王海鵬 屈百鳴 張健

肺 動 脈 高 壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）由世界衛(wèi)生組織（WHO）劃分為原發(fā)性肺動脈高壓和繼發(fā)性肺動脈高壓，其中繼發(fā)性肺動脈高壓發(fā)病率較高，是由多種疾病逐漸發(fā)展出現(xiàn)肺血管阻力，右心負(fù)荷升高最終導(dǎo)致右心功能衰竭的一組臨床病理綜合征［1］。繼發(fā)性肺動脈高壓相關(guān)的治療仍是目前醫(yī)學(xué)難點，現(xiàn)多項臨床研究已經(jīng)證實KATP通道參與了血管收縮和重構(gòu)的病理過程，對舒張肺血管效果明顯［2］。缺氧狀態(tài)時KATP通道開放劑能夠顯著提高肺動脈平滑肌細胞上鉀離子通道的活性，對舒張肺血管效果較為明顯［3］。本實驗研究應(yīng)用的尼可地爾屬于煙酰胺類KATP通道開放劑，化學(xué)名硝酸乙氧煙酰胺，其作用機制主要可歸納為使血管平滑肌松弛和血管舒張［4］、改善肺動脈血管的重構(gòu)。作者自2013年1月至2014年12月通過動物實驗探究尼可地爾對肺動脈高壓的療效，將肺動脈壓力測定、超聲評估等方面作為研究重點。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級新西蘭大白兔50只，體重1.6～2.0kg，雌雄不限，兔齡5～6個月，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。RM6240系列多道生理信號采集處理系統(tǒng)（成都儀器廠），全功能心電監(jiān)護儀（spacelabs德國西門子公司），有創(chuàng)動脈血壓壓力換能器（深圳市新世聯(lián)科技有限公司），動靜脈留置針（24G*0.75IN，蘇州碧迪醫(yī)療器械公司），20%氨基甲酸乙酯注射液（烏拉坦）（西安醫(yī)科大學(xué)藥廠生產(chǎn)），尼可地爾片 5mg×100（日本 Tohoku Nipro Pharmaceutical Corporation），光學(xué)顯微鏡（浙江中醫(yī)藥大學(xué)病理實驗室提供）。采用計算機隨機數(shù)發(fā)生器將動物隨機分為3組，分別為普通對照組15只、肺動脈高壓模型組20只和尼可地爾藥物組15只，稱重并記錄。

1.2 實驗方法 （1）兔實驗性肺動脈高壓模型的制作：實驗兔分別固定于活動式立式兔實驗固定臺上，1ml注射器經(jīng)耳緣靜脈建立靜脈通道，實驗每日同一時段重復(fù)注射，連續(xù)28d。①普通對照組：經(jīng)耳緣靜脈緩慢注射生理鹽水，劑量為0.3ml/（kg·10min），注射完畢后觀察15min，確認(rèn)生命體征平穩(wěn)后放回兔籠。②肺動脈高壓模型組：經(jīng)耳緣靜脈緩慢注射空氣團，劑量為0.3ml/（kg·10min），注射完畢后觀察15min，確認(rèn)生命體征平穩(wěn)后放回兔籠。③尼可地爾藥物干預(yù)組：操作同肺動脈高壓組實驗兔。此外，尼可地爾片溶解于生理鹽水后灌胃，劑量為1.15mg/kg，灌胃3次/d，重復(fù)28d，灌胃完畢后觀察15min/次，確認(rèn)生命體征平穩(wěn)后放回兔籠。（2）肺動脈內(nèi)徑及Tei指數(shù)的超聲分析：實驗方法：將實驗兔水合氯醛（2.5ml/kg）灌腸鎮(zhèn)靜，左側(cè)仰臥位四肢固定于木板上，使木板向左傾斜30°，8%硫化鈉溶液均勻涂抹于胸前區(qū)，剃凈胸毛，使用GE公司Vivid 7 Dimension超聲心動圖儀，M3S探頭，頻率1.5～3.5MHz。超聲探頭置于兔胸骨左側(cè)進行測量，獲取心底短軸及心尖四腔切面，測定肺動脈內(nèi)徑（如圖1）。啟用定量組織速度成像模式，取樣點置于右室游離壁三尖瓣環(huán)位置，以TDI的速度脈沖方式顯示三尖瓣環(huán)運動頻譜 ：收縮期s波、舒張早期e波，舒張晚期a波（如圖2），測量右室等容收縮時間（ICT）、等容舒張時間（IRT）及射血時間（ET），計算右室Tei指數(shù)（如圖3）。選擇清晰的圖像保存待以后分析，每只取3個心動周期平均值［5］。Tei=（ICT+IRT）/ET；A：a波終末至下一心動周期e波起始的間期=（A-B）/B；B：a波終末至下一心動周期s波的終止間期（3）兔實驗性肺動脈高壓模型建立及尼可地爾干預(yù)組、正常對照組的肺動脈壓力測量：①實驗動物準(zhǔn)備：兔固定于兔實驗臺上，經(jīng)耳緣靜脈予靜脈留置針建立靜脈通道，肝素封管。用20%烏拉坦溶液經(jīng)耳緣靜脈緩慢注射麻醉，麻醉劑量為5ml/kg。用8%硫化鈉溶液分別于近軀干右上肢、左上肢、右下肢及左下肢皮膚上（各部位面積約3cm×5cm）進行脫毛，胸骨處（面積約5cm×5cm）進行脫毛。切開氣管并插入氣管導(dǎo)管以備接呼吸機用。準(zhǔn)備壓力換能器再連接到多通道生理儀，連接ECG，以監(jiān)測心率，心律。②肺動脈壓力測定：實驗兔胸骨柄左緣第二肋開始切開約2cm手術(shù)切口，依次為皮膚、皮下筋膜、肌肉、肋骨。以120mm小三爪自動牽開器緩慢擴張胸骨切口。暴露切口，不打開心包，彎鉗緩慢剝離甲狀腺，即可定位肺動脈主干，動脈穿刺針穿刺肺動脈并置管，固定后接壓力換能器再連接到多通道生理儀，監(jiān)護儀上可見肺動脈壓力波形（如圖3），穩(wěn)定1～2min后，分別記錄肺動脈的收縮壓、舒張壓和平均壓。③實驗觀察與記錄：多道電生理儀記錄實驗兔肺動脈壓力，應(yīng)用RM6240系列多道生理信號采集處理系統(tǒng)軟件處理并分析實驗動物肺動脈壓力，以區(qū)域測量方法測得肺動脈壓力舒張壓、收縮壓、脈壓差、平均壓。

圖1 超聲心動圖測量肺動脈內(nèi)徑

圖2 多普勒超聲心動圖測量

圖3 肺動脈壓力波形圖

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用 SPSS18.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，三組間Tei值比較采用單因素方差分析，肺動脈內(nèi)徑比較采用t檢驗，肺動脈壓力比較進行兩個獨立樣本Mann-Whitney檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 超聲心動圖評價 超聲測量的各組肺動脈內(nèi)徑值比較見表1。各組ICT、IRT、ET及Tei指數(shù)比較見表2。

表1 各組肺動脈內(nèi)徑值比較（x±s）

表2 各組ICT、IRT、ET及Tei指數(shù)比較（x±s）

2.2 三組肺動脈壓力測定比較 見表3。

表3 三組肺動脈壓力測定比較［mmHg，（x±s）］

3 討論

目前肺動脈高壓的制作模型多應(yīng)用低氧環(huán)境下飼養(yǎng)［6］、野百合堿藥物注射［7］、高血流量外科手術(shù)［5］等方法制作，其中應(yīng)用最為廣泛的是缺氧艙下制作的低氧性肺動脈高壓大鼠模型。本實驗創(chuàng)新性的選擇使用“空氣肺栓塞”的方法建立肺動脈高壓的兔實驗?zāi)Ｐ?。最后測得13只實驗兔的平均壓力為（38.763±7.000）mmHg，相對于正常對照組實驗兔測得肺動脈平均壓（22.413±0.913）mmHg明顯升高約16mmHg，符合肺動脈高壓的肺動脈壓力診斷標(biāo)準(zhǔn)，且通過超聲評價所得出的結(jié)果一致性較強，可得知本實驗中這種新型的“空氣栓塞”法建立肺動脈高壓模型的方法是成功且為可復(fù)制的，為肺動脈高壓治療的研究提供了一種新型的動物模型建立方法。“空氣栓塞”的方法建立肺動脈高壓的動物模型具體生理機制為：空氣在血管中形成小的氣泡通過右心房進入右心室，在右心室被擊碎成極小的氣泡進入肺動脈，在細小的肺動脈中形成栓塞，從而造成了實驗動物的缺氧狀況，持續(xù)一段時間后融入血液，缺氧情況逐漸緩解。而連續(xù)28d的重復(fù)性操作，則會引起肺血管的收縮和重構(gòu)。

新型的“空氣栓塞”肺動脈高壓動物模型較傳統(tǒng)的肺動脈高壓動物模型的優(yōu)點主要包括：（1）簡單經(jīng)濟：此模型制作方法簡單，僅需在耳緣靜脈建立靜脈通道后用空氣團注射即可；且所使用的實驗設(shè)備較少，僅需實驗兔固定臺、一次性注射器和留置針。（2）可復(fù)制性強：本實驗對實驗動物的飼養(yǎng)條件要求較低，且無需建立專門的低氧艙，可以大批量的復(fù)制動物模型。（3）使用動物更廣泛：本實驗可在兔上成功建立模型，為肺動脈高壓的動物模型家族增添新的成員。（4）更接近臨床：注射野百合堿作為最為經(jīng)典的肺動脈高壓模型建立方法被廣泛應(yīng)用，但其主要是野百合堿通過炎癥反應(yīng)損傷肺動脈內(nèi)皮，誘導(dǎo)肺動脈血管重建來建立的接近結(jié)締組織相關(guān)肺動脈高壓發(fā)病機制的動物模型。與臨床上常見的低氧性肺動脈高壓的發(fā)病機制有一定的差異［8］。

當(dāng)然，任何新的事物的出現(xiàn)都是一個從基本逐漸走向完美的過程，本實驗中創(chuàng)新性的建立空氣栓塞肺動脈高壓實驗兔模型優(yōu)點突出，而在具體的操作過程中遇到的困難也不可忽略。在實驗過程中主要的困難包括：（1）操作要求嚴(yán)格：因為每個動物的體質(zhì)差異，在實驗過程中，空氣團注射是較為困難的操作，既要求注射速度適中，也需在動物出現(xiàn)不能耐受的情況下及時停止操作，避免動物的死亡。（2）感染情況：兔肺部嬌嫩，極易出現(xiàn)肺部感染，而空氣的注入則會加大肺部的感染率，且在模型建立后期，因肺動脈高壓導(dǎo)致的右心功能減退，也會出現(xiàn)肺瘀血等癥狀，從而出現(xiàn)肺部感染。在實際操作過程中，有近1/10的實驗兔因肺部感染嚴(yán)重而不能作為模型參與實驗。（3）病死率：空氣注射對注射方法、時間及速度要求嚴(yán)格，否則會出現(xiàn)實驗動物的死亡，在具體的實驗過程中確實出現(xiàn)猝死現(xiàn)象。

目前超聲心動圖作為一項無創(chuàng)檢查技術(shù)為肺動脈高壓的診斷提供了非常重要的依據(jù)，與右心導(dǎo)管檢查有較好的相關(guān)性，其診斷價值已得到廣泛認(rèn)可。超聲心動圖既可以對肺動脈高壓原發(fā)病能做出診斷，也能估測右心房壓力、肺動脈的收縮壓和舒張壓。

在肺動脈壓力測定的操作過程中主要出現(xiàn)的問題有：隨著心臟的搏動，肺動脈導(dǎo)管測得的壓力曲線也會出現(xiàn)相應(yīng)的波動，這對肺動脈壓力測定后的統(tǒng)計造成了一定的難度。在插入動脈留置針時需使用彎鑷輕夾肺動脈壁，是否會造成肺動脈交感興奮收縮從而導(dǎo)致壓力增高及開胸對肺動脈壓的影響仍有待進一步的論證。

本次試驗的對象是新西蘭大白兔，在物種上、實驗動物的數(shù)量，以及實驗?zāi)Ｐ屯R床實際疾病的發(fā)生還是存在一定差異，但實驗結(jié)果顯示了尼可地爾在抗兔肺動脈高壓方面發(fā)揮了積極作用，為進一步的研究打下基礎(chǔ)。