張 璐，李 妍，孫子雯，李楠鈺，胡竹林

(昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院眼科，云南省第二人民醫(yī)院眼科，云南省眼科研究所，云南省眼科疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650021)

角膜移植是是治療角膜盲的唯一方法，但供體缺乏是目前面臨的主要問(wèn)題，由此提出的人工角膜能很好地解決這個(gè)問(wèn)題，但人工角膜排斥反應(yīng)限制了其發(fā)展，組織角膜為其提供了新的研究方向。豬脫細(xì)胞角膜基質(zhì)(acellular porcine corneal matrix,APCM)已進(jìn)入臨床應(yīng)用，但其受限于無(wú)基質(zhì)細(xì)胞，移植后受體會(huì)出現(xiàn)植片變薄及透明度下降等問(wèn)題，鑒于此，角膜基質(zhì)細(xì)胞植入APCM的相關(guān)研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)。角膜基質(zhì)細(xì)胞(CSCs)是角膜基質(zhì)層中的主要細(xì)胞[1]，對(duì)維持角膜的透明度及形態(tài)有十分重要[2]。目前，已經(jīng)成功的從人、鼠、兔、豬等[3-6]角膜中分離培養(yǎng)出原代細(xì)胞，但是這些動(dòng)物的種屬與人類差異較大，且眼球的大小、解剖結(jié)構(gòu)與人相比也有很大的區(qū)別，而樹(shù)鼩被認(rèn)為與靈長(zhǎng)類有親緣關(guān)系[7]。Almubrad等[8]用電子顯微鏡觀察角膜的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)樹(shù)鼩角膜結(jié)構(gòu)與人類相似，但目前關(guān)于樹(shù)鼩角膜基質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)未見(jiàn)報(bào)道，因此本文探討一種簡(jiǎn)單方便的體外分離培養(yǎng)樹(shù)鼩角膜基質(zhì)細(xì)胞的方法，以期為組織角膜工程的研究及臨床應(yīng)用、自體或異體的角膜基質(zhì)細(xì)胞移植奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)使用的滇緬樹(shù)鼩由中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所提供[SCXK(滇)K2017-0003]，出生10～15 d的子一代清潔級(jí)樹(shù)鼩6只，體質(zhì)量35～40 g,雌雄不限,操作地點(diǎn)中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所[SYXK(滇)K2017-0008]。實(shí)驗(yàn)方案獲得昆明醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)通過(guò)(2014-Y02)。本實(shí)驗(yàn)所使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物嚴(yán)格遵照3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；膠原酶Ⅱ(美國(guó)Sigma)；Dispase-Ⅱ(美國(guó)Merck Millipore公司)；0.25%胰蛋白酶-EDTA(美國(guó)Merck Millipore公司)；ITS(Insulin-Transferrin-Selenium，胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒，美國(guó)Gibco公司)；波形蛋白單克隆抗體(美國(guó)Invitrogen公司)；DAB免疫組化試劑盒(北京中杉)；10X多聚賴氨酸(北京索萊寶生物科技有限公司)；曲拉通X-100(北京索萊寶生物科技有限公司)；抗熒光淬滅PVP封片液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；DAPI溶液(北京索萊寶生物科技有限公司)；SMZl500體視顯微鏡及光學(xué)照相系統(tǒng)(日本Nikon公司)、熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Fisher Scientific公司)；雙目眼科手術(shù)顯微鏡(德國(guó)蔡司公司)；TC處理6孔細(xì)胞圓形爬片(上海晶安)；T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶、24孔培養(yǎng)板(無(wú)錫耐思生物科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組、獲取樹(shù)鼩角膜基質(zhì)片

取6只幼齡雌性樹(shù)鼩，經(jīng)腹腔注射3% 的戊巴比妥1 mL處死動(dòng)物后，無(wú)菌條件下在眼科手術(shù)顯微鏡下剪開(kāi)樹(shù)鼩的眼皮，露出眼球，小心摘取8只眼球，碘伏中浸泡12 min，用9 g/L生理鹽水沖洗3遍。將洗凈的眼球移入含雙抗(青霉素100 U/mL、鏈霉素0.5 mg/mL)的PBS中，在超凈工作臺(tái)上，用15度穿刺刀沿角膜緣穿刺入前房，然后角膜剪沿角鞏膜緣剪下整個(gè)角膜組織(不含角鞏膜緣)，放入含有雙抗的PBS中。角膜片隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組A及實(shí)驗(yàn)組B，實(shí)驗(yàn)組A采用膠原酶消化法分離CSCs，實(shí)驗(yàn)組B采用膠原酶聯(lián)合中性蛋白酶消化法進(jìn)行細(xì)胞的原代培養(yǎng)。每組取6片角膜片進(jìn)行觀察。

1.3.2 膠原酶消化法提取原代細(xì)胞

在體視顯微鏡下用顯微鑷刮除角膜上皮層，完整撕下角膜后彈力層及內(nèi)皮層，放入含有雙抗的PBS中漂洗2次。經(jīng)以上處理后，將角膜基質(zhì)片放入1.5 mL的EP管中，剪碎至1 mm×1 mm大小，每個(gè)EP管中加入200 μL濃度為1%的Ⅱ型膠原酶，酶與組織充分接觸。37℃避光震蕩消化約60 min，加入基質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)液終止消化。1500 r/min離心10 min，棄上清，反復(fù)吹打、洗滌、離心2次。收集細(xì)胞懸液，用含1%青霉素/鏈霉素、20% FBS的DMEM/F12、1% ITS為基質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)液，細(xì)胞懸液接種于24孔板中，24孔板提前用多聚賴氨酸處理，置37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后第一次半量換液，以后每2～3 d換液1次。

1.3.3 膠原酶聯(lián)合dispase-Ⅱ提取原代細(xì)胞

角膜基質(zhì)片的制備同前，剪碎。加入1%的Ⅱ型膠原酶在37℃中消化30 min,用含血清的培養(yǎng)基終止消化、離心一次；加入1 mg/mL的dispase-Ⅱ，置于37℃溫箱中避光消化2 h,用完全培養(yǎng)基(同上)終止消化，1500 r/min離心10 min，棄上清，反復(fù)吹打、洗滌、離心2次，置37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，換液及觀察同前。

1.3.4 角膜基質(zhì)細(xì)胞的傳代及復(fù)蘇

角膜基質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)滿至80%～90%時(shí)，吸去剩余培養(yǎng)液，加入PBS緩沖液清洗細(xì)胞2次，每次30 s，用0.25%胰蛋白酶-EDTA，37℃中消化1 min，置于倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞回縮、變圓、細(xì)胞間隙增大時(shí)加入培養(yǎng)液終止消化。輕輕敲打培養(yǎng)瓶壁，使細(xì)胞完全脫落，收集細(xì)胞懸液于15 mL離心管中離心，1000 r/min,離心5 min，棄上清液，加入2～3 mL培養(yǎng)液(DMEM/F12+10% FBS+1%雙抗)輕輕吹打，以1∶2或1∶3傳代，放入T25瓶中,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液。凍存的CSCs從液氮取出后，立即放入37℃水浴箱，細(xì)胞懸液溶解后加入細(xì)胞培養(yǎng)基，先慢后快，1000 r/min、5 min,棄上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)基，溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.5 角膜基質(zhì)細(xì)胞的鑒定

(1)細(xì)胞免疫組織化學(xué)法：P3代細(xì)胞復(fù)蘇，2 d后胰酶消化，收集細(xì)胞懸液。6孔板的每孔中放入1張玻片，每張玻片滴加400～500 μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液的量以不溢出玻片適宜，水平置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中2 h后，使其貼壁，追加細(xì)胞培養(yǎng)液至2 mL。取細(xì)胞長(zhǎng)滿70%-80%的玻片，PBS輕輕漂洗2次；4%的多聚甲醛或95%的酒精(即95%的酒精99份，冰醋酸1份的比例)，常溫固定20 min；固定后PBS漂洗3次，每次3 min；0.3%Trition X-100、透膜10 min后，用PBS漂洗3次，每次3 min；在玻片表面滴加3%過(guò)氧化氫去離子水，室溫孵育10 min,滅火內(nèi)源性酶；吸除過(guò)氧化氫，PBS漂洗3次，每次3 min；玻片表面滴加10%山羊血清封閉液，37℃孵育20 min,以減少抗原抗體的非特異性結(jié)合；吸去多余封閉液，切勿沖洗；將波形蛋白單克隆抗體用0.2% BSA稀釋到1∶100，滴加50 μL至玻片表面，陰性對(duì)照組滴加0.2% BSA，置于濕盒內(nèi)4℃反應(yīng)過(guò)夜后，PBS漂洗3次，每次5 min；滴加適量反應(yīng)增強(qiáng)劑(試劑2中杉金橋)，室溫20 min后，PBS洗3×3 min；玻片表面滴加適量酶標(biāo)羊抗兔IgG聚合物，室溫20 min，PBS洗3×3 min；上述處理后的玻片滴加DAB顯色10 min、自來(lái)水充分沖洗；蘇木素染色90 s；新鮮配置的0.1% 鹽酸-無(wú)水乙醇分化20 s；置于自來(lái)水處沖洗返藍(lán)；用酒精梯度脫水、二甲苯通風(fēng)窗處透明、中性樹(shù)膠封片、鏡檢。

(2)細(xì)胞免疫熒光：細(xì)胞固定同前，0.5% Trition X-100(PBS配制)、室溫透膜20 min后，用PBS漂洗3次，每次3 min；滴加山羊血清，室溫封閉30 min；吸出多余封閉液，勿洗；每張玻片滴加足量稀釋好的一抗(1∶100),置于濕盒中4℃ 過(guò)夜孵育；次日早晨，玻片用PBS漂洗3次，每次10 min；滴加熒光二抗(1∶50)，37℃中孵育1 h,PBS漂洗3次，每次10 min；滴加DAPI染核，室溫10 min，PBS漂洗3次，每次3 min；吸水紙吸干玻片上殘留的液體，用含抗熒光淬滅PVP封閉液封片，倒置熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 膠原酶消化法提取原代細(xì)胞

用膠原酶消化法獲取的原代細(xì)胞生長(zhǎng)較慢，消化下來(lái)的細(xì)胞一部分24 h后可以貼壁，隨后原代細(xì)胞生長(zhǎng)活躍， 3 d后可見(jiàn)細(xì)胞分散在24孔板中，細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞核居中，胞漿清亮，形態(tài)規(guī)則(圖1 A)， 9 d后觀察到有較多細(xì)胞集落形成(圖1B)，大部分細(xì)胞呈梭形。

2.2 膠原酶聯(lián)合Dispase-Ⅱ提取原代細(xì)胞

取材后，第10天在高倍鏡下觀察，見(jiàn)散在分布消化下來(lái)的梭形細(xì)胞，(圖2A)，培養(yǎng)液清澈。繼續(xù)培養(yǎng)至第20天(圖2B)，細(xì)胞融合成片狀，分布均勻。

2.3 角膜基質(zhì)細(xì)胞的傳代、復(fù)蘇和鑒定

膠原酶消化法培養(yǎng)出的基質(zhì)細(xì)胞，胰酶消化時(shí)細(xì)胞較易脫落，大部分細(xì)胞為單個(gè)，聚集成團(tuán)的較少，脫落下來(lái)的細(xì)胞24 h可貼壁。傳代培養(yǎng)的細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，2～3 d即可傳代。傳至P2細(xì)胞純化，無(wú)上皮等雜細(xì)胞，P2/P3/P4/P5細(xì)胞生長(zhǎng)最為活躍；隨著傳代次數(shù)的增加，傳代細(xì)胞體積逐漸增大，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，本次實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞傳代至7代。波形蛋白免疫組化法顯示，培養(yǎng)出的細(xì)胞胞漿染成棕色或深棕色(圖3A/3C)，細(xì)胞核為淡藍(lán)色，提示波形蛋白表達(dá)陽(yáng)性。陰性對(duì)照組的細(xì)胞胞核未見(jiàn)棕色(圖3B/3D)。培養(yǎng)出的細(xì)胞有典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)，波形蛋白表達(dá)陽(yáng)性、定位于胞漿，證實(shí)培養(yǎng)出的細(xì)胞就是角膜基質(zhì)細(xì)胞。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果示：波形蛋白表達(dá)于胞漿，紅色熒光(圖4)。培養(yǎng)出的細(xì)胞有典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)，波形蛋白表達(dá)陽(yáng)性，定位于胞漿，證實(shí)培養(yǎng)出的細(xì)胞是角膜基質(zhì)細(xì)胞。

注：A：原代CSCs P0代第3天；B：原代CSCs P0代第9天。圖1 膠原酶法消化獲取原代細(xì)胞(× 10)Note. A, Primary CSCs P0 generation day 3. B, Primary CSCs P0 generation day 9.Figure 1 Collagease digestion to obtain primary cells

注：A：原代CSCs P0代第10天；B：原代CSCs P0代第20天。圖2 雙酶消化法獲取原代CSCs(× 10)Note. A, Primary CSCs P0 generation day 3. B, Primary CSCs P0 generation day 9.Figure 2 Double enzyme digestion to obtain primary CSCs

3 討論

樹(shù)鼩CSCs的原代培養(yǎng)可以為研究其形態(tài)、生長(zhǎng)及人工角膜組織工程提供物質(zhì)基礎(chǔ)。近年來(lái)由于角膜植片的匱乏，使得臨床角膜移植應(yīng)用受限，而組織工程產(chǎn)生的生物角膜能解決這一難題，這就促使組織工程及生物角膜的快速發(fā)展，構(gòu)建組織工程角膜基質(zhì)主要包括3大要素：人工材料、微環(huán)境、種子細(xì)胞。組織工程中常見(jiàn)的支架材料：明膠、聚合物、多種膠原蛋白、脫細(xì)胞角膜等[9-11]。目前獲得的脫細(xì)胞角膜在強(qiáng)度、透明度、結(jié)構(gòu)等方面與天然角膜相似[12]，是組織工程角膜中具有前景的支撐材料，但這些支架材料缺乏生物活性，長(zhǎng)期使用后出現(xiàn)生物降解等問(wèn)題[13]。設(shè)想將角膜基質(zhì)細(xì)胞打入脫細(xì)胞角膜后能恢復(fù)其生物活性。人角膜基質(zhì)細(xì)胞是一個(gè)成熟的細(xì)胞系，在組織工程角膜上已有相應(yīng)的研究[14]?？紤]到種屬間的排斥反應(yīng)，我們選擇與人類具有親緣關(guān)系的樹(shù)鼩作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，選擇和人類相似的樹(shù)鼩角膜基質(zhì)細(xì)胞[15]替代人角膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行研究。

注：A：細(xì)胞胞漿棕色著色(× 20)；B：細(xì)胞胞漿未見(jiàn)棕色著色(× 20)；C：細(xì)胞胞漿棕色著色(× 40)；D：細(xì)胞胞漿未見(jiàn)棕色著色(× 40)。圖3 波形蛋白免疫組化鑒定結(jié)果Note. A, The cytoplasm is stained brown (× 20). B, The cytoplasm is not stained brown (× 20). C, The cytoplasm is stained brown (× 40). D, The cytoplasm is not stained brown (× 40).Figure 3 Immunohistochemistrycal identification of vimentin

注：A：合并后的免疫熒光結(jié)果(× 20)；B：胞漿紅色熒光(× 20)；C：胞核藍(lán)色(× 20)；D：合并后的免疫熒光結(jié)果(× 40)；E：胞漿紅色熒光(× 40)；F：胞核藍(lán)色(× 40)。圖4 CSCs波形蛋白免疫熒光鑒定結(jié)果Note. A, Immunofluorescence results after merging colors (× 20). B, Cytoplasmic red fluorescence (× 20). C, Nuclear blue staining (× 20). D, Immunofluorescence results after merging colors (× 40). E, Cytoplasmic red fluorescence (× 40). F, Nudear blue staining (× 40).Figure 4 Vimentin in the CSCs identified by immunofluorescence staining

樹(shù)鼩角膜分為上皮層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層等5層。目前已經(jīng)成功在體外培養(yǎng)出樹(shù)鼩的角膜上皮細(xì)胞、角膜內(nèi)皮細(xì)胞，但樹(shù)鼩CSCs的原代培養(yǎng)國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道CSCs隨著年齡的遞增，每年約減少0.45%[16]，即年齡越小，CSCs的數(shù)量越多，因此實(shí)驗(yàn)中選用出生10～15 d的樹(shù)鼩為研究對(duì)象。目前國(guó)內(nèi)外培養(yǎng)原代CSCs常利用的方法包括2大類：組織塊貼壁法、酶消化等。酶消化法包括：膠原酶、胰酶、dispase-Ⅱ等將碎塊組織塊中的CSCs分散出來(lái)，獲得細(xì)胞懸液，加入細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在體外培養(yǎng)。本次實(shí)驗(yàn)中無(wú)菌條件下取下樹(shù)鼩眼球后，置于碘伏中，2 h內(nèi)取下角膜片，將角膜內(nèi)皮層連同后彈力層一起撕下，撕內(nèi)皮層時(shí)，沿著基質(zhì)層邊緣慢慢撕，動(dòng)作盡量輕柔；僅保留角膜基質(zhì)層，輕輕用角膜剪剪碎角膜基質(zhì)層，使組織與膠原酶充分接觸。胎牛血清FBS不僅可以為細(xì)胞提供必需的營(yíng)養(yǎng)因子、激素、促進(jìn)貼壁等，還能減緩、終止酶的消化。實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞第一次傳代前都是使用20%的FBS，因?yàn)镃SCs突然從原來(lái)的微環(huán)境中分離出來(lái)，需要攝取更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)恢復(fù)細(xì)胞活力，第一次傳代后改用10%的FBS即可。研究表明角膜基質(zhì)細(xì)胞的表型在體外易改變，如TGF-β、NGF、EGF、PDGF、維生素等[11-19]可以顯著促進(jìn)CSCs的有絲分裂和遷移，提高細(xì)胞密度，加快CSCs體外培養(yǎng)的速度，但會(huì)不同程度的改變基質(zhì)細(xì)胞的表型。但研究表明ITS[20]能維持角膜基質(zhì)細(xì)胞的表型、形態(tài)以及角蛋白和醛脫氫酶(Aldehyde dehydrogenase,ALDH)的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)其增值，因此僅添加了1%的ITS，血清、DMEM-F12、雙抗組成的基礎(chǔ)培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)中使用的24孔板提前用多聚賴氨酸處理，能促進(jìn)細(xì)胞的貼壁；使用Ⅱ型膠原酶分離消化在實(shí)驗(yàn)中探索發(fā)現(xiàn)，無(wú)需精確的消化時(shí)間，在實(shí)驗(yàn)中探索發(fā)現(xiàn)，用1%的Ⅱ型膠原酶消化CSCs 1～1.5 h均可，消化完在倒置顯微鏡下即可見(jiàn)圓形、透亮的細(xì)胞；在第2天即可見(jiàn)CSCs貼壁，長(zhǎng)滿24孔板需要5 d左右，但傳代后，細(xì)胞增值快，僅需要2～3 d，且細(xì)胞純化，無(wú)其它雜細(xì)胞。雙酶消化法獲取的CSCs數(shù)量較膠原酶消化法少，細(xì)胞傳代需要的時(shí)間長(zhǎng)。雖然2種方法都可培養(yǎng)出CSCs，但改良后的膠原酶法更為簡(jiǎn)單，節(jié)約時(shí)間及經(jīng)費(fèi)，且獲得的P0代CSCs更多，鋪滿培養(yǎng)瓶的時(shí)間更短。對(duì)凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，細(xì)胞狀態(tài)好，增殖能力強(qiáng)，2 d后即可鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶。角膜基質(zhì)細(xì)胞的鑒定目前沒(méi)有特異性的方法，主要是根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)，即由角膜基質(zhì)片培養(yǎng)出的細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察呈典型的梭形，波形蛋白陽(yáng)性表達(dá)。波形蛋白是重要的細(xì)胞骨架成分[21-22]，主要在來(lái)源于胚層起源的細(xì)胞中表達(dá),如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞等，但內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)為多邊形，因此可以排除。根據(jù)以上結(jié)果，可鑒定是角膜基質(zhì)細(xì)胞。

用改良膠原酶消化法培養(yǎng)出的CSCs，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，分離基質(zhì)細(xì)胞容易、酶消化控制的時(shí)間易掌握，細(xì)胞消化、傳代時(shí)分布均勻，細(xì)胞培養(yǎng)液中僅添加了ITS,不需單獨(dú)添加另外的生長(zhǎng)因子等，能節(jié)約經(jīng)費(fèi)，是一種快速、易行的獲得樹(shù)鼩CSCs的方法。 在后期的研究中，將進(jìn)一步優(yōu)化角膜基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)條件，用較少的組織培養(yǎng)出角膜基質(zhì)細(xì)胞，為角膜組織工程的研究發(fā)展做出貢獻(xiàn)，本研究作為體外進(jìn)行角膜前板層移植的前期研究，以期能爭(zhēng)取早日解決角膜植片匱乏問(wèn)題。