李海霞＊，劉坤璐＊，賈培媛，于衛(wèi)立，武軍華，胡 濤，王 勃，王玉霞，單俊杰

（1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850；2.中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所，北京 100190；3.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021）

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，多糖具有免疫佐劑的作用，與疫苗合用可增強(qiáng)疫苗的免疫效果，促進(jìn)機(jī)體特異性免疫和非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，克服鋁佐劑細(xì)胞免疫弱的缺點(diǎn)。多糖自身具有天然、低毒和無(wú)藥物殘留等優(yōu)點(diǎn)，在安全性方面有良好的優(yōu)勢(shì)，已成為疫苗佐劑研究的一個(gè)熱點(diǎn)［1］。然而，目前報(bào)道的多糖佐劑多為粗多糖，理化性質(zhì)不明確，不僅含多種多糖成分，還含有性質(zhì)未知的非糖成分。因此存在藥效不穩(wěn)定、難以進(jìn)行質(zhì)量控制、作用機(jī)制不清和具有免疫原性等缺陷。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，板藍(lán)根粗多糖具有良好的疫苗佐劑活性［2］，繼而對(duì)該粗多糖進(jìn)行分離和純化。同時(shí)采用H1N1流感滅活疫苗和乙肝疫苗抗原（亞單位蛋白）進(jìn)行活性追蹤和評(píng)價(jià)，最終從粗多糖中分離獲得2個(gè)活性多糖成分，分別為IIP-A-1和IIP-2［3］。IIP-A-1是一種α-（1→4）葡聚糖，分子質(zhì)量為3 600 u。IIP-2 是一種阿拉伯半乳聚糖，分子質(zhì)量66 400 u，阿拉伯糖與半乳糖摩爾比為1∶1.5。研究表明，兩者對(duì)H1N1流感滅活疫苗、乙肝疫苗和狂犬病疫苗均具有顯著佐劑作用，佐劑效果明顯優(yōu)于鋁佐劑［4-6］。 本研究測(cè)定IIP-A-1 和IIP-2 的免疫原性，為其作為疫苗佐劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物、試劑和儀器

BALB/c 小鼠，雌性，6～8 周齡，18～20 g，購(gòu)于軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證編號(hào)SCXK-（軍）2012-0004；大耳白家兔，雌性，體質(zhì)量1.8～2.2 kg，北京金牧陽(yáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司，許可證編號(hào)SCXX（京）2015-0005。IIP-A-1 和IIP-2 為軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所天然藥物化學(xué)研究室制備［3］。辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG（H+L）和N-四甲基聯(lián)苯胺購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；甲型H1N1流感病毒裂解液由北京科興生物制品有限公司生產(chǎn)；口蹄疫病毒滅活疫苗（Aftosa）由蘭州獸醫(yī)研究所提供（生產(chǎn)批號(hào)：H150420J）；乙肝病毒重組亞單位蛋白乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HbsAg）由大連漢信生物制藥有限公司生產(chǎn)；鑰孔血藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和抗小鼠亞類抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；脫脂奶粉為伊利集團(tuán)產(chǎn)品；其余試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Scientific VARIOSKAN FLASH）；洗板機(jī)（美國(guó)Thermo Scientific WELLWASH VERSA）。

1.2 KLH-llP-A-1，KLH-llP-2，BSA-llP-A-1和BSA-llP-2的制備

稱取IIP-A-1 2 mg，溶于20 mmol·L-1醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 5.8）。然后加入高碘酸鈉將IIP-A-1的鄰位羥基氧化成醛基，IIP-A-1和高碘酸鈉的終濃度分別為2 g·L-1和20 mmol·L-1。室溫下避光反應(yīng)20 min 后，加入適量的乙二醇終止反應(yīng)。用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）20 mmol·L-1對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行透析，隨后加入KLH 2 mg和氰基硼氫化鈉1 mg，于4℃反應(yīng)過(guò)夜，得到多糖-蛋白偶聯(lián)物KLH-IIP-A-1。偶聯(lián)物KLH-IIP-2，BSA-IIP-A-1 和BSA-IIP-2 的制備方法與KLH-IIP-A-1相同。

1.3 KLH-llP-A-1和KLH-llP-2聯(lián)用弗氏佐劑免疫方案和抗體檢測(cè)

大耳白家兔9只，分為3組，每組3只，分別皮內(nèi)注射抗原KLH-IIP-A-1 和KLH-IIP-2，劑量為每只300 μg。初次免疫配伍弗氏完全佐劑，免疫后28 d進(jìn)行加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫配伍弗氏不完全佐劑。佐劑與抗原按1∶1 比例（m/m）混合充分乳化，皮內(nèi)多點(diǎn)注射。分別在免疫后14 d耳緣靜脈取血，分離血清，酶聯(lián)反應(yīng)板分別包被KLH 和BSA 及檢測(cè)抗原BSA-IIP-A-1和BSA-IIP-2 5 mg·L-1，用ELISA檢測(cè)KLH，IIP-A-1和IIP-2抗體水平。

1.4 llP-A-1和llP-2單獨(dú)免疫方案和抗體檢測(cè)

BALB/c 小鼠18 只，分為3 組，每組6 只。分別im給予生理鹽水、IIP-A-1和IIP-2。IIP-A-1和IIP-2的劑量為每只小鼠500 μg，生理鹽水為0.1 mL。共免疫3 次，每次間隔28 d。每次免疫后14 d 剪尾采血，分離血清。用BSA-IIP-A-1或BSA-IIP-2 5 mg·L-1包被酶聯(lián)反應(yīng)板，用ELISA測(cè)定血清IIP-A-1和IIP-2抗體水平。

1.5 llP-A-1或llP-2作為HBsAg，H1N1和Aftosa疫苗佐劑的免疫方案和抗體檢測(cè)

參考文獻(xiàn)［7］，以IIP-A-1 作為Aftosa 疫苗佐劑；以IIP-2 分別作為Aftosa，H1N1 和HBsAg 疫苗佐劑，im 免疫。與H1N1 疫苗配伍共免疫3 次，與HBsAg或Aftosa疫苗配伍共免疫2次，每次間隔均為28 d。Aftosa 免疫劑量為每只小鼠2 μg，H1N1為每只小鼠3 μg，HBsAg為每只小鼠2 μg。IIP-A-1和IIP-2 的劑量均為每只小鼠200 μg。免疫后14 d，小鼠斷尾取血50 μL，血清用吐溫-20 的磷酸鹽緩沖液（PBST，pH 7.4）稀釋。分別采用KLH，KLH-IIP-2 或KLH- IIP-A-1（2 mg·L-1）包被酶聯(lián)反應(yīng)板，ELISA 法檢測(cè)免疫小鼠血清中抗IIP-A-1 或IIP-2抗體水平。

1.6 ELlSA檢測(cè)血清抗體水平

小鼠或家兔血清用含0.1% PBST 等比稀釋。相應(yīng)的檢測(cè)抗原均采用抗原包被液（0.05 mol·L-1碳酸鹽緩沖液，pH 9.6）稀釋至終濃度5 mg·L-1包被96 孔板，每孔100 μL，4℃包被過(guò)夜。包被酶聯(lián)反應(yīng)板用PBST 洗板3 次，每孔加入5%脫脂奶粉（PBS 配制）250 μL，37℃封閉1 h。后用PBST 洗滌3 次，加入稀釋的小鼠或家兔血清每孔100 μL，37℃孵育1 h。PBST 洗滌3 次，然后加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 或HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（PBST 1∶1000 稀釋），每孔100 μL，37℃孵育1 h。棄二抗，PBST 洗滌5 次，再加入TMB 底物顯色液，每孔100 μL，室溫避光顯色15 min。每孔加入50 μL 硫酸溶液0.2 mol·L-1終止顯色，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度（A450nm）值。免疫組A450nm≥生理鹽水對(duì)照組A450nm2 倍的結(jié)果為陽(yáng)性［8］。

2 結(jié)果

2.1 KLH-llP-A-1和KLH-llP-2配伍弗氏佐劑免疫家兔血清KLH，llP-A-1和llP-2特異性抗體水平

KLH-IIP-A-1和KLH-IIP-2分別作為免疫抗原，免疫家兔2 次后，ELISA 檢測(cè)家兔血清中抗KLH，IIP-A-1 和IIP-2 抗體水平（圖1）。結(jié)果表明，①以KLH包被酶聯(lián)反應(yīng)板，檢測(cè)出家兔血清中產(chǎn)生高滴度水平的抗KLH 抗體，滴度≥1∶50 000（圖1A1 和B1）；②以BSA 包被酶聯(lián)反應(yīng)板，未檢測(cè)出血清中抗BSA 抗體（圖1A2 和B2）；③以BSA-IIP-A-1 或BSA-IIP-2 包被酶聯(lián)反應(yīng)板，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)血清中能產(chǎn)生較高滴度的抗IIP-A-1 或抗IIP-2 的多糖抗體，抗IIP-A-1抗體滴度≥1∶20 000（圖1A3），抗IIP-2抗體滴度≥1∶100 000（圖1B3）。

2.2 llP-A-1和llP-2單獨(dú)免疫小鼠血清抗llP-A-1和llP-2抗體水平

小鼠分別肌注生理鹽水、IIP-A-1 和IIP-2 進(jìn)行免疫，間隔28 d 免疫1 次，共免疫3 次，免疫劑量均為每只小鼠500 μg。免疫后14 d采用ELISA方法，酶聯(lián)板包被BSA-IIP-A-1或BSA-IIP-2 5 mg·L-1，測(cè)定1∶200稀釋的小鼠血清IgG1和IgM（圖2和圖3）。結(jié)果表明，①3 次免疫后血清抗IIP-A-1 IgG1 和IgM 抗體均為陰性（圖2A 和C）；②初次免疫后14 d，小鼠血清中未檢測(cè)出抗IIP-2 的IgG1抗體，第2次和第3次免疫后血清中IgG1抗體信號(hào)顯著提高（圖2B）。IIP-2初次免疫和加強(qiáng)免疫后IgM 抗體陰性，檢測(cè)信號(hào)低于生理鹽水對(duì)照組（圖2D）。表明IIP-A-1單獨(dú)免疫3次未顯示出免疫原性，而IIP-2加強(qiáng)免疫后產(chǎn)生較高水平的抗IIP-2 IgG1抗體，具有一定的免疫原性。

Fig.1 Serum antibody titers of rabbits immunized with Keyhole limpet hemocyanin-Isatis indigotica polysaccharides（KLH-llP-A-1）（A1，A2 and A3）and KLH-llP-2（B1，B2 and B3）plus Freund adjuvant at 14 d after second immunizations detected by ELlSA.Each rabbit was given KLH-IIP-A-1 or KLH-IIP-2 intradermally at the dose of 300 μg，and 28 d after the first immunization，the booster 300 μg was given.96-well EIA plates were coated with KLH，BSA，BSA-IIP-A-1 and BSA-IIP-2 at a concentration of 5 mg·L-1，respectively.A1 and B1：anti-KLH antibody in serum of rabbits immunized with KLH-IIP-A-1 and KLH-IIP-2，respectively；A2 and B2：anti-BSA antibody in serum of immunized rabbits；A3 and B3：anti-IIP-A-1 or anti-IIP-2 antibodies in serum of immunized rabbits.The titer of each serum sample from immunized rabbits was respectively measured by ELISA.±s，n=3.

圖3結(jié)果顯示，IIP-2注射后小鼠血清中出現(xiàn)抗IIP-2 IgG1抗體，抗小鼠IgG1亞類抗體與BSA 有一定的反應(yīng)本底。因此，本研究包被KLH-IIP-2 測(cè)定了3次免疫后小鼠血清IgG1滴度（T）。與生理鹽水對(duì)照組比較，IIP-2 3次免疫后LgT為3.05±0.16，提示IIP-2免疫后小鼠確實(shí)產(chǎn)生了抗IIP-2的抗體。

Fig.3 Serum lgG antibody titers of mice immunized intramuscularly with llP-2 three times detected by ELlSA.Each mouse was im given IIP-2 500 μg.Four weeks and eight weeks after the first immunization，the booster 500 μg was im given.Anti-IIP-2 IgG1 in mouse serum diluted with PBST was detected at 14 d after the third immunization by ELISA.96-well EIA plates were respectively coated with KLH-IIP-2 or KLH，200 ng per well.±s，n=6.

2.3 llP-A-1或llP-2多糖作為Aftosa疫苗佐劑免疫小鼠血清抗llP-A-1或llP-2抗體水平

IIP-A-1 或IIP-2（每只200 μg）與Aftosa 疫苗（每只2 μg）肌注免疫小鼠2次。第2次免疫后14 d，采用KLH，KLH-IIP-A-1和KLH-IIP-2 2 mg·L-1包被酶聯(lián)反應(yīng)板檢測(cè)血清多糖抗體。ELISA 結(jié)果表明，2 次免疫后小鼠血清中未檢測(cè)到抗IIP-A-1 或IIP-2的IgM抗體（圖略）。小鼠免疫2次后，血清未檢測(cè)到抗IIP-A-1 的IgG1抗體（圖4C），A450nm值與生理鹽水對(duì)照組（圖4A）和Aftosa無(wú)佐劑對(duì)照組（圖4B）無(wú)明顯差異，但在血清中檢測(cè)到抗IIP-2的IgG1（圖4D）。

Fig.4 Serum anti-polysaccharides antibody of mice immunized intramuscularly with Aftosa with llP-A-1 or llP-2 for two times detected by ELlSA.Each mouse was im given Aftosa（2 μg per mice）and IIP-A-1 or IIP-2（200 μg per mice）.Four weeks after the first immunization，the booster again.Anti-IIP-A-1 or anti-IIP-2 IgG1 in mouse serum was detected at 14 d after the second immunization by ELISA.96-well EIA plates were respectively coated with KLH-IIP-2 or KLH 2 mg·L-1.±s，n=6.

2.4 llP-2作為H1N1佐劑免疫小鼠血清抗llP-2抗體水平

H1N1 裂解病毒疫苗（每只3 μg）與IIP-2（每只200 μg）肌注免疫小鼠3次。在第3次免疫后14 d，采用KLH和KLH-IIP-2 2 mg·L-1包被酶聯(lián)反應(yīng)板檢測(cè)血清抗IIP-2抗體。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，小鼠免疫3 次后，血清未檢測(cè)到抗IIP-2 的IgM 抗體（圖略），免疫小鼠血清中檢測(cè)到抗IIP-2的IgG1抗體（圖5）。

Fig.5 Serum anti-llP- 2 lgG1 of mice immunized intramuscularly plus H1N1 with llP- 2 for two times detected by ELlSA.Each mouse was im given H1N1（3 μg）and IIP-2 200 μg.Four weeks after the previous immunization，the booster again.Anti-IIP-2 IgG1 in mouse serum was detected at 14 d after the third immunization.IgG1 against IIP-2 was determined by ELISA.96-well EIA plates were respectively coated with KLHIIP-2 or KLH 2 mg·L-1.±s，n=6.

2.5 llP-2作為HBsAg佐劑免疫小鼠血清抗llP-2抗體水平

HBsAg（每只2 μg）與IIP-2（每只200 μg）肌注免疫小鼠2次。在第2次免疫后14 d，采用KLH和KLH-IIP-2 2 mg·L-1包被酶聯(lián)反應(yīng)板檢測(cè)血清抗IIP-2抗體。ELISA 檢測(cè)結(jié)果表明，小鼠免疫2次后14 d，血清中抗IIP-2 IgG1抗體水平很低，與單獨(dú)HBsAg和生理鹽水組相近，只有在1∶100稀釋時(shí)為弱陽(yáng)性（圖6A）；第2次免疫后90 d，免疫小鼠血清抗IIP-2 IgG1抗體水平仍為弱陽(yáng)性（圖6B）。

Fig.6 Serum lgG1 antibody titers of mice immunized with HBsAg plus llP-2.Each mouse was immunized twice at an interval of 28 d with HBsAg 2 μg plus IIP-2 200 μg.Serum IgG1 antibody titers in mice immunized with saline（A1，B1），HBsAg（A2，B2）or HBsAg plus IIP-2（A3，B3）by intramuscular injections at 14 d（A）and 90 d（B）after second vaccine.IgG1 against IIP-2 was determined by ELISA.96-well EIA plates were respectively coated with KLH-IIP-2 or KLH 2 mg·L-1.±s，n=6.

3 討論

多糖佐劑是高分子活性物質(zhì)，可作為佐劑增強(qiáng)抗原的免疫反應(yīng)。免疫后動(dòng)物體內(nèi)是否產(chǎn)生多糖抗體是評(píng)價(jià)其作為佐劑安全性的關(guān)鍵問(wèn)題。目前認(rèn)為，多糖類成分是T細(xì)胞非依賴性抗原，只能激活B 細(xì)胞產(chǎn)生親和力低的IgM 抗體，幾乎不能發(fā)生類別轉(zhuǎn)換產(chǎn)生IgG 和IgA 等抗體，也不能產(chǎn)生記憶性的T 細(xì)胞和B 細(xì)胞［9-10］。目前單獨(dú)研究多糖免疫原性的報(bào)道較少，一般多見(jiàn)于細(xì)菌多糖疫苗的研究，特別是病原菌莢膜多糖作為疫苗或檢測(cè)試劑，測(cè)定疫苗的特異性抗體水平。由于多糖本身免疫原性弱，特別對(duì)于≤2 歲嬰兒，不能誘生保護(hù)性水平的抗體。因此，病原菌莢膜多糖多與蛋白偶聯(lián)后作為疫苗進(jìn)行免疫，增強(qiáng)抗原的特異性抗體產(chǎn)生［11-12］。

本課題組在前期研究中從中藥茯苓中分離了2個(gè)雜多糖（PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ），發(fā)現(xiàn)它們具有較好的疫苗佐劑活性。PCP-I 的分子質(zhì)量為3.0×105u，PCP-Ⅱ的分子質(zhì)量為2.9×105u，二者均由巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，但單糖摩爾數(shù)不同。發(fā)現(xiàn)茯苓多糖PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ本身免疫原性較弱，免疫后僅產(chǎn)生低水平的IgM，未檢出IgG1抗體［8］。

本研究對(duì)板藍(lán)根多糖IIP-A-1和IIP-2免疫原性進(jìn)行研究。首先，將IIP-A-1和IIP-2分別與KLH偶聯(lián)，將制備KLH-IIP-A-1和KLH-IIP-2完全抗原配伍弗氏佐劑免疫家兔，在家兔血清中檢測(cè)到抗IIP-A-1 和抗IIP-2 抗體，說(shuō)明作為半抗原與載體蛋白連接后，IIP-A-1和IIP-2可產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。

為研究無(wú)載體蛋白存在下IIP-A-1和IIP-2是否有免疫原性，將IIP-A-1和IIP-2單獨(dú)免疫小鼠，結(jié)果在IIP-A-1 免疫小鼠血清中未檢測(cè)到抗IIP-A-1 抗體，在IIP-2免疫小鼠血清中檢測(cè)到IgG1型抗IIP-2抗體。盡管此研究中多糖免疫劑量較高（每只500 mg），免疫小鼠產(chǎn)生抗IIP-2 IgG1這一結(jié)果提示有必要研究IIP-A-1或IIP-2作為免疫佐劑時(shí)是否也會(huì)產(chǎn)生多糖抗體。本研究將IIP-A-1和IIP-2多糖（每只200 mg）分別配伍Aftosa疫苗免疫小鼠，得到與多糖單獨(dú)免疫一致的檢測(cè)結(jié)果，即只有IIP-2多糖作為佐劑免疫的小鼠血清中檢測(cè)到IgG1型抗IIP-2 抗體。為進(jìn)一步驗(yàn)證IIP-2 佐劑的免疫原性，使用IIP-2 佐劑配伍H1N1裂解病毒抗原和HBSAg免疫小鼠，在其血清中均檢測(cè)到IgG1型抗IIP-2抗體。

阿拉伯半乳聚糖廣泛存在于多種植物中，是一類具有較強(qiáng)免疫活性的多糖。國(guó)外有學(xué)者從落葉松樹(shù)皮中分離獲得1 種阿拉伯半乳聚糖，分子質(zhì)量10×106～12×106u，該多糖骨架結(jié)構(gòu)與IIP-2 相似。目前，該阿拉伯半乳聚糖作為佐劑與肺炎疫苗配伍使用，已進(jìn)行了臨床試驗(yàn)。結(jié)果表明，該阿拉伯半乳聚糖能明顯提高疫苗的免疫原性，安全性良好［13］。此外，阿拉伯半乳聚糖已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)作為藥品、膳食纖維和食品添加劑，用于提高NK細(xì)胞殺傷作用，具有較強(qiáng)的抗肝癌和抗轉(zhuǎn)移功效，應(yīng)用過(guò)程中顯示良好的安全性［14］。目前尚未見(jiàn)有關(guān)阿拉伯半乳聚糖抗體方面的報(bào)道。

本研究中板藍(lán)根多糖IIP-A-1 是一種含有少量1→6 分支的α-（1→4）-葡聚糖，IIP-2 是一種阿拉伯半乳聚糖，其分子質(zhì)量為6.6×106u。由此推測(cè)，IIP-2 的強(qiáng)免疫原性可能與其骨架結(jié)構(gòu)與阿拉伯半乳聚糖密切相關(guān)?？傊逅{(lán)根多糖佐劑IIP-A-1抗原性弱，而IIP-2具有一定的免疫原性，IIP-2產(chǎn)生抗體的水平與可能其劑量和配伍抗原的性質(zhì)有關(guān)。由此提示，在IIP-2作為疫苗佐劑的研究和開(kāi)發(fā)過(guò)程中，需要關(guān)注多糖劑量以及IIP-2 本身抗體水平的變化。