楊柳，姜海，蘇曉琳，顏美玲，邢緒東，郭新月，侯阿嬌，滿文靜

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040)

牛膝為莧科牛膝屬植物牛膝(AchyranthesbidentataBL.)的干燥根。根據(jù)2015版《中國(guó)藥典》記載，牛膝作為多年生草本植物，其味甘、苦、酸，性平，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、活血益陰的功效[1]。臨床應(yīng)用廣泛，常用于抗炎鎮(zhèn)痛、腰膝骨痛、筋骨無(wú)力、抗衰老等[2]。牛膝主產(chǎn)于河南焦作地區(qū)(古懷慶府)，作為道地藥材，屬“四大懷藥”之一，由于種植歷史悠久、質(zhì)量?jī)?yōu)良，產(chǎn)量較大，被《本經(jīng)》認(rèn)為是上品牛膝[3]。作為常用的中藥品種，牛膝的市場(chǎng)需求量較大，在我國(guó)河南、河北、山東、內(nèi)蒙、安徽等地區(qū)均有規(guī)?；N植。本實(shí)驗(yàn)樣品主要選取河南主產(chǎn)的部分牛膝藥材。根據(jù)化學(xué)成分研究表明，牛膝中含有甾酮、三萜皂苷和多糖等多種化學(xué)成分[4-7]。其中以齊墩果酸為苷元的三萜皂苷和甾酮類成分，可作為牛膝的主要活性成分發(fā)揮療效。2015版《中國(guó)藥典》中記載牛膝標(biāo)準(zhǔn)僅以蛻皮甾酮的含量作為質(zhì)控指標(biāo)，測(cè)定成分單一，難以全面評(píng)價(jià)牛膝的質(zhì)量，因此本文建立了同時(shí)測(cè)定甾酮類和三萜皂苷類成分(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa) 的方法，為牛膝的綜合質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也使牛膝質(zhì)量的可控性得到進(jìn)一步提升。以往的文獻(xiàn)報(bào)道了用HPLC分別測(cè)定牛膝中的甾酮類成分和皂苷類成分，樣品處理復(fù)雜且測(cè)定煩瑣[8-9]。所以本文用甲醇超聲提取法對(duì)樣品進(jìn)行處理，采用HPLC-DAD-ELSD聯(lián)用法一次進(jìn)樣，同時(shí)測(cè)定牛膝中3種化合物(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa)的含量。建立的樣品處理過(guò)程和測(cè)定方法簡(jiǎn)單，為多指標(biāo)控制牛膝藥材質(zhì)量提供了一種快速簡(jiǎn)便的方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；Waters2998二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)；Waters 2424蒸發(fā)光檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；電子天平(AL204系列中國(guó)METTLER TOLEDO電子公司)。

1.2 試劑

β-蛻皮甾酮(批號(hào)5289-74-7)、人參皂苷R0(批號(hào)34367-04-9)、竹節(jié)參皂苷Ⅳa(批號(hào)51415-02-2)標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自天津西瑪科技有限公司，純度≥98%，供含量測(cè)定使用；乙腈(色譜純，Amethyst公司)；甲醇(色譜純，Amethyst公司)；甲醇(分析純，北京化工廠)；甲酸(色譜純，北京迪馬科技有限公司)；異丙醇(色譜純, Xingmake公司)。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相：乙腈-0.08%甲酸(A)，水-2.5%異丙醇-0.08%甲酸(B)進(jìn)行梯度洗脫。見(jiàn)表1。流速為0.9 mL/min，時(shí)間80 min。在上述條件下，牛膝中β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa化合物的色譜峰與相鄰成分可達(dá)基線分離，高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 梯度洗脫條件

注：A：HPLC-DAD檢測(cè)的對(duì)照品；B：HPLC-ELSD檢測(cè)的對(duì)照品；C：HPLC-DAD檢測(cè)的供試品；D：HPLC-ELSD檢測(cè)的供試品；1：β-蛻皮甾酮；2：人參皂苷R0；3：竹節(jié)參皂苷Ⅳa。圖1 β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa高效液相圖譜

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取牛膝中3種化合物(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa)的對(duì)照品，各加入甲醇溶解制成適當(dāng)質(zhì)量濃度的對(duì)照品儲(chǔ)蓄液。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品適量，進(jìn)行粉碎，過(guò)篩，精密稱取1 g，置于具塞三角瓶中，并加入甲醇10 mL，超聲提取40 min，取上清液，濾過(guò)，為牛膝的供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2項(xiàng)”下的對(duì)照品儲(chǔ)蓄液，配成不同濃度混合對(duì)照品溶液。按“2.1”所述方法，注入到液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定牛膝中3種化合物(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa)的峰面積。其中β-蛻皮甾酮以濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到回歸方程，人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa以濃度的對(duì)數(shù)值X為橫坐標(biāo)，峰面積的對(duì)數(shù)值Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，各回歸方程呈良好的線性關(guān)系,具體見(jiàn)表2。結(jié)果表明，牛膝中3種化合物(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa)分別在0.001 9～0.096 3 mg/mL、0.002 2～0.469 5 mg/mL和0.004 7～0.483 0 mg/mL濃度范圍內(nèi)濃度與峰面積間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密量取牛膝中3種化合物(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa)的混合對(duì)照品溶液,在上述色譜條件下，進(jìn)樣10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定供試品溶液中β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa 3種化合物的峰面積, 計(jì)算RSD值結(jié)果。牛膝中3種化合物(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa)色譜峰的RSD值(n=6)分別為0.631 %、1.427 %、0.156%。表明本法精密度較好。

表2 線性關(guān)系考察

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批牛膝樣品，按上述方法制備供試品溶液，分別在0、8、16、24、32、48 h進(jìn)樣，在上述色譜柱條件下，測(cè)定牛膝中三種化合物(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa)的峰面積，計(jì)算RSD值(n=6)。結(jié)果RSD分別為2.173%、2.415%、2.003%。表明供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取牛膝藥材6份，按照“2.3項(xiàng)”下的方法制成6份牛膝供試品溶液，按“2.1項(xiàng)”下色譜條件測(cè)定牛膝中3種化合物(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa)的峰面積，計(jì)算RSD值(n=6)。結(jié)果牛膝中3種化合物(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa)的RSD分別為1.527%、2.230%、1.758%。結(jié)果表明,方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的牛膝藥材約0.5 g，置具塞三角瓶中，加入甲醇5 mL，共9份，精密加入β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0和竹節(jié)參皂苷Ⅳa對(duì)照品適量，以下按“2.3項(xiàng)”下方法操作，制備加樣回收供試品溶液。注入液相色譜儀，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定加樣回收供試品溶液中β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa的含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，用本法測(cè)定樣品中3種成分的含量回收率良好。

2.9 不同批次牛膝中β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa含量測(cè)定

取河南產(chǎn)不同批次牛膝樣品，按“2.3項(xiàng)”所述方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下，測(cè)得牛膝中3種化合物(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa)的峰面積，通過(guò)回歸方程分別測(cè)定其含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 加樣回收率結(jié)果

表4 牛膝中 β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa含量

3 結(jié)論與討論

牛膝中β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa因極性差異較大，使用固定的比例流動(dòng)相難以同時(shí)測(cè)定出牛膝中3種化合物(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa)的含量，所以在實(shí)驗(yàn)中對(duì)流動(dòng)相梯度進(jìn)行優(yōu)化，來(lái)測(cè)定牛膝中β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa的含量。結(jié)果在HPLC中3種化合物峰形基本對(duì)稱，峰與峰間可達(dá)較好的分離度。在200～400 nm范圍內(nèi)對(duì)牛膝中β-蛻皮甾酮色譜峰進(jìn)行紫外吸光光譜掃描，結(jié)果β-蛻皮甾酮色譜峰在248 nm處有強(qiáng)吸收。甾酮和皂苷作為牛膝的主要成分，由于皂苷類化合物沒(méi)有紫外吸收，且牛膝中皂苷種類繁多，只用DAD無(wú)法同時(shí)對(duì)牛膝中這兩類不同性質(zhì)的化合物進(jìn)行測(cè)定。而ELSD作為一種通用型檢測(cè)器，特別適用于沒(méi)有紫外吸收的皂苷類化合物的測(cè)定，所以本文將DAD和ELSD結(jié)合起來(lái)，建立了HPLC-DAD-ELSD這兩種方法結(jié)合起來(lái)同時(shí)測(cè)定牛膝中3種化合物(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa)含量。

本研究測(cè)得的河南產(chǎn)10個(gè)不同批次的牛膝藥材中β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa的含量分別在0.019～0.963 mg/g、0.022～4.695 mg/g和0.047～4.83 mg/g含量范圍內(nèi)，所以本研究采用的HPLC-DAD-ELSD聯(lián)用法可作為牛膝定量測(cè)定方法。牛膝資源具有明顯的道地性，不同生長(zhǎng)環(huán)境、海拔、光照、土壤性質(zhì)、溫度、水分等因子單一或相互作用影響著其有效成分的積累。且同一省份不同地區(qū)牛膝中甾酮和三萜皂苷的含量存在明顯的地域差異，所以三萜皂苷可與甾酮類共同作為產(chǎn)地和質(zhì)量鑒別的指標(biāo)，為多指標(biāo)控制牛膝藥材提供依據(jù)。

本研究采用HPLC-DAD-ELSD法同時(shí)測(cè)定牛膝中3種化合物(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa)的含量，方法快捷、靈敏、簡(jiǎn)便?？筛茖W(xué)、全面地對(duì)牛膝藥材的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，并為多指標(biāo)控制牛膝藥材及臨床藥用提供科學(xué)依據(jù)。