時(shí)期均處于血栓前高凝狀態(tài)，子宮螺旋動(dòng)脈的血流阻力指數(shù)增高，流速降低，供應(yīng)胎兒血流減少，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣無法滿足胎兒生長(zhǎng)發(fā)育所需，最終導(dǎo)致胎停發(fā)生。此次受孕，積極查找發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的原因后，予以抗栓治療，現(xiàn)已成功保胎亟待分娩。

本研究采用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)p.Ala601Thr突變進(jìn)行進(jìn)一步分析。通過同源物種多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)Ala601在其11個(gè)同源物種間高度保守，說明它是PLG分子一個(gè)重要的功能性位點(diǎn)，在PLG蛋白質(zhì)發(fā)揮正常功能中起著相關(guān)作用。4個(gè)在線生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)軟件分析都表明此突變?yōu)橛泻ν蛔儯谝欢ǔ潭壬夏苡绊懙鞍踪|(zhì)的功能，并引起相應(yīng)疾病，這與保守性分析結(jié)果一致。當(dāng)Ala601被Thr601取代時(shí)，Thr601側(cè)鏈與PLG分子的催化活性位點(diǎn)三聯(lián)體之一的His603形成1個(gè)氫鍵，使His603殘基的電荷分布被擾亂，導(dǎo)致異常PLG不能發(fā)生與正常催化過程相關(guān)的質(zhì)子轉(zhuǎn)移；Thr601側(cè)鏈還與PLG分子的另一個(gè)催化活性位點(diǎn)Asp646形成2個(gè)氫鍵，電荷分布的變化，導(dǎo)致此活性位點(diǎn)的正常折疊受到立體位阻的影響，空間構(gòu)象發(fā)生變化[14]。突變形成的結(jié)構(gòu)及功能異常的蛋白質(zhì)，其催化活性位點(diǎn)His603側(cè)鏈與Asp646側(cè)鏈的性質(zhì)改變，導(dǎo)致酶活性喪失，是此家系成員PLG活性水平降低的主要原因。

綜上所述，本研究通過對(duì)一個(gè)II型遺傳性PLG缺陷癥家系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室表型檢測(cè)和基因突變分析，并運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)其突變基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)先證者家系為國(guó)內(nèi)已報(bào)道過的錯(cuò)義突變p.Ala601Thr 雜合子，而先證者復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的原因可能與此突變引起的PLG活性降低繼而導(dǎo)致的子宮動(dòng)脈血流阻力增加有關(guān)。