尉春雪，蘇浩天，張曉宇，何文菡，鄭大檉，尹淑霞

（北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，北京 100083）

草坪作為城市綠地的重要組成部分，在城市生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。與其他植物相比，草坪由于定期修剪，使得病原菌更易侵染，因此草坪病害發(fā)生更嚴(yán)重、更普遍。提高草坪抗病性也是草坪科學(xué)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

褐斑病是草坪的一種重要土傳真菌病害，也是所有草坪病害中分布最廣的病害之一[1]。該病幾乎能侵染所有已知的草坪草品種，具有病原物復(fù)雜、發(fā)病率高、傳染迅速、危害嚴(yán)重和反復(fù)發(fā)病等特點(diǎn)，在整個(gè)北京地區(qū)冷季型草坪上普遍發(fā)生，發(fā)病率高達(dá)80%以上[2]。

水楊酸(salicylic acid，SA)是非生物源植物抗病激活劑，能誘導(dǎo)多種植物對多種真菌、細(xì)菌及病毒病害產(chǎn)生抗性，且具有高效、廣譜、對環(huán)境無害、使用簡單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，在植物抗病反應(yīng)中起著非常重要的作用[3]。有研究表明，SA可誘導(dǎo)苜蓿(Medicago sativa)對霜霉病產(chǎn)生抗性[4]，誘導(dǎo)水稻(Oryza sativa)幼苗抗稻瘟病[5]和白葉枯病[6]，誘導(dǎo)高羊茅(Festuca arundinacea)抗彎孢霉葉斑病[7]，誘導(dǎo)黃瓜(Cucumis sativus)抗霜霉病[8]、誘導(dǎo)玉米(Zea mays)抗大斑病[9]，誘導(dǎo)月季(Rosa chinensis)抗黑斑病[10]，誘導(dǎo)匍匐翦股穎(Agrostis stolonifera)抗鐮刀菌枯萎病[11]，誘導(dǎo)車前(Plantago asiatica)抗菌核病[12]，誘導(dǎo)蘋果(Malus pumila)抗斑點(diǎn)落葉病[13]等。在草坪草中，外源噴施水楊酸的研究多集中于其對草坪草耐鹽、抗旱、耐熱等逆境脅迫的效果，對其誘導(dǎo)草坪草抗病性的研究還很少。

草地早熟禾(Poa pratensis)是我國北方地區(qū)應(yīng)用最廣泛的草坪草種之一，具有耐寒、青綠期長、坪觀質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)。因立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)侵染引起的褐斑病是草地早熟禾的重要病害之一，該病常造成草坪坪觀質(zhì)量下降甚至草坪枯死[14]。研究表明，植物在與病原物共同進(jìn)化過程中，主要形成了被動(dòng)和主動(dòng)兩類抗病類型，其中主動(dòng)抗病型主要是通過分子抗病物質(zhì)來實(shí)現(xiàn)。Guo等[15]研究表明C3H型鋅指蛋白在煙草(Nicotiana tobacum)對立枯絲核菌抗性中起正調(diào)控作用。殷萍萍[16]研究得出結(jié)縷草(Zoysia japonica)CPI基因能抑制立枯絲核菌體內(nèi)蛋白酶，從而抑制其生長；富亮氨酸重復(fù)受體蛋白激酶(LRR-RLKs)基因編碼的LRR蛋白可直接或間接識別病菌效應(yīng)子，激活相應(yīng)的防衛(wèi)反應(yīng)。

本研究通過對草地早熟禾施用外源SA，并接種立枯絲核菌，觀察其誘導(dǎo)草地早熟禾抗褐斑病的效果，檢測相關(guān)抗病基因表達(dá)情況，探討外源SA對草地早熟禾褐斑病誘抗效果及分子調(diào)控機(jī)理，為防治草地早熟禾褐斑病及草坪草抗病育種提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

在北京林業(yè)大學(xué)草坪試驗(yàn)站選取健康、成熟的草地早熟禾品種午夜 (Poa pratensis‘Midnight’)的草皮(草坪草高度4 cm，所用土壤為壤土且養(yǎng)分充足，建植1 a)，2017年6月10日移栽到40盆直徑約15 cm的花盆中，室外培養(yǎng)，每天進(jìn)行澆水，9月中旬施過一次復(fù)合肥。

水楊酸SA由天津市光復(fù)精細(xì)化研究所生產(chǎn)，立枯絲核菌由北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所提供，植物總RNA提取試劑盒購于E.Z.N.A公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司，熒光定量用UltraSYBR Mixture試劑盒購于CWBIO公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 噴施SA與接種處理

先通過預(yù)試驗(yàn)確定外源SA對午夜褐斑病的最佳誘抗?jié)舛葹?.05 mmol·L-1。而后挑選健康、生長一致的早熟禾12盆。設(shè)3個(gè)處理：A處理為每盆噴施 0.05 mmol·L-1SA 30 mL 并在 3 d 后接種立枯絲核菌(SA+接菌)；B處理是每盆噴等量清水并在3 d后與A組一起接種立枯絲核菌(僅接菌)；C處理是與A組同時(shí)外施SA，但不進(jìn)行接菌處理(僅SA處理)。每處理4次重復(fù)，而后置于保鮮袋中封口進(jìn)行保濕(相對濕度70%)培養(yǎng)24 h。

1.2.2 立枯絲核菌接種方法

將儲存于本實(shí)驗(yàn)室的立枯絲核菌菌絲體與高溫滅菌的高羊茅種子在密閉的培養(yǎng)瓶中共培養(yǎng)3周，待立枯絲核菌侵染了高羊茅種子后，將種子以30 g·m-2的量均勻撒在盆栽的草地早熟禾草坪上進(jìn)行接種。接種在SA噴施3 d后進(jìn)行，A、B處理接種等量的感菌種子，C處理不接種。而后將草坪草置于人工氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)，晝夜溫度為35 ℃/25 ℃，光暗時(shí)間 16 h∶8 h，相對濕度 70%。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 誘導(dǎo)抗病效果觀察

接種后每天觀察草坪草發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病植株數(shù)量，每盆隨機(jī)挑選20個(gè)葉片，按照病葉等級分級標(biāo)準(zhǔn)[17]，根據(jù)感病面積分為5級，未感病記為0，感病面積1%～20%為1級，21%～40%為2級，41%～60%為3級，61%～80%為4級，81%～100%為5級。按照如下公式計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和誘抗效果。

發(fā)病率 = (發(fā)病植株數(shù) / 總株數(shù)) × 100%；

病情指數(shù) = 100 × ∑(各級病葉數(shù) × 各級代表值) /(調(diào)查總?cè)~數(shù) × 最高級代表值)；

誘抗效果 = (B處理病情指數(shù)-A處理病情指數(shù)) /B 處理病情指數(shù) × 100%。[18]

1.3.2 抗病基因表達(dá)量檢測

在SA噴施前(T0)和噴施后第1天(T1)、第3天即病原菌接種前(T2)、病菌接種后第3天(T3)、第4天(T4)、第5天(T5)，分別取樣并提取葉片組織總RNA，檢測抗病相關(guān)基因PR1、NPR1表達(dá)量的變化。具體為提取各樣品總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，方法參照反轉(zhuǎn)錄說明書(北京全式金生物技術(shù)有限公司，Code:AT-311)，獲得cDNA第一鏈后將其用ddH2O稀釋至 80～100 ng·μL-1置于-20 ℃ 冰箱保存，供下一步熒光定量反應(yīng)使用。熒光定量反應(yīng)中內(nèi)參基因選用草地早熟禾18S基因，待測抗病基因選用草地早 熟禾PR1和NPR1基因，通過 Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異PCR引物，得到18S、PR1、NPR1上下游引物，3組引物序列如表1所列。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

熒光定量反應(yīng)方法參照熒光定量說明書(CWBIO，Code: CW0957M)。反應(yīng)體系為 2x Ultra-SYBR Mix 10 μL，F(xiàn)orward Primer與 Reverse Primer各 1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL，共 20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 預(yù)變性 10 min；95 ℃ 變性 10 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸 32 s，重復(fù) 40 個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析與數(shù)據(jù)分析使用CFX Manager軟件，使用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 16單因素方差分析法對3組的發(fā)病率、病情指數(shù)、PR1相對表達(dá)量、NPR1相對表達(dá)量進(jìn)行方差分析，LSD方法進(jìn)行比較，Excel 2007進(jìn)行作表和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病率

接種立枯絲核菌后的第3天，A處理和B處理草坪草開始感病(圖1)，而C處理草坪草因未接種，沒有出現(xiàn)感病現(xiàn)象。從接種后第3天草坪草發(fā)病，隨著時(shí)間的推移，A處理與B處理的發(fā)病率均呈現(xiàn)上升趨勢，且添加了SA的A處理組顯著低于B處理組(P＜ 0.05)。至接種后第6天，B處理發(fā)病率達(dá)47%，A處理發(fā)病率達(dá)30.4%，之后A、B處理發(fā)病率均明顯上升，草坪質(zhì)量開始急劇下降，至接種后第9天，A處理發(fā)病率達(dá)到66.2%，B處理發(fā)病率達(dá)到81.3%。由此可以說明，外施SA能顯著減輕草地早熟禾午夜的發(fā)病率，但其作用時(shí)間有限，接種后第7天A處理發(fā)病率達(dá)到52.5%，草坪質(zhì)量已經(jīng)不可接受。

圖1 接種后午夜草地早熟禾發(fā)病率Figure 1 Plant infection percent of Kentucky bluegrass‘Midnight’ post inoculation

2.2 病情指數(shù)

A處理與B處理草坪草的病情指數(shù)都隨著時(shí)間的推移而升高(圖2)，但在試驗(yàn)期間，A處理的病情指數(shù)始終顯著低于B處理(P＜ 0.05)。至接種后第12天，A處理的病情指數(shù)為20.8，顯著低于B處理的34.5(P＜ 0.05)。由此說明，外施SA處理不僅可以減輕草地早熟禾褐斑病的發(fā)生，還可以顯著降低其病情的嚴(yán)重程度。

圖2 病原菌接種后草地早熟禾的病情指數(shù)Figure 2 The disease index of Kentucky bluegrass ‘Midnight’post inoculation

2.3 誘抗效果

SA對草地早熟禾褐斑病的誘抗效果在接種后第7天，達(dá)53%(圖3)，誘抗效果先降低后升高又降低，除第6天外，其余總體差異不顯著(P＞ 0.05)，由此可見，在發(fā)病期間，SA對草地早熟禾褐斑病的誘抗效果較明顯。

圖3 病菌接種后SA對草地早熟禾午夜褐斑病的誘抗效果Figure 3 Efficacy of resistance induced by SA to brown patch in Kentucky bluegrass ‘Midnight’ post pathogen inoculation

2.4 SA誘導(dǎo)后抗病基因表達(dá)量變化

A、C處理噴施SA后的第1天(T1)，草地早熟禾PR1基因的相對表達(dá)量是噴施SA前(T0)的2.7倍(圖4)，之后，A處理先降低后升高再降低，C處理逐漸降低且與噴施SA前(T0)差異不顯著(P＞ 0.05)。A、B處理，在接菌后第3天(T3)PR1基因相對表達(dá)量均達(dá)到最高，分別為T0時(shí)的3.5倍(P＜ 0.05)和 3.2倍 (P＜ 0.05)，與 T2即接種前相比差異顯著(P＜ 0.05)，可見立枯絲核菌的侵染促進(jìn)了草地早熟禾PR1基因的表達(dá)，這也是植物應(yīng)對病原菌侵染的一種防御反應(yīng)。隨后二者的PR1基因相對表達(dá)量雖有所下降，但在T5即接種后第5天時(shí)仍高于T0，可見立枯絲核菌的侵染使得草地早熟禾PR1基因持續(xù)高表達(dá)，從而引起植物體內(nèi)與之相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生一系列變化。

圖4 草地早熟禾午夜基因PR1相對表達(dá)量Figure 4 The relative expression of PR1 in Kentucky bluegrass ‘Midnight’

A、C處理在T1時(shí)，NPR1基因相對表達(dá)量顯著提高 (P＜ 0.05)，達(dá)到 T0的 2 倍 (圖5)。之后，C處理NPR1基因相對表達(dá)量逐漸降低，且在T3、T5時(shí)顯著 (P＜ 0.05)低于 T0。A 處理NPR1基因相對表達(dá)量呈顯著(P＜ 0.05)上升趨勢，并在T5時(shí)達(dá)到最大，為噴施前(T0)的5.2倍。B處理在接菌后NPR1基因表達(dá)量呈逐漸下降趨勢，在T4、T5時(shí)NPR1基因相對表達(dá)量分別為接種前(T2)的40%和70%，差異顯著(P＜ 0.05)，說明在立枯絲核菌侵染下，午夜NPR1基因表達(dá)量下降，導(dǎo)致病害嚴(yán)重發(fā)生?？梢奛PR1基因的表達(dá)與植物抗病性提高密切相關(guān)，A處理在SA噴施后接種病原菌，NPR1基因的表達(dá)持續(xù)上升，說明外施SA在一定程度上提高了植物的抗病性。

圖5 草地早熟禾午夜NPR1基因相對表達(dá)量Figure 5 The relative expression of NPR1 in Kentucky bluegrass ‘Midnight’

3 討論和結(jié)論

當(dāng)植物遭遇逆境脅迫時(shí)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量自由基等有毒物質(zhì)，損害植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)以致植物死亡[19]。SA是誘導(dǎo)植物抗性的信號分子，可通過誘導(dǎo)植物相關(guān)抗病基因表達(dá)量的提高使植物體產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性?？共』蚝头佬l(wèi)反應(yīng)基因是植物中參與抗性反應(yīng)的兩大類基因，其中病程相關(guān)蛋白(PRP)是防衛(wèi)反應(yīng)基因編碼的產(chǎn)物，在植物抗病性和系統(tǒng)獲得抗性中發(fā)揮著重要作用[20]。PR1就是17類PRP中的一類[21]，在多種植物中已有報(bào)道，例如王坤等[22]研究表明PR1基因是小麥(Triticum aestivum)病程相關(guān)蛋白基因，本研究也得出在立枯絲核菌侵染的情況下，PR1基因相對表達(dá)量持續(xù)顯著升高 (P＜ 0.05)。Cao 等[23]研究表明NPR1基因表達(dá)與植物抗病性提高有關(guān)，缺失NPR1基因的擬南芥對病原微生物感染的敏感性提高，本研究也得出午夜噴施SA并接種立枯絲核菌后，NPR1基因相對表達(dá)量持續(xù)顯著升高 (P＜ 0.05)。

綜上，噴施SA后接種立枯絲核菌會(huì)使PR1、NPR1基因持續(xù)高表達(dá)，對病害具有一定的抗性，在草地早熟禾抵抗病害脅迫中起到積極作用。