楊毅，林曉銘，尹麗慧，尹琪，陸地，單云峰

（1.溫州醫(yī)科大學 教務(wù)處臨床技能實驗教學中心，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 胸外科，浙江 溫州 325015；3.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，浙江 溫州 325015）

食管癌是高侵襲性的惡性腫瘤之一，其導(dǎo)致的腫瘤相關(guān)病死率在世界范圍內(nèi)位列第六[1-3]。中國是食管癌發(fā)病大國，每年全世界約50%的新發(fā)食管癌病例出現(xiàn)在中國，其中約90%為食管鱗癌[4-5]。食管癌的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)是食管癌患者病死的最主要原因，深入研究食管癌的發(fā)病機制以及引起食管癌轉(zhuǎn)移的具體分子機制，可為食管癌的早期診斷和預(yù)后評價提供依據(jù)。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是指一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200個核苷酸的RNA，位于細胞核內(nèi)或胞漿內(nèi)，不參與或很少參與編碼蛋白。研究表明，異常的lncRNAs表達跟多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)[6-10]，已有學者報道，lncRNA的異常表達同樣存在于食管鱗癌中[11-12]。本研究旨在尋找和食管鱗癌發(fā)展進程相關(guān)的lncRNA，為食管鱗癌的診治提供一個可能的生物學靶點。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2008年1月至2013年12月在溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院行手術(shù)切除并經(jīng)病理科確認的95例食管鱗癌患者，其中男73例，女22例；年齡46～78歲，中位年齡62歲。其中6例（3例為無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的I-II期患者，3 例為有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的III期患者）用于lncRNA基因芯片篩選，20例（10例為無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的II期患者，10例為有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的IIb- III期患者）用于初次組織表達qRT-PCR驗證實驗，69例食管鱗癌患者用于進一步驗證。所有病例的腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期依據(jù)2012版美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）標準。食管鱗癌組織和癌旁正常組織（距腫瘤距離＞6 cm）在標本離體30 min內(nèi)獲取，并立即存放于液氮中。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器：lncRNA表達譜芯片（晶芯lncRNA+ mRNA Human Gene Expression Microarray V3.0）購自北京博奧生物公司；TRIzol購自蘇格蘭Life Technologies公司；ReverTra Ace qPCR RT Kit、SYBR Select Master Mix購自日本Takara公司；real time PCR采用ABI7300 system實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）系統(tǒng)；lncRNAs及GAPDH的引物由杭州芯肽生物技術(shù)公司合成。

1.2.2 生物學信息：GSE53624表達譜芯片信息來自NCBI GEO數(shù)據(jù)庫。該芯片含有119例配對的食管鱗癌和癌旁正常組織的表達譜數(shù)據(jù)。編輯R語言代碼從中提取LINC00152的表達數(shù)據(jù)，進行統(tǒng)計分析。

1.2.3 長鏈非編碼RNA表達譜芯片實驗：芯片的標記、雜交及掃描分析過程由北京博奧生物公司完成。

1.2.4 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR：按照說明書，總RNA由TRIzol法（英國Life Technologies公司）進行提取，并用紫外分光光度計（NanoDrop，美國賽默飛世爾科技公司）檢測RNA的純度及濃度；使用PrimeScript RT Master Mix將1.5 μg的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，在-20 ℃保存；在ABI7300 system（美國API公司）系統(tǒng)上，用SYBR Select Master Mix （美國API公司）進行qRT-PCR實驗，GAPDH表達水平作為標準化內(nèi)參；相關(guān)RNA表達水平按照2-ΔΔCt法進行計算。相對表達量用癌組織和癌旁組織的比值表示。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件進行處理，2組間比較采用t檢驗；LINC00152的表達量和臨床特征的關(guān)系采用χ2檢驗或秩和檢驗；采用ROC曲線分析LINC00152判斷食管鱗癌轉(zhuǎn)移發(fā)生的敏感性和特異性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA基因芯片篩選結(jié)果 芯片數(shù)據(jù)均一化后，對6例食管鱗癌轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組的lncRNA相對表達量進行比較，采用倍數(shù)改變2 倍以上且P＜0.05為標準，發(fā)現(xiàn)差異表達的lncRNA為93條，見圖1。接著進一步篩選轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組差異表達5倍以上的lncRNA基本信息，其中表達上調(diào)的lncRNA有6條，表達下調(diào)的lncRNA有4條，見表1。

2.2 10條lncRNA的qRT-PCR驗證 將上述10條lncRNA在20例食管鱗癌標本中經(jīng)qRT-PCR進行驗證，結(jié)果顯示lncRNA相對表達量的趨勢與基因芯片結(jié)果基本一致。2組間10條lncRNA的相對表達量比較結(jié)果顯示，MIR205HG、LINC00152和FOXD2-AS1的相對表達量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而其余7條lncRNA的相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖2。

2.3 3條lncRNA的進一步qRT-PCR驗證 將上述3條lncRNA在69例食管鱗癌患者中進行進一步的表達驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這3條lncRNA相對于癌旁正常組織，在癌組織中呈現(xiàn)與芯片結(jié)果一致的高表達狀態(tài)（P＜0.05），見圖3。

圖1 轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組食管鱗癌lncRNA差異表達的聚類分析結(jié)果

表1 轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組食管鱗癌基因芯片結(jié)果差異表達5倍以上lncRNA基本信息

圖2 差異表達的10條lncRNA在食管鱗癌組織中的qRT-PCR驗證結(jié)果

2.4 3條lncRNA表達水平與臨床特征的關(guān)系 以3條lncRNA的qRT-PCR檢測結(jié)果為基礎(chǔ)，以相對表達量中位值為界點，將樣本分為低表達組及高表達組，結(jié)合患者臨床信息分析3條lncRNA表達水平與臨床特征的關(guān)系。結(jié)果顯示，LINC00152的表達水平與食管鱗癌TMN分期和轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。見表2。

2.5 ROC曲線分析 LINC00152 表達水平評價食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的AUC為0.781（95%CI=0.512～0.824，P=0.032），敏感度為88.4%，特異度為52.3%，約登指數(shù)為0.464，表明LINC00152可能可以用來評價食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，見圖4。

2.6 生存分析 將NCBI GEO數(shù)據(jù)庫GSE53624表達譜芯片中的119例食管鱗癌患者根據(jù)LINC00152相對表達量的中位數(shù)分為低表達組（59例）和高表達組（60例），生存分析結(jié)果顯示，LINC00152高表達組的遠期生存率低（P＜0.05），見圖5。

3 討論

近年來，lncRNA在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用越來越受到關(guān)注，許多研究者已經(jīng)報道了在食管鱗癌組織中異常表達的lncRNA，它們表現(xiàn)為促癌基因或抑癌基因，比如UCA1、HOTAIR、SPRY4-IT1和CBR3-AS1等[8]。這些研究內(nèi)容廣泛，而我們則專注于探索lncRNA和食管鱗癌轉(zhuǎn)移發(fā)生的關(guān)系，旨在能夠發(fā)現(xiàn)和食管鱗癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的lncRNA，為該疾病的診治提供一個全新的生物靶標。

圖3 3條lncRNA在69例食管鱗患者的癌組織和癌旁組織中的進一步表達驗證實驗結(jié)果

表2 3條差異表達lncRNA和食管鱗癌患者臨床特征的關(guān)系（n=69，例）

首先，我們采用lncRNA microarray基因芯片技術(shù)，分別對腫瘤大小無明顯差異的3例食管鱗癌伴區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和3例未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌患者的癌組織和對應(yīng)的癌旁正常組織lncRNA表達水平進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2組間差異表達2倍以上的lncRNA共有93條；進一步統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，2組間差異表達5倍以上，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）的lncRNA共有10條，其中6條lncRNA在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組標本表達5倍以上升高，4條lncRNA表達5倍以上降低；隨后qRT-PCR檢測結(jié)果也證實LINC00152的高表達在組間一致性較好，且與食管鱗癌患者的腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示LINC00152可能在食管鱗癌的轉(zhuǎn)移惡性表型中具有重要作用。

圖4 LINC00152評價食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC曲線

圖5 不同LINC00152表達水平食管鱗癌患者生存分析

我們應(yīng)用ROC曲線分析LINC00152的表達量對判斷食管鱗癌轉(zhuǎn)移的價值，發(fā)現(xiàn)AUC為0.781，敏感度為88.4%，特異度為52.3%，約登指數(shù)為0.464，具有較高的準確性；檢索分析NCBI GEO數(shù)據(jù)庫同樣發(fā)現(xiàn)LINC00152的高表達預(yù)示著較差的遠期生存率。

lncRNA LINC00152位于人類染色體2p11區(qū)，一共由828個堿基構(gòu)成，最初在人肝細胞癌中被發(fā) 現(xiàn)[13]；LINC00152的異常表達已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)和多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，包括胃癌、肝癌、腎癌和肺癌等，被認為是一個重要的致癌基因[14-16]，其具體的作用機制可能包括表觀調(diào)控、調(diào)節(jié)miRNA表達和蛋白質(zhì)相互作用等[17-20]；我們的研究也發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌的轉(zhuǎn)移過程中，LINC00152可能扮演重要角色，但具體機制未明，有待后續(xù)進一步的細胞實驗和分子生物學研究來揭示。

綜上所述，我們認為LINC00152在食管鱗癌中的高表達和腫瘤轉(zhuǎn)移及病理分期有關(guān)，可作為食管鱗癌預(yù)后判斷的一個新型生物標志物；深入研究LINC00152調(diào)控食管鱗癌轉(zhuǎn)移的具體機制，對于食管鱗癌的早期診斷和診療方案的確定具有較高的指導(dǎo)作用。