許 玥 陳玉佩張佳怡 陳 潔白玉琢 徐 菁陳 莉 陳冬荔 張淑靜 鄒德輝 劉 通 張 莉△

（1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2.華北理工大學中醫(yī)學院，河北 唐山 063009；3.廣東省第二中醫(yī)院，廣東 廣州 510095）

多裂肌的急性損傷是脊柱腰椎后路手術中常見并發(fā)癥，是引發(fā)醫(yī)源性腰部疼痛的重要原因，近年來受到國內外學者的廣泛關注與研究［1]。肌衛(wèi)星細胞是一類位于骨骼肌基底膜下的成肌前體細胞，其激活與增殖是損傷多裂肌再生修復的關鍵，Carosio S等［2]發(fā)現(xiàn)，骨骼肌剔除肌衛(wèi)星細胞后，其維持再生修復的能力降低。電針血清是近年研究針刺作用及機理的一種新方法，它不僅可排除在體實驗多因素影響的局限性，而且具有直觀、快速、敏感的優(yōu)點，已被廣泛應用于各種疾病的研究［3]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，電針“委中”血清和電針“腎俞”血清可上調p-Akt等蛋白的表達，通過磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）通路促進肌衛(wèi)星細胞的增殖，加快損傷多裂肌的修復［4]。本實驗在此基礎上，通過觀察電針“委中”大鼠血清對肌衛(wèi)星細胞成肌分化因子MyoD、周期蛋白CDK4、P57和CyclinD表達的影響，從細胞周期角度進一步探究電針干預骨骼肌損傷修復的作用機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡SPF級雄性SD大鼠24只，體質量 （300±10）g，4周齡SPF級雄性SD大鼠1只，體質量120 g，由北京維通利華實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（京）2016-0001。分籠飼養(yǎng)，明暗周期 12 h，自由飲食和飲水，環(huán)境溫度24℃，濕度40%～50%，適應性飼養(yǎng)7 d。

1.2 試藥與儀器 1）儀器：韓氏電針儀（北京思盛達醫(yī)療器械中心）；正置智能型顯微鏡及采集系統(tǒng)（BX53，奧林巴斯，中國有限公司）；蛋白質電泳及轉膜系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；F1uorChemFC2凝膠成像系統(tǒng)（美國A1-phaInnoteeh公司）。2）試藥：布比卡因（美國Sigma公司），10%水合氯醛 （北京百諾威公司），青鏈霉素混合液、DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青公司），Ⅰ型膠原酶（上海吉熒公司），0.25%EDTA-胰蛋白酶 （北京索萊寶公司），PI3K抑制劑LY294002（美國 Selleck公司），蛋白 Marker（美國Thermo公司），β-actin抗體、羊抗兔IgG和羊抗小鼠IgG （北京博奧森公司），MyoD抗體、P57抗體、CyclinD抗體（英國abcam公司），CDK4抗體（美國proteintech公司）。

1.3 造模與分組 多裂肌損傷模型制備方法參照文章［5-6]。 無菌條件下以 10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉。注射器抽取0.5%布比卡因溶液，取脊柱L4、L5水平雙側的4個點，針頭緊貼棘突旁垂直進入肌肉，觸到關節(jié)突和乳突所在的骨面后回抽，如無血則注射布比卡因溶液 400 μL（100 μL×4），時間約 3 s，以利于藥物的吸收。單次注射完成造模。大鼠按體質量分層，隨機分3組，即空白組、模型組、電針委中組，每組8只。本實驗動物的處置符合中華人民共和國科學技術部頒發(fā)的《關于善待實驗動物的指導性意見（2006）》［5]的相關規(guī)定。

1.4 干預方法 空白組不造模，不做任何處理。模型組：造模完成后，與電針“委中”組同時抓取、固定、取材，不進行電針治療。電針“委中”組：穴位定位參照《實驗針灸學》動物穴位定位法及擬人對照法［7]，選取大鼠雙側“委中”穴（膝關節(jié)背面正中）進行電針治療，干預后第4日取材。電針方法：將大鼠置于固定器上，暴露雙后肢，使用0.25 mm×13 mm一次性針灸針，直刺進針后連接韓式電針儀（HANS-200A），選用頻率為2 Hz/100 Hz的疏密波，電流強度 1～2 mA，每次 20 min，每日1次，持續(xù)3 d。

1.5 標本采集 1）血清：3組大鼠腹主動脈取血5 mL，室溫下靜置2 h，以3 500 r/min離心10 min，取血清至56℃滅活30 min，無菌條件下經微孔濾膜過濾后移至-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。原代肌衛(wèi)星細胞的分離與培養(yǎng)：細胞的分離與培養(yǎng)參照文獻［8]。2）多裂肌：3 組大鼠無菌條件麻醉后，剔除大鼠背部皮毛、筋膜，充分暴露腰部肌肉，剝離最長肌和骼肋肌，銳性切取L4和L5水平注射中心部位約1 mm×1 mm×1 mm多裂肌組織，迅速置于40 g/L多聚甲醛溶液固定。3）未處理大鼠多裂?。毫砣?周齡雄性SD大鼠1只，不做造模及針刺處理，無菌條件下以過量100 g/L水合氯醛麻醉處死，取L4～5節(jié)段多裂肌。以含有青鏈霉素混合液的PBS沖洗3次，分離多裂肌周圍的筋膜后，將肌肉放至預溫的以DMEM配制的Ⅰ型膠原酶培養(yǎng)皿中 （5 mL，2 g/L），在37℃的培養(yǎng)箱消化1.5 h，期間每15 min晃動1次；加入等量的完全培養(yǎng)基（DMEM，100 mL/L FBS），反復吹打，使肌纖維完全分離；將細胞懸液1 000 r/min離心5 min，棄上清，細胞沉淀重懸后接種至預先用1 g/L明膠包被的培養(yǎng)瓶中；于37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3 d。3 d后，顯微鏡觀察到大量細胞貼壁，此時吸出培養(yǎng)基以PBS清洗3次，加入5 mL完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。當細胞生長至80%匯合時傳代。吸出培養(yǎng)基以PBS清洗3次，加入1 mL含EDTA的2.5 mL/L的胰蛋白酶消化液；顯微鏡下觀察到細胞變成圓形后，輕拍培養(yǎng)瓶使絕大部分細胞脫落，加入完全培養(yǎng)基終止消化；反復吹打細胞懸液后離心棄上清（1 000 r/min，5 min）。當細胞沉淀重懸，以1∶3的比例接種于培養(yǎng)瓶后放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，以去除容易貼壁的成纖維細胞（前3次傳代均差速貼壁1 h，盡可能去除成纖維細胞）。1 h后，將細胞懸液移入新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，每2日換液1次。

1.6 指標檢測 1）HE染色法觀察在體實驗多裂肌形態(tài)學變化：多裂肌經4%多聚甲醛溶液固定72 h后，常規(guī)乙醇梯度脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，對切片行二甲苯脫蠟，乙醇梯度水洗。常規(guī)HE染色后再脫水、二甲苯透明、封片。光鏡下觀察多裂肌組織結構的變化。2）Western blotting 法檢測 離體實 驗 MyoD、CDK4、CyclinD和P57蛋白的表達：細胞稀釋為2×105個/mL，以1×106/皿將細胞懸液接種到100 mm培養(yǎng)皿中，各皿隨機分為空白血清組、模型血清組、電針“委中”血清組、抑制劑血清組（電針“委中”血清中加入PI3K抑制劑LY294002）。當細胞貼壁后棄去培養(yǎng)基，每皿加入對應血清的培養(yǎng)基，抑制劑組提前2 h加入50 μmol/L LY294002，繼續(xù)培養(yǎng)1 d。1 d后提取細胞總蛋白，測定蛋白含量并進行蛋白變性，將提前制好的10%丙烯酞胺凝膠置于電泳槽中，Marker上樣3 μL，其余蛋白上樣10 μL，80 V電泳至濃縮膠與分離膠交界處后換為100 V電泳1 h，當嗅酚藍條帶距膠底約1 cm時停止電泳，換80 V電轉75 min。含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h后，于4℃一抗孵育過夜，二抗孵育1 h后TBST洗3次（5 min/次），ECL顯色并曝光。圖像采集完畢后，使用Fluor Chem軟件定量分析MyoD、CDK4、CyclinD、P57和β-actin的OD值，對各指標與內參吸光度比值進行統(tǒng)計分析。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。每組樣本數(shù)據(jù)以（±s）表示，服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)組間差異用單因素方差分析，方差齊性時兩兩比較用LSD-t檢驗，方差不齊時采用Welch檢驗，不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠多裂肌HE染色形態(tài)學變化 見圖1。結果顯示：空白組可見規(guī)律排列、大小均勻的肌纖維，細胞核均勻分布在細胞周圍；模型組可見大面積的肌纖維變性壞死區(qū)域，炎性細胞大量浸潤，壞死區(qū)偶見未受損的肌纖維；電針“委中”組可見肌纖維壞死、降解形成的空泡結構以及炎性細胞浸潤，變性壞死區(qū)明顯減少，偶見直徑大小不一的新生肌纖維。

2.2 電針對MyoD、CDK4、CyclinD、P57蛋白表達的影響 見圖2和表1。Western blotting結果顯示：與空白血清組比較，模型血清組、電針“委中”血清組和抑制劑血清組的MyoD蛋白表達量均顯著升高 （P＜0.01）；與模型血清組對比，電針“委中”血清組MyoD蛋白表達量顯著升高（P＜0.01）；且電針“委中”血清組MyoD蛋白表達量高于抑制劑血清組（P＜0.01）。與空白血清組對比，模型血清組、電針“委中”血清組和抑制劑血清組的CDK4和P57蛋白表達量均顯著升高（P＜0.01）；與模型血清組對比，電針“委中”血清組CDK4蛋白表達量升高（P＜0.05），而P57蛋白表達量顯著降低（P＜0.01）；與抑制劑血清組對比，電針“委中”血清組CDK4蛋白表達量高于抑制劑組（P＜0.05），而P57蛋白表達量顯著低于抑制劑組（P＜0.01）。與空白血清組對比，電針“委中”血清組CyclinD蛋白表達量升高（P＜0.05），其他各組對比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠多裂肌形態(tài)結構（HE染色，400倍）

表 1 各組 MyoD、CDK4、CyclinD、P57 蛋白表達的比較（±s）

表 1 各組 MyoD、CDK4、CyclinD、P57 蛋白表達的比較（±s）

與空白血清組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型血清組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與抑制劑血清組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組 別MyoD CDK4 CyclinD P57空白血清組模型血清組電針“委中”血清組0.462±0.027 0.567±0.039 0.593±0.054 0.212±0.016 0.653±0.005** 0.783±0.067** 0.640±0.062 0.528±0.037**0.729±0.019**△△##0.870±0.089**△#0.709±0.054*0.353±0.032**△△##抑制劑血清組0.668±0.015** 0.766±0.063** 0.693±0.045 0.562±0.022**

圖2 各組MyoD、CDK4、CyclinD、P57蛋白電泳條帶圖

3 討 論

多裂肌是一組附著于棘突、椎板和橫突之間的椎旁肌群，在腰部最為發(fā)達。腰多裂肌附著面積大、肌纖維含量豐富，能夠產生強大的收縮力以維持腰椎的穩(wěn)定性［9]。腰椎后路手術中，剝離和牽拉是引起多裂肌急性損傷的主要因素。近年來，運用針刺治療骨骼肌急慢性損傷的研究日益增多，Yu等發(fā)現(xiàn)，電針足三里和阿是穴可顯著促進腓腸肌鈍挫傷后的肌肉再生［10]；Su等發(fā)現(xiàn)電針可促進糖尿病肌病患者及神經損傷后的肌肉修復［11]。本實驗多裂肌HE染色結果顯示，電針“委中”組肌纖維在同一時間點修復程度優(yōu)于模型組，從形態(tài)學上說明電針“委中”可加快損傷骨骼肌再生修復。

電針血清源于血清藥理學，已成為針灸學研究的一個新熱點［12]。中醫(yī)學認為“血”由精氣化生，是構成人體的基本物質之一?！峨y經》有云“血主濡之”，故血和則“筋骨勁強，關節(jié)清利”。現(xiàn)代醫(yī)學表明，血清中含有大量營養(yǎng)成分和生長因子等各種維持細胞生長的必須物質?！拔小睘樽闾柊螂捉浀暮贤裂?，《四總穴歌》記載“腰背委中求”。足太陽膀胱經脈從頭走足，在背部形成兩行夾脊循行，直達腰骶，下至腘窩合并于委中。其舒筋通絡、行氣活血的功效突出，又因“經脈所過，主治所及”的治療理論，成為臨床治療腰部疾病的常用穴位。課題組前期在骨骼肌損傷修復方面進行了長期研究，發(fā)現(xiàn)電針“委中”穴可以促進多種生長因子的表達，減緩損傷局部的炎癥反應，促進損傷的多裂肌良性修復［4-6]。

大量研究已證實電針可顯著促進骨骼肌干細胞——肌衛(wèi)星細胞的增殖，加速骨骼肌的修復［4，13]。MyoD是重要的生肌調節(jié)因子之一，處于激活、增殖狀態(tài)的肌衛(wèi)星細胞均有表達，因此，MyoD是反映肌衛(wèi)星細胞增殖活性和骨骼肌再生能力的金標準［14-15]。Macaluso等研究發(fā)現(xiàn)，激活的衛(wèi)星細胞可通過上調MyoD的表達以促進細胞增殖［16]。而細胞增殖的順利進行與細胞周期密切相關，正常細胞周期是在正負因子調控下的同步過程；CDK4是細胞周期正調控的關鍵蛋白，其功能的激活主要依賴于細胞周期蛋白。Cyclin D是細胞周期蛋白亞型之一，與CDK4結合形成激酶復合物，進而實現(xiàn)正性調控作用［17]。研究發(fā)現(xiàn)，當CDK4和CyclinD表達同時增強，便可能誘導細胞提前進入S期，使細胞周期縮短從而加快增殖。然而，CDKs的活性可被細胞周期抑制蛋白 （CKI）所抑制。P57作為CKI的重要組成之一，是細胞周期的重要負調控蛋白。研究表明，P57能夠競爭性的與大部分CDK-cyclin復合物結合從而抑制其活性，特別是G1期的 CDK4/6-cyclinD 復合物［18]。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，模型血清組、電針“委中”血清組的MyoD、CDK4和P57蛋白表達量均顯著高于空白血清組（P＜0.01），且電針“委中”血清組 MyoD和CDK4蛋白表達量高于模型血清組 （P＜0.01或P＜0.05），而P57蛋白表達量顯著低于模型血清組（P＜0.01）。這表明損傷后的多裂肌啟動自我修復功能，肌衛(wèi)星細胞激活并進入周期性增殖狀態(tài)，電針 “委中”血清在上調MyoD和CDK4蛋白表達的同時，下調P57蛋白的表達，加速細胞周期性增殖的進程。本實驗中，電針“委中”血清組CyclinD蛋白表達量高于空白血清組 （P＜0.05），其他各組對比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），因CyclinD含量受到多種生長因子的調控而呈周期性變化，其高峰表達出現(xiàn)在G1期的中晚期［19]，推測此時可能并非CyclinD表達的高峰期，而電針血清有促進肌衛(wèi)星細胞增殖高峰期提前的作用［20]，因此出現(xiàn)以上實驗結果。PI3K-Akt是調控肌衛(wèi)星細胞增殖的重要通路，Li等［21]發(fā)現(xiàn)，以 PI3K 特異性阻斷劑 LY294002 阻斷該通路后，肌衛(wèi)星細胞的增殖能力明顯下降。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，抑制劑血清組MyoD、p-Akt等蛋白表達明顯下調，細胞增殖速度減慢［4]。本實驗結果顯示，與電針“委中”血清組相比，抑制劑血清組MyoD、CDK4蛋白表達量均降低（P＜0.01或P＜0.05），而P57蛋白表達量升高（P＜0.01），與上述結論相符，然而其機制為何有待進一步研究。

總之，電針“委中”血清可通過上調MyoD、CDK4的表達，并下調P57的表達，加速肌衛(wèi)星細胞增殖的周期性進程，促進損傷多裂肌的良性修復。