劉 昊＊，李新穎＊，羅龍龍，馬遠(yuǎn)方

（1.抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850；軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院 2.毒物藥物研究所，3.軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所，北京 100850；4.河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河南 開封 475004）

免疫應(yīng)答和免疫耐受是機(jī)體清除“異己”識別“自己”的重要生理現(xiàn)象，T 淋巴細(xì)胞作為細(xì)胞免疫重要組成成員，在抗腫瘤、抗感染和治療自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用。在T淋巴細(xì)胞的活化和耐受過程中存在2 類重要的分子，即免疫激活分子〔CD3/CD28，可誘導(dǎo)共刺激分子（inducible costimulator），CD27和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）〕和免疫抑制分子〔程序性細(xì)胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1），淋巴細(xì)胞活化基因3（lymphocyte-activation gene-3，LAG-3），T細(xì)胞免疫球蛋白及黏蛋白分子3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3，TIM-3），T細(xì)胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域蛋白（T cell immunoglobulin and ITIM domain，TIGIT），T 細(xì)胞活化的V 域免疫球蛋白抑制因子（V-domain immunoglobulin suppressor of T-cell activation）和CD276〕，這2類分子在維持機(jī)體免疫應(yīng)答與免疫耐受中發(fā)揮著重要作用，免疫學(xué)家將其形象地描述為免疫系統(tǒng)的“油門”和“剎車”分子。腫瘤在與機(jī)體的免疫系統(tǒng)抗衡的過程中產(chǎn)生了多種“誘騙”機(jī)制，如分泌白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）等免疫抑制因子，以減弱T細(xì)胞的殺傷能力，或通過上調(diào)免疫抑制受體來逃避免疫系統(tǒng)的識別。為了打破腫瘤微環(huán)境的抑制狀態(tài)，研究者利用特異性抗體將免疫抑制的信號通路阻斷，從而解除T淋巴細(xì)胞“失能”狀態(tài)，進(jìn)而增強(qiáng)其殺傷腫瘤細(xì)胞的活性。近年來，這類免疫抑制分子阻斷型抗體藥物如抗細(xì)胞毒T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA4）抗體易普利單抗（Ipilimumab），抗PD-1抗體納武單抗（Nivolumab）和帕博利珠單抗（Pembrolizumab），抗PD-L1 抗體阿替利珠單抗（Atezolizumab）、阿維魯單抗（Avelumab）和度伐魯單抗（Durvalumab）在臨床實(shí)踐中取得了巨大的突破，掀起了腫瘤免疫治療基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的熱潮。LAG-3 作為免疫抑制分子的重要成員，在機(jī)體多種生理和病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本文重點(diǎn)介紹LAG-3 分子的結(jié)構(gòu)、功能及其與自身免疫性疾病、腫瘤、慢性感染性疾病和帕金森病等疾病之間的關(guān)系，并對靶向該分子的抗體藥物在臨床中的應(yīng)用前景予以展望。

1 LAG-3結(jié)構(gòu)和功能

1990年，Triebel 等［1］發(fā)現(xiàn)，在活化的自然殺傷細(xì)胞（natural killer cells，NK）和T 細(xì)胞膜表面存在一類全新的免疫球蛋白超家族分子，并命名為LAG-3 分子，該分子是由498 個(gè)氨基酸組成的Ⅰ型跨膜蛋白。LAG-3 分子基因定位于人12 號染色體（20p13.3）上，與CD4分子基因相鄰，且二者具有相同的外顯子和內(nèi)含子。雖然二者的氨基酸序列同源性只有約20%，但LAG-3 分子與CD4 分子在結(jié)構(gòu)上具有較高的相似性。

LAG-3 分子由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)組成，分子質(zhì)量為70 ku。其中，胞外區(qū)由4個(gè)免疫球蛋白超家族樣結(jié)構(gòu)域（D1～D4）組成。D1 屬于V 系免疫球蛋白超家族，而D2，D3 和D4 屬于C 系免疫球蛋白超家族。D1 區(qū)中含有1 個(gè)富含脯氨酸的環(huán)狀結(jié)構(gòu)（約30個(gè)氨基酸），與主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類分子（major histocompatibility complex Ⅱ，MHCⅡ）特異性結(jié)合。在D1 和D3 結(jié)構(gòu)域以及D2 和D4結(jié)構(gòu)域之間有一些重復(fù)的氨基酸序列，可能是由2個(gè)IgSF 域基因復(fù)制而成的4 個(gè)結(jié)構(gòu)域。與其他免疫抑制分子不同的是，LAG-3胞漿區(qū)不含免疫酪氨酸抑制基序或免疫酪氨酸轉(zhuǎn)換基序。胞漿區(qū)由3部分組成：①絲氨酸磷酸化位點(diǎn)（人LAG-3分子含有2個(gè)絲氨酸，小鼠含有1 個(gè)絲氨酸位點(diǎn)），可作為蛋白激酶C磷酸化的底物；②多個(gè)谷氨酸/脯氨酸（glutamic acid/proline，EP）重復(fù)單元；③保守的KIEELE 基序，所有靈長類動(dòng)物、小鼠和大鼠都具有的保守的KIEELE基序。

研究結(jié)果表明，LAG-3 通過D1 結(jié)構(gòu)域形成二聚體分子，與抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）表面MHC Ⅱ分子特異性結(jié)合［2］。盡管LAG-3 二聚化相對較弱，但二聚化是LAG-3 結(jié)合MHC Ⅱ分子的必要形式。生理狀態(tài)下，LAG-3 能夠被細(xì)胞內(nèi)金屬蛋白酶ADAM10/17切割，在D4結(jié)構(gòu)域近膜區(qū)斷裂，形成可溶性LAG-3 單體，維持細(xì)胞膜上LAG-3 表達(dá)的相對平衡。可溶性LAG-3 與膜表達(dá)LAG-3 分子在免疫信號通路中具有不同的功能。研究表明，血清中高水平的可溶性LAG-3是Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答生物標(biāo)志物［3］。在一組246例轉(zhuǎn)移性激素受體陽性乳腺癌免疫治療臨床試驗(yàn)中，血清中含有可溶性LAG-3 的患者相對于無可溶性LAG-3的患者，在無病生存期以及總生存期上具有更好的預(yù)后表現(xiàn)，提示血清中可溶性LAG-3的表達(dá)有望作為靶向LAG-3 免疫治療的生物標(biāo)志物?？扇苄訪AG-3 與MHCⅡ分子結(jié)合后，可誘導(dǎo)未成熟的樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）胞內(nèi)蛋白磷酸化，從而促進(jìn)DC 成熟，這一特性被用于疫苗的佐劑，有效地增強(qiáng)抗原免疫效果；或直接作為DC成熟的刺激劑，用于抗腫瘤治療。

2 LAG-3分子的配體

2.1 主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類分子

LAG-3 與CD4 分子結(jié)構(gòu)的高度同源性使得MHC Ⅱ類分子同樣也是LAG-3 分子的配體。MHC Ⅱ類分子主要表達(dá)于B 細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞和DC等APC 上，其功能主要是在免疫應(yīng)答的始動(dòng)階段將經(jīng)過處理的抗原片段遞呈給CD4+T細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。LAG-3與MHC Ⅱ類分子的結(jié)合位置位于D1結(jié)構(gòu)域中富含脯氨酸的環(huán)狀結(jié)構(gòu)中。而且LAG-3與MHC Ⅱ類分子的親和力（Kd：60 nmol·L-1）是CD4 分子的100 倍［4］，表明LAG-3分子能夠有效競爭CD4與MHC Ⅱ類分子的結(jié)合，有效抑制T細(xì)胞活化。

有研究表明，人黑色素瘤細(xì)胞同樣表達(dá)MHC Ⅱ類分子，在黑色素瘤浸潤性CD4+T淋巴細(xì)胞表面通常高表達(dá)LAG-3等免疫抑制分子，從而導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中的CD4+T淋巴細(xì)胞失能，該機(jī)制也被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞逃逸免疫系統(tǒng)殺傷的關(guān)鍵因素之一［5］。因此，通過設(shè)計(jì)靶向LAG-3分子的抗體能有效阻斷腫瘤細(xì)胞表面MHCⅡ類分子與CD4+T 細(xì)胞表面LAG-3 分子的結(jié)合，增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中的免疫應(yīng)答，發(fā)揮有效的抗腫瘤活性。

2.2 其他分子配體

在腫瘤微環(huán)境中，LAG-3 分子同樣能夠下調(diào)CD8+T 細(xì)胞的活性。但LAG-3 分子究竟是如何影響不表達(dá)MHCⅡ類分子的CD8+T細(xì)胞的活性？有假設(shè)認(rèn)為可能存在其他LAG-3分子配體（圖1）。進(jìn)一步研究揭示了LAG-3 分子2 個(gè)新配體分子：肝竇內(nèi)皮細(xì)胞凝集素（LSECtin）分子和半乳糖凝集素3（galectin-3）分子。LSECtin 是一類新的C-型凝集素家族糖識別分子，屬于DC-SIGN 家族成員，該分子通常表達(dá)在肝或黑色素瘤細(xì)胞表面，抑制T 細(xì)胞依賴的抗腫瘤活性。在黑色素瘤微環(huán)境中，LSECtin與LAG-3 分子結(jié)合能夠抑制抗原特異性T 細(xì)胞分泌干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ），從而抑制T 細(xì)胞的抗腫瘤活性［6-7］。半乳糖凝集素3 分子屬于凝集素家族成員，該分子參與了細(xì)胞黏附、細(xì)胞生長與分化、細(xì)胞周期與凋亡等重要的生物學(xué)過程。大量研究表明，該分子與癌癥、炎癥、心臟病和腦卒中等疾病均密切相關(guān)。高度糖基化的LAG-3 分子能夠與CD8+T 細(xì)胞活化相關(guān)的半乳糖凝集素3 分子結(jié)合，導(dǎo)致CD8+T 細(xì)胞分泌IFN-γ 受到抑制，從而減弱CD8+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答［8-9］。

3 LAG-3免疫抑制的分子機(jī)制

通常，LAG-3 表達(dá)在活化的T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞表面，維持免疫應(yīng)答穩(wěn)態(tài)，防止免疫反應(yīng)過激或自身免疫性疾病的發(fā)生。與PD-1 分子相似，LAG-3分子在T細(xì)胞活化24 h后便能檢測到，并且在48 h后達(dá)到峰值。而在腫瘤微環(huán)境或慢性感染性疾病中，持續(xù)的T細(xì)胞活化會共表達(dá)免疫抑制性分子，如LAG-3，PD-1，TIM-3，TIGIT和CD160等，導(dǎo)致T細(xì)胞失能甚至凋亡，這是腫瘤和慢性感染性疾病逃逸免疫系統(tǒng)殺傷的“誘騙性機(jī)制”。

與PD-1及其他免疫抑制分子不同的是，LAG-3具有獨(dú)特的胞漿結(jié)構(gòu)域，含有一個(gè)獨(dú)特的EP 重復(fù)單元基序。早期研究表明，LAG-3相關(guān)蛋白可能與LAG-3 結(jié)合，介導(dǎo)LAG-3 分子與CD3，CD4 或CD8共定位形成免疫突觸，并產(chǎn)生共刺激信號［10］。盡管最初認(rèn)為EP重復(fù)單元是LAG-3下游信號的關(guān)鍵基序，但是突變結(jié)果顯示，該結(jié)構(gòu)域并不是LAG-3 發(fā)揮功能的關(guān)鍵位置［11］。LAG-3分子中KIEELE基序在多個(gè)物種中保守，缺乏KIEELE 結(jié)構(gòu)域的LAG-3分子不能正常產(chǎn)生對T 細(xì)胞的抑制作用，預(yù)示該基序可能與LAG-3 下游抑制信號密切相關(guān)［12］。但目前LAG-3下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制仍然不清楚。

4 LAG-3生物學(xué)功能

4.1 LAG-3分子在調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)中的作用

免疫抑制性受體分子對于維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)起著重要的作用。T 淋巴細(xì)胞活化到一定程度時(shí)，免疫抑制性分子如LAG-3，CTLA-4和PD-1表達(dá)上調(diào)，維持免疫應(yīng)答處于穩(wěn)態(tài)。在空間上，LAG-3 分子表達(dá)于CD4+T，CD8+T和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）等淋巴細(xì)胞表面，與CD4+T細(xì)胞活化第一信號軸“CD3-TCR-MHCⅡ”中MHCⅡ分子特異性結(jié)合，一方面阻斷T細(xì)胞活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，另一方面LAG-3 分子胞內(nèi)段產(chǎn)生免疫抑制信號下調(diào)CD4+T細(xì)胞活性［13］。同樣，也有研究表明，LAG-3分子能夠促進(jìn)Treg細(xì)胞分化，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子5下游信號，從而增強(qiáng)Treg細(xì)胞的抑制作用［14］。因此，LAG-3分子在調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

在多個(gè)自身免疫疾病動(dòng)物模型中，LAG-3基因阻斷或缺失將加速自身免疫疾病的進(jìn)展。如在非肥胖型糖尿病小鼠模型中，缺失LAG-3基因的小鼠糖尿病的發(fā)病進(jìn)程加速。小鼠胰島細(xì)胞周圍浸潤性CD4+T 和CD8+T 細(xì)胞明顯增加，加速破壞胰島細(xì)胞，最終小鼠100%產(chǎn)生糖尿?。?5］。在汞誘導(dǎo)的自身免疫小鼠模型中，注射抗LAG-3抗體能增強(qiáng)自身抗體的分泌和外周血IgE 水平；而在LAG-3基因缺失小鼠模型中，汞誘導(dǎo)產(chǎn)生大量IL-6，IL-4和IFN-γ，加速自身免疫疾病的發(fā)生［16］。LAG-3 分子還與其他免疫抑制分子共同參與免疫穩(wěn)態(tài)和自身免疫疾病的發(fā)生，在PD-1和LAG-3基因敲除C57BL/6 小鼠實(shí)驗(yàn)中，LAG-3-/-PD-1-/-小鼠快速進(jìn)展為多器官自身免疫細(xì)胞浸潤性損傷，并最終導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生致死性自身免疫性疾病。而LAG-3-/-或PD-1-/-單基因敲除小鼠并沒有導(dǎo)致小鼠死亡。而且，LAG-3-/-PD-1-/-小鼠移植瘤模型中，腫瘤消退的速度明顯快于LAG-3-/-或者PD-1-/-單基因敲除小鼠。預(yù)示LAG-3和PD-1分子在維持自身免疫穩(wěn)態(tài)以及誘導(dǎo)自身免疫性疾病中有較明顯的協(xié)同作用，為腫瘤的聯(lián)合治療提供明確的治療思路［17］。

4.2 LAG-3在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用

在許多腫瘤患者樣品中，腫瘤微環(huán)境中淋巴細(xì)胞LAG-3 表達(dá)上調(diào)或者與其他免疫檢查點(diǎn)分子如PD-1，TIM-3 和CTLA-4 等共表達(dá)是腫瘤逃逸免疫殺傷和監(jiān)視的重要分子機(jī)制。例如，在卵巢癌中，腫瘤浸潤的紐約食管鱗狀細(xì)胞癌1抗原（NY-ESO-1）特異性CD8+T細(xì)胞表達(dá)高水平的PD-1和LAG-3，產(chǎn)生IFN-γ 和TNF-α 的能力降低，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞耗竭。同時(shí)阻斷上述2 種免疫抑制通路顯著改善CD8+T 細(xì)胞增殖及IFN-γ 和TNF-α 細(xì)胞因子產(chǎn)生［18］。同樣，與外周血淋巴細(xì)胞上的表達(dá)相比，從黑色素瘤轉(zhuǎn)移患者中分離的黑色素瘤抗原特異性T細(xì)胞在LAG-3 及其他免疫檢查點(diǎn)分子CTLA-4 和TIM-3 表達(dá)明顯上調(diào)［19］。在結(jié)腸癌中，與微衛(wèi)星穩(wěn)定性腫瘤相比，LAG-3 及其他免疫檢查點(diǎn)分子如PD-1、CTLA-4 和吲哚胺2，3-雙加氧酶在微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability）腫瘤中表達(dá)較高。因此，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性腫瘤患者更易從免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療中獲益［20］。

早期研究表明，LAG-3抗體單用治療腫瘤效果不佳，而LAG-3 抗體與PD-1 抗體聯(lián)合使用具有更好的抑瘤效果［17，21-22］。近年來研究表明，在多種類型的腫瘤免疫微環(huán)境或耐藥患者中，PD-1和LAG-3分子具有共表達(dá)現(xiàn)象［23］。在3種不同的小鼠移植瘤模型中，LAG-3和PD-1在腫瘤浸潤C(jī)D4+T和CD8+T細(xì)胞上共表達(dá)，并且阻斷這2種通路對CD8+T抗腫瘤細(xì)胞應(yīng)答具有協(xié)同效應(yīng)［17］。同樣，在卵巢癌患者抗原特異性CD8+T 細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)LAG-3 和PD-1 的共表達(dá)，兩者的共阻斷導(dǎo)致細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子大量表達(dá)［24］。也有研究表明，三陰性乳腺癌組織中高水平的LAG-3 和PD-L1 共表達(dá)預(yù)示預(yù)后不良。因此，利用不同的LAG-3抗體和PD-1抗體聯(lián)合治療多種實(shí)體瘤的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行。2017年歐洲臨床腫瘤學(xué)協(xié)會（European Society for Medical Oncology）上，美國百時(shí)美施貴寶（Bristol-Myers Squibb，BMS）公司公布了1項(xiàng)黑色素瘤1/2a期臨床研究結(jié)果（臨床試驗(yàn)注冊號NCT01968109），對于PD-1抗體治療無效的黑色素瘤患者，納武單抗（抗PD-1 抗體）和Relatlimab（抗LAG-3抗體）聯(lián)合治療的客觀緩解率（objective response rate，ORR）為16%，疾病控制率為45%，且聯(lián)合治療在安全性方面與納武單抗單藥相似。

治療性疫苗，特別是DC疫苗，是一種誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的治療策略。DC 和T 細(xì)胞的相互作用依賴于受體-配體相互作用以及各種免疫檢查點(diǎn)的參與。研究者試圖研究成熟DC 刺激T 細(xì)胞后阻斷PD-1，HVEM，CD244，TIM-3 和LAG-3 對T 細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子的分泌。研究結(jié)果顯示，相較于阻斷其他免疫檢查點(diǎn)而言，阻斷LAG-3能夠更好地激活CD4+T和CD8+T細(xì)胞增殖并分泌大量的IFN-γ，這種效應(yīng)甚至優(yōu)于對PD-1/PD-L1的阻斷效果［25］。因此，DC 疫苗聯(lián)合LAG-3 阻斷劑將成為一種潛在的免疫聯(lián)合治療方法。

與淋巴細(xì)胞膜表面LAG-3分子截然不同的是，可溶性LAG-3 分子可以作為一種免疫增強(qiáng)劑刺激免疫系統(tǒng)。IMP321 是一種LAG-3 融合蛋白藥物，該藥由LAG-3 胞外段4 個(gè)結(jié)構(gòu)域與人IgG1的恒定區(qū)Fc形成融合蛋白LAG-3-Ig。機(jī)制上，LAG-3-Ig分子能夠特異性結(jié)合APC（如DC）表面MHCⅡ類分子，誘導(dǎo)細(xì)胞CD80/86 分子表達(dá)上調(diào)，同時(shí)表達(dá)IL-12和TNF-α等細(xì)胞因子，促進(jìn)DC成熟。成熟的DC 通過抗原遞呈活化初始型T 細(xì)胞并驅(qū)動(dòng)免疫反應(yīng)向Th1型免疫應(yīng)答偏移，從而增強(qiáng)特異性抗腫瘤細(xì)胞免疫［26］。

4.3 LAG-3在慢性病毒感染中的作用

慢性病毒感染通常導(dǎo)致T細(xì)胞衰竭。T細(xì)胞衰竭的分子機(jī)制雖仍未完全闡明，但多種抑制分子表達(dá)上調(diào)是T 細(xì)胞衰竭的重要因素之一。Blackburn等［27］研究發(fā)現(xiàn)，CD8+T細(xì)胞的衰竭受多種抑制性受體的負(fù)性調(diào)控，且T 細(xì)胞的衰竭程度與體內(nèi)病毒感染的滴度呈正相關(guān)。在淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒感染小鼠模型中，利用抗體共阻斷PD-1 和LAG-3，可協(xié)同增強(qiáng)T 細(xì)胞反應(yīng)并降低小鼠體內(nèi)病毒載量。在結(jié)核病中，可溶性LAG-3在暴露于細(xì)菌的健康人和具有良好預(yù)后的結(jié)核病患者中均升高，表明可溶性LAG-3可調(diào)節(jié)結(jié)核分枝桿菌中的抗細(xì)菌免疫應(yīng)答［28］。T細(xì)胞在人類免疫缺陷病毒1（human immunodeficiency virus-1，HIV-1）感染期間出現(xiàn)功能缺陷，部分原因是PD-1 和CTLA-4 的上調(diào)。然而，LAG-3 在HIV 感染中同樣扮演著重要的角色。研究表明，在HIV 感染期間，外周血和淋巴結(jié)中LAG-3表達(dá)顯著增加，且LAG-3在CD4+T和CD8+T細(xì)胞表達(dá)水平與疾病進(jìn)展成正相關(guān)。而體外阻斷LAG-3，HIV 特異性CD4+T 和CD8+T 細(xì)胞應(yīng)答顯著增強(qiáng)。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)，LAG-3和PD-1在不同的T 細(xì)胞亞群中共同表達(dá)［29］。LAG-3 分子對于HIV 感染患者的先天免疫系統(tǒng)具有抑制效應(yīng)。在HIV 感染患者中，恒定自然殺傷T 細(xì)胞（invariant natural killer T，iNKT）細(xì)胞因子產(chǎn)生模式發(fā)生改變，而LAG-3 的表達(dá)與iNKT 功能障礙密切相關(guān)。在治療期間，LAG-3的持續(xù)表達(dá)會導(dǎo)致先天免疫重建障礙。因此，靶向LAG-3通路可輔助重建HIV感染患者的先天免疫系統(tǒng)功能［30］。上述研究表明，LAG-3分子在HIV慢性感染中發(fā)揮重要的作用。因此，LAG-3是HIV感染患者免疫重建的重要靶標(biāo)，而且同時(shí)阻斷LAG-3和PD-1通路能夠協(xié)同增強(qiáng)T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。

4.4 LAG-3有望成為帕金森病的治療靶點(diǎn)

近期報(bào)道，LAG-3 分子與帕金森病密切相關(guān)。帕金森病的進(jìn)展伴隨著錯(cuò)誤折疊的α突觸核蛋白聚集體在腦細(xì)胞之間的擴(kuò)散，誘導(dǎo)正常的α 突觸核蛋白發(fā)生聚集，從專司運(yùn)動(dòng)和基本功能的“低級”腦結(jié)構(gòu)移動(dòng)到與記憶和思考有關(guān)的“高級”腦區(qū)域。正常情況下，α 突觸核蛋白聚集體無法進(jìn)入細(xì)胞。因此，α 突觸核蛋白聚集體在細(xì)胞間的傳遞必然依賴細(xì)胞膜外表面轉(zhuǎn)膜受體的參與。研究人員從352種跨膜蛋白中篩選出α突觸核蛋白聚集體的受體分子LAG-3，并證明了該分子是介導(dǎo)α 突觸核蛋白聚集體在腦細(xì)胞之間擴(kuò)散的“橋梁”分子，用抗體阻斷培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞上的LAG-3 分子能夠有效抑制α突觸核蛋白聚集體向細(xì)胞內(nèi)傳遞。因此，靶向LAG-3分子有望成為帕金森病的治療靶點(diǎn)［31］。

5 LAG-3抗體藥物臨床應(yīng)用研究

5.1 LAG-3抗體藥物研發(fā)格局

目前有7 種LAG-3 抗體藥物進(jìn)入臨床研究階段，包括美國MacroGenics公司的MGD013（PD-1/LAG-3雙特異性抗體）、美國Tesaro公司的TSR-033、美國BMS 公司的Relatlimab（研發(fā)代碼為BMS-986016，最初由Medarex 公司開發(fā)）、英國葛蘭素史克公司的GSK2831781、瑞士諾華公司的LAG525、德國默克公司的MK-4280 以及美國再生元公司的REGN3767。在臨床研究中，絕大多數(shù)是將LAG-3抗體與PD-1抗體進(jìn)行聯(lián)合用藥治療多種血液瘤和實(shí)體瘤（表1）。

在這些在研項(xiàng)目中，百時(shí)美施貴寶的Relatlimab進(jìn)展最快，目前已開展了10 個(gè)臨床研究，絕大多數(shù)是以Relatlimab 與納武單抗進(jìn)行聯(lián)合用藥，用于治療血液瘤、黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、腎細(xì)胞癌和非小細(xì)胞肺癌等腫瘤。在1 項(xiàng)實(shí)體瘤臨床試驗(yàn)中，Relatlimab與納武單抗聯(lián)用治療黑色素瘤，腫瘤周圍免疫細(xì)胞中表達(dá)LAG-3 的患者對Relatlimab和納武單抗組合療法的ORR 為18%，而浸潤性淋巴細(xì)胞LAG-3 表達(dá)水平低于1%的患者的ORR 僅為5%。這一結(jié)果確認(rèn)了Relatlimab 與納武單抗的組合對攜帶表達(dá)LAG-3 免疫細(xì)胞的腫瘤患者具有更優(yōu)的治療效果。同時(shí)，Relatlimab 與納武單抗組合療法的安全性與納武單抗單一療法的安全性相似。除此之外，葛蘭素史克、諾華、再生元和默克等大公司的LAG-3抗體也相繼進(jìn)入臨床研究階段，且均采用與PD-1抗體聯(lián)合用藥的臨床開發(fā)策略。值得一提的是，葛蘭素史克開發(fā)的GSK2831781恒定區(qū)選用IgG1結(jié)構(gòu)，同時(shí)采用巖藻糖工程改造哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)，試圖通過增強(qiáng)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性效應(yīng)殺死表達(dá)LAG-3的免疫細(xì)胞，治療自身免疫性疾病。目前，該抗體藥物處于Ⅰ期臨床，用于治療斑塊型銀屑病。澳大利亞Prima BioMed 公司的IMP761 是LAG-3 激活型抗體，在自身免疫患者中，抗體能夠下調(diào)自身免疫反應(yīng)的LAG-3+T細(xì)胞活性，防止炎癥反應(yīng)和組織損傷。

在PD-1和LAG-3雙特異性抗體開發(fā)方面，美國MacroGenics 和英國F-star 生物技術(shù)公司顯示了獨(dú)特的的研發(fā)策略。MacroGenics 公司利用雙親和重新定位（dual-affinity re-targeting）平臺研發(fā)出同時(shí)與PD-1和LAG-3分子特異性結(jié)合的四價(jià)雙功能抗體分子。初步非臨床研究數(shù)據(jù)表明，MGD013的體內(nèi)外生物學(xué)活性明顯優(yōu)于納武單抗（抗PD-1）和25F7（抗LAG-3）單藥，在激活T細(xì)胞方面更是優(yōu)于2種抗體聯(lián)用，目前該藥物已處于Ⅰ期臨床階段，用于治療惡性腫瘤。英國生物技術(shù)公司F-star則采用獨(dú)特的抗體研發(fā)平臺，在抗體的恒定區(qū)Fc端引入全新LAG-3抗原結(jié)合位點(diǎn)（Fcab），同時(shí)抗體的可變區(qū)識別PD-L1 抗原。這種巧妙的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)在保證抗體“Y”字型結(jié)構(gòu)不變的情況下，在Fc端引入另一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)成三價(jià)結(jié)構(gòu)的雙功能抗體。非臨床研究數(shù)據(jù)顯示，該藥物分子的體外抑瘤效果優(yōu)于2種單抗聯(lián)用。

表1 國外LAG-3分子抗體藥物及其與抗PD-1/PD-L1抗體臨床聯(lián)合應(yīng)用的研究概況

相對于國外制藥公司火熱推進(jìn)LAG-3 抗體藥物臨床研發(fā)來說，國內(nèi)公司仍然處于“跟跑”或“模仿”階段?？紤]到LAG-3 抗體和PD-1 抗體臨床上的協(xié)同治療效果，國內(nèi)不少企業(yè)已經(jīng)開始布局LAG-3抗體藥物的開發(fā)，不過目前仍處于分子發(fā)現(xiàn)和非臨床研究階段。

5.2 LAG-3融合蛋白

澳大利亞Prima BioMed 公司的候選藥物分子IMP321最初作為乙肝疫苗的佐劑。隨著腫瘤免疫療法的火熱進(jìn)行，IMP321逐漸轉(zhuǎn)向腫瘤治療領(lǐng)域，作為抗腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞的激活劑。結(jié)構(gòu)上，該藥由LAG-3 胞外段4 個(gè)結(jié)構(gòu)域與人IgG1的恒定區(qū)Fc形成融合蛋白LAG-3-Ig。機(jī)制上，LAG-3分子能夠特異性結(jié)合APC（如DC）表面MHCⅡ分子，誘導(dǎo)細(xì)胞CD80/86分子表達(dá)上調(diào)，同時(shí)表達(dá)IL-12和TNF-α等細(xì)胞因子，促進(jìn)DC 發(fā)生形態(tài)改變并經(jīng)歷細(xì)胞成熟，成熟的DC 通過抗原遞呈能夠活化初始型T 細(xì)胞并驅(qū)動(dòng)免疫反應(yīng)偏向Th1型免疫應(yīng)答，最終增強(qiáng)特異性抗腫瘤細(xì)胞免疫［32］。

在1 項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)中（臨床試驗(yàn)注冊號NCT00349934），IMP321 聯(lián)合紫杉醇用于治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌。與以往紫杉醇單藥治療相比，紫杉醇聯(lián)合高劑量IMP321 的患者中產(chǎn)生了更強(qiáng)、更持久的免疫應(yīng)答，且患者血清中初級靶細(xì)胞和次級靶細(xì)胞的生物學(xué)表型在治療前后有明顯的表型差別。APC（DC 和單核細(xì)胞）MHCⅡ類分子表達(dá)上調(diào)，且活化的APC 具有更長的持續(xù)效應(yīng)（至少3 個(gè)月）。二級靶細(xì)胞如NK 和CD8+T 細(xì)胞在體內(nèi)的比例有所增加，50%患者產(chǎn)生了主動(dòng)應(yīng)答，腫瘤體積縮小。治療6個(gè)月后，相比紫杉醇單藥治療，90%患者產(chǎn)生積極的臨床意義。基于Ⅰ期臨床的試驗(yàn)結(jié)果，Prima BioMed 公司開展了多中心、隨機(jī)雙盲Ⅱ期臨床試驗(yàn)（臨床試驗(yàn)注冊號NCT0261483）。招募211 例激素受體陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌，按照1∶1 比例分為紫杉醇+IMP321組和紫杉醇+安慰劑組。試驗(yàn)過程中以無進(jìn)展生存期（progress free survival）作為主要終點(diǎn)，并監(jiān)控腫瘤浸潤免疫細(xì)胞活化狀態(tài)以及腫瘤細(xì)胞的分子表達(dá)譜。

盡管PD-1/PD-L1拮抗劑在臨床上取得了巨大的突破，但不可否認(rèn)的是，PD-1/PD-L1拮抗劑對一般實(shí)體瘤單藥有效性只有15%～20%，因此衍生出多種免疫組合療法，旨在提高患者的應(yīng)答效率。近期開展的一項(xiàng)針對黑色素瘤的Ⅰ期臨床試驗(yàn)（臨床試驗(yàn)注冊號NCT02676869），采用IMP321 聯(lián)合帕博利珠單抗的治療策略，旨在活化APC的同時(shí)釋放免疫檢查點(diǎn)“剎車”分子PD-1，從而增強(qiáng)腫瘤免疫應(yīng)答，提高帕博利珠單抗單藥治療的主觀應(yīng)答率。初步結(jié)果顯示，在帕博利珠單抗單藥治療無應(yīng)答或弱應(yīng)答患者中，IMP321+帕博利珠單抗聯(lián)合治療組中，58%患者腫瘤體積縮小，表明IMP321 作為APC活化分子，與免疫檢查點(diǎn)抑制劑帕博利珠單抗具有良好的協(xié)同效應(yīng)。2013年，國內(nèi)藥企億騰醫(yī)藥引進(jìn)IMP321中國區(qū)權(quán)益；2017年7月，億騰醫(yī)藥聯(lián)合藥明生物進(jìn)行臨床申報(bào)，采用IMP321 與化療藥物聯(lián)合用藥增強(qiáng)化療藥物的治療效果。

6 展望

LAG-3 分子作為一類重要的免疫負(fù)性調(diào)節(jié)分子，參與了自身免疫病、慢性感染性疾病、腫瘤甚至神經(jīng)退變性疾病的發(fā)生發(fā)展。目前，多種臨床試驗(yàn)采用LAG-3 抗體單用或與PD-1 抗體聯(lián)合用藥，已取得了一定的療效。然而，仍有許多重要問題亟需解決。①LAG-3 下游信號通路如何調(diào)控淋巴細(xì)胞的功能抑制？②LAG-3 不同配體的作用機(jī)制以及各配體之間是否存在結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)性？③如何理解可溶性LAG-3 能夠增強(qiáng)免疫效應(yīng)功能而膜表達(dá)的LAG-3 分子卻抑制淋巴細(xì)胞活化？④LAG-3與PD-1協(xié)同作用的分子機(jī)制是什么？與其他免疫檢查點(diǎn)是否同樣存在協(xié)同作用？解決這些關(guān)鍵問題將更全面地了解LAG-3的生物學(xué)功能，有助于優(yōu)化LAG-3靶向治療策略，提高疾病的治療效果。