許 暢，俞晨晨，李 樺，宋遠(yuǎn)見，車津晶

（1.徐州醫(yī)科大學(xué)遺傳學(xué)教研室，江蘇 徐州 221004；2.抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850；3.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，北京 100850）

舒芬太尼（sufentanil，SFTN）是特異性μ 阿片受體激動劑，廣泛用于麻醉的誘導(dǎo)、維持和術(shù)后鎮(zhèn)痛［1］，但劑量過大時可引起呼吸抑制等副作用。右美托咪啶（dexmedetomidine，DEM）為新型高選擇性α2腎上腺素能受體激動劑，主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)及其他器官組織，產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、利尿和抑制交感神經(jīng)活動的效應(yīng)［2］，且可減輕患者的術(shù)中疼痛，減少患者因應(yīng)激反應(yīng)造成的損傷以及生理和心理傷害［3］。SFTN 與DEM 聯(lián)合應(yīng)用已廣泛應(yīng)用于臨床術(shù)后鎮(zhèn)痛，如脊柱矯正術(shù)［4］、喉切除術(shù)［5］、腹腔鏡手術(shù)［6］、神經(jīng)外科手術(shù)［7］、小兒牙科鎮(zhèn)靜［8］、剖腹產(chǎn)［9］和子宮切除術(shù)等［10］。但是目前兩藥聯(lián)合應(yīng)用時的血漿動力學(xué)、鎮(zhèn)靜效應(yīng)和呼吸抑制毒性等尚不清楚。為此，本研究評價大鼠兩藥單用和聯(lián)合應(yīng)用的藥動學(xué)、鎮(zhèn)靜效應(yīng)和呼吸毒性，分析兩藥的藥-藥相互作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、藥品、試劑和儀器

雄性SD大鼠，SPF級，體質(zhì)量180～220 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號：SCXK（京）2016-0006；動物在室溫環(huán)境飼養(yǎng)，每籠5 只，每12 h 日夜交替，日光燈照明，自由飲食。SFTN，本研究所藥物合成室，純度≥99%［11］；DEM，濟(jì)南德信佳生物科技有限公司（批號201122），純度≥98%；鹽酸普萘洛爾購于美國Sigma（批號BCBB9359V），純度≥98%；甲醇和乙腈（色譜純），美國Fisher 公司；甲酸，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜（島津公司，8060型），配備CAPCELL PAK mgⅡC18 色譜柱（日本資生堂公司，2.0 mm×50 mm，3 μm）。

1.2 LC-MS/MS定量檢測方法的建立

色譜條件：CAPCELL PAK mgⅡC18 色譜柱（2.0 mm×50 mm，3 μm），流動相A 為含0.1%甲酸的純水，流動相B為含0.1%甲酸的乙腈。梯度洗脫程序：10→10% B（0～0.5 min），10→70% B（0.5～1.5 min），70→70% B（1.5～2.2 min），70→10% B（2.2～2.3 min）；柱溫30℃；進(jìn)樣體積1 μL；流速0.4 mL·min-1；運(yùn)行時間4.3 min。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI）正離子模式、多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式進(jìn)行質(zhì)譜檢測。質(zhì)譜參數(shù)：毛細(xì)管溫度350℃，毛細(xì)管電壓4000 V，干燥氣流速10.1 L·min-1，霧化電壓35 psi。SFTN 檢測離子對m/z 387.10～238.10，碰撞電壓21 V；DEM 檢測離子對m/z 201.10～95.15，碰撞電壓21 V。

SFTN和DEM在定量范圍（0.1～100 μg·L-1）內(nèi)線性良好（線性相關(guān)系數(shù)R2＞0.99），定量下限為0.1 μg·L-1，在0.2，10 和80 μg·L-13 個濃度下的批內(nèi)和批間相對標(biāo)準(zhǔn)差均＜8%，準(zhǔn)確度均在±20%內(nèi)，且提取回收率均＞90%，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明該方法滿足實(shí)驗(yàn)需求。

1.3 大鼠SFTN和DEM血漿藥動學(xué)測定

雄性SD大鼠15只，隨機(jī)分為3組（每組5只），即SFTN 組（20.0 μg·kg-1），DEM 組（25.2 μg·kg-1）和SFTN+DEM 組（SFTN 20.0 μg·kg-1，DEM 25.2 μg·kg-1），給藥劑量根據(jù)前期藥效學(xué)和毒理學(xué)研究結(jié)果確定［11］。大鼠尾靜脈給藥后2，5，15，30 min 和1，2，4，6 和8 h 取血，肝素抗凝，離心（5 000×g，4℃）分離血漿，-20℃凍存待測。取50 μL 血漿，加入150 μL 內(nèi)標(biāo)工作液（propranolol 100 μg·L-1）沉淀蛋白，渦旋振蕩2 min 后高速離心（13 500×g，4℃）10 min，取上清5 μL，按1.2 進(jìn)樣LC-MS/MS 檢測，每個分析批用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，并加入質(zhì)控樣品，對分析結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控。

1.4 SFTN和DEM大鼠腦組織分布

雄性SD 大鼠75 只，隨機(jī)分為SFTN 組、DEM組和SFTN+DEM 組，劑量同1.3，分別于5，15，30，60和120 min取血和腦組織樣品（n=5）。腦組織樣品用預(yù)冷的生理鹽水沖洗，稱重后置于-20℃冰箱保存待測。血漿樣品處理方法同1.3。生理鹽水沖洗腦組織樣品，濾紙吸去多余水分后稱量，并加入2倍生理鹽水制成組織勻漿，處理方法同1.3。

1.5 大鼠翻正反射實(shí)驗(yàn)

雄性SD大鼠15只，按1.3隨機(jī)分為3組并靜注給藥，給藥后立即記錄翻正反射消失（loss of righting reflex，LORR）的誘導(dǎo)和持續(xù)時間［12］，觀察藥物的中樞鎮(zhèn)靜作用。

1.6 大鼠呼吸參數(shù)測定

雄性SD 大鼠15 只，隨機(jī)分為SFTN 組、DEM組和SFTN+DEM 組，劑量同1.3，每組5 只。采用清醒大鼠肺功能檢測儀，按前期確定的實(shí)驗(yàn)方案測定大鼠呼吸功能參數(shù)［12］，即分鐘通氣量（minute ventilation，MV）、每分鐘呼吸頻率（breathing rate per minute，BPM）、吸氣時長（inspiration time，IT）和呼氣時長（expiration time，ET）。檢測條件：氣泵流量1.5 L·min-1，增益放大1倍，傳感器放大200倍，采樣率500 Hz。實(shí)驗(yàn)時，先將清醒大鼠放入檢測儀至少30 min以適應(yīng)環(huán)境并穩(wěn)定狀態(tài)，待其各項(xiàng)呼吸參數(shù)基線值穩(wěn)定且有效波形≥90%時，記錄呼吸參數(shù)基線值。隨后，取出大鼠給藥，立即放回檢測儀，再持續(xù)測定60 min。

測定大鼠適應(yīng)后0～5，5～15和15～30 min 時間段的呼吸參數(shù)，取均值為大鼠呼吸基線值。按組別分 別 給 藥 后 測 定0～5，5～15，15～30，30～45 和45～60 min 時間段的呼吸參數(shù)，計(jì)算各呼吸參數(shù)的變化率。變化率（%）=（給藥后測定值-基線值）/基線值×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用WinNonLin 7.0（Pharsight Inc.，USA）軟件的非房室模型分析，得藥動學(xué)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，通過SAS 軟件進(jìn)行獨(dú)立t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SFTN和DEM大鼠血漿藥動學(xué)

大鼠分別尾靜脈給藥后，定時采集血樣，得SFTN 藥-時曲線（圖1）和藥動學(xué)參數(shù)（表1）以及DEM 藥-時曲線（圖2）和藥動學(xué)參數(shù)（表2）。DEM組和SFTN+DEM 組藥動學(xué)參數(shù)無顯著差異。SFTN+DEM 組SFTN 血藥峰濃度Cmax為（15.9±9.4）μg·L-1，低于SFTN 組（22.2±2.6）μg·L-1，但統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)無顯著性差異；SFTN+DEM 組SFTN 的AUC（0-8h）值為（5.5±1.5）μg·h·L-1，顯著低于SFTN組（8.5±1.6）μg·h·L-1（P＜0.05），t1/2為（1.22±0.13）h，顯著快于SFTN 組（2.13±0.69）h（P＜0.05）。提示兩藥聯(lián)合應(yīng)用對SFTN 的藥動學(xué)有一定影響，主要表現(xiàn)為SFTN血漿暴露降低，末端消除加快。

Fig.1 Plasma concentration-time profiles of sufentanil（SFTN）in male rats after being iv given SFTN 20.0 μg·kg-1 or co-administered with dexmedetomidine（DEM）25.2 μg·kg-1.±s，n=5.

Tab.1 Pharmacokinetic parameters of SFTN in male rats

2.2 SFTN和DEM大鼠腦分布

Fig.2 Plasma concentration-time profiles of DEM in male rats after being iv given DEM 25.2 μg·kg-1 or coadministered with SFTN 20.0 μg·kg-1.±s，n=5.

Tab.2 Pharmacokinetic parameters of DEM

大鼠尾靜脈給藥后，不同時間點(diǎn)測定血和腦藥物濃度，得到SFTN和DEM的血漿和腦組織濃度及腦/血濃度比值（表3 和表4）。SFTN 在SFTN 和DEM+SFTN 組基于Cmax與AUC 的腦/血濃度比值均＜1，DEM 在DEM 和SFTN+DEM 組基于Cmax與AUC 的腦/血濃度比值均＞1；SFTN+DEM組SFTN的腦/血濃漿Cmax比值為0.49，是SFTN單藥組（0.45）的1.3倍；SFTN+DEM 組DEM 的腦/血漿Cmax比值為16.9，是DEM 組（1.42）的12倍。表明DEM 比SFTN 更易于分布進(jìn)入腦組織，與SFTN 聯(lián)合應(yīng)用可顯著提高DEM的腦組織暴露水平。

2.3 SFTN和DEM合用對大鼠的鎮(zhèn)靜作用

SFTN，DEM 和SFTN+DEM 組大鼠LORR 誘導(dǎo)時間分別為0.39±0.04，0.93±0.15 和（0.33±0.02）min（n=5），SFTN+DEM 組與DEM 組相比顯著縮短（P＜0.01）。由圖3 可見，SFTN+DEM 組的LORR 持續(xù)時間與SFTN 組和DEM 組相比均顯著延長（P＜0.01）。SFTN 組出現(xiàn)典型的木僵狀態(tài)，全身僵硬，尾巴呈“旗桿樣”豎立，但在DEM和SFTN+DEM 組均未出現(xiàn)此癥狀，表明DEM 有助于緩解SFTN 造成的木僵狀態(tài)。根據(jù)CompuSyn1.0 軟件進(jìn)行藥物聯(lián)合作用分析，兩藥聯(lián)合指數(shù)（combination index，CI）為0.522（CI＜1 為協(xié)同效應(yīng)）。結(jié)果表明，兩藥聯(lián)合應(yīng)用具有顯著協(xié)同鎮(zhèn)靜作用。

Tab.3 Unbound brain-to-plasma ratio of SFTN in male rats

Tab.4 Unbound brain-to-plasma ratio of DEM in male rats

Fig.3 Duration of loss of righting reflex（LORR）in male rats after being single iv given SFTN 20.0 μg·kg-1 or DEM 25.2 μg·kg-1 or both SFTN and DEM.±s，n=5.＊＊P＜0.01，compared with SFTN group；##P＜0.01，compared with DEM group.

2.4 SFTN和DEM聯(lián)合應(yīng)用對大鼠的呼吸抑制毒性

由圖4 所示，SFTN 對大鼠呼吸功能抑制最為顯著，給藥后5 min MV 和BPM 快速下降，同時IT和ET 快速增高（P＜0.05），呈現(xiàn)快速的呼吸抑制作用，15 min 后各個呼吸參數(shù)開始逐漸恢復(fù)，呈現(xiàn)快速啟動、較快恢復(fù)的模式，與芬太尼（fentanyl）相似［12］。DEM對呼吸的抑制作用弱于SFTN，0～5 min期間未見呼吸功能的顯著改變，15 min 時MV 快速下降，60 min 時MV 為（-60.3±9.8）%。SFTN 與DEM 聯(lián)合應(yīng)用時對大鼠呼吸功能抑制程度與SFTN 組相比未進(jìn)一步加重，但抑制作用的時間相對于SFTN組有一定的延長（P＜0.05，P＜0.01）。提示SFTN 與DEM 聯(lián)合應(yīng)用時SFTN 在呼吸抑制快速啟動和抑制程度上起主導(dǎo)作用，而呼吸功能的恢復(fù)減慢，則可能與DEM相關(guān)。

Fig.4 Respiratory functions of male rats injected with SFTN，DEM or both SFTN and DEM.See Fig.3 for the rat treatment.A：minute ventilation（MV）；B：breathing rate per minute（BPM）；C：inspiratory time（IT）；D：expiratory time（ET）.Change rate（%）=（measured value after drug administration-baseline value）/baseline value×100%.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with SFTN group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with DEM group.

3 討論

SFTN 起效快，鎮(zhèn)痛效果強(qiáng)，持續(xù)時間長，是較為理想的術(shù)后患者自控靜脈鎮(zhèn)痛藥物，但劑量較大時可引起呼吸抑制及惡心嘔吐［13］。DEM 通過藍(lán)斑核中的去甲腎上腺素能神經(jīng)超極化而產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮及交感神經(jīng)抑制作用且易被喚醒［14］。SFTN 是特異性μ 阿片受體激動劑，其鎮(zhèn)痛機(jī)制包括抑制位于傳入神經(jīng)末梢的阿片受體所介導(dǎo)的神經(jīng)遞質(zhì)釋放、拮抗外源性神經(jīng)遞質(zhì)對中間神經(jīng)元突觸后抑制及對脊丘束上傳神經(jīng)元抑制等［15］。DEM為α2 腎上腺素能受體激動劑，也是細(xì)胞色素P450酶的強(qiáng)抑制劑，可抑制芬太尼類藥物的肝微粒體代謝［16］。另外研究發(fā)現(xiàn)，μ阿片受體和α2腎上腺素能活性存在密切關(guān)系［17］，這些可能是兩藥存在密切相互作用的原因。

本研究結(jié)果顯示，SFTN 和DEM 聯(lián)合應(yīng)用對SFTN 的血漿AUC 和末端消除半衰期有一定的影響，但對DEM 的血漿濃度和藥動學(xué)參數(shù)無顯著影響。SFTN與DEM聯(lián)合應(yīng)用時DEM的腦組織暴露水平顯著提高，提示合用SFTN 有助于提高DEM的腦組織暴露。大鼠翻正反射實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持藥動學(xué)的發(fā)現(xiàn)，兩藥聯(lián)合應(yīng)用時LORR誘導(dǎo)時間顯著縮短，持續(xù)時間明顯延長，表明兩藥聯(lián)合應(yīng)用既能快速發(fā)揮鎮(zhèn)靜作用，又可延長維持時間。兩藥的作用靶點(diǎn)不同，聯(lián)合應(yīng)用時可產(chǎn)生協(xié)同的鎮(zhèn)靜作用，有利于術(shù)后患者鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛。

在呼吸毒性方面，SFTN 的呼吸抑制作用起效快，恢復(fù)快。而DEM 引起的大鼠呼吸抑制作用起效較慢，持續(xù)時間長。SFTN與DEM聯(lián)合應(yīng)用時的呼吸抑制作用啟動較快，但抑制程度與SFTN 單用相比并未加重，由于DEM 對大鼠呼吸功能抑制持續(xù)時間較長，聯(lián)合應(yīng)用時使得呼吸功能抑制持續(xù)時間較長，恢復(fù)較慢。因此，臨床應(yīng)用時，需要關(guān)注SFTN和DEM聯(lián)合應(yīng)用對藥效和呼吸毒性的影響，必要時調(diào)整劑量，以保證用藥的有效和安全。