郭艷萍， 盧圣玉， 許志國， 曹 娜， 孫鵬杰， 侯 健

(太原工業(yè)學(xué)院環(huán)境與安全工程系，山西 太原 030008)

引 言

葡萄酵素是以葡萄為原料，經(jīng)過多菌種復(fù)合型微生物群體發(fā)酵制得的可食用的液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品[1]。研究表明，天然酵素因其含有豐富的有機(jī)酸、功效酶、維生素和礦物質(zhì)而具有較強(qiáng)的抗氧化性能[2]，可美容養(yǎng)顏、抑菌消炎、提高免疫力[3]。黑雞心葡萄是山西特有葡萄品種之一[4]，色澤黑紫，果粒密實(shí)，形似雞心，但其口感偏澀，種植率大幅度降低，需改變其食用方式，達(dá)到保種目的，制成酵素后口感改善，種植率緩慢提升。

本研究對(duì)天然發(fā)酵生產(chǎn)的黑雞心葡萄酵素的總酚含量、還原力、DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基和超氧自由基清除率進(jìn)行了測(cè)定,旨在為黑雞心葡萄天然酵素的生產(chǎn)工藝改良提供一定的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

pH儀、電子天平、752N型紫外可見分光光度計(jì)、TGL-16G-C高速冷凍離心機(jī)、SW-C1-IPD-Z型潔凈工作臺(tái)、電熱恒溫水浴鍋。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵素的制備[5]

冰糖紫外殺菌30 min，與葡萄按質(zhì)量比1∶1加入到已滅菌的玻璃瓶中，封口，常溫下發(fā)酵。發(fā)酵過程中，每6 d為一階段取樣，樣品10 000 r/min離心10 min后，用于測(cè)定。

1.2.2 總酚含量測(cè)定[6]

以沒食子酸等價(jià)物表示，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程y=0.092 0x+0.020 8，R2=0.999 9測(cè)定總酚含量，y為吸光度，x為樣品濃度(GAE,μg)。樣品100 μL、去離子水45.9 mL，F(xiàn)olin-Ciocalteau試劑1 mL，反應(yīng)5 min，最后，加入20%的Na2CO3溶液3 mL，以去離子水為參比于760 nm波長下測(cè)吸光度。

1.2.3 DPPH·清除率

40 μL酵素樣品加入到4 mL 0.1 mmol/L DPPH自由基溶液中，再加Tris-Hcl buffer(50 mmol/L,pH=7.4)450 μL，25 ℃振蕩混勻后于517 nm波長下測(cè)吸光度。

1.2.4 ABTS自由基清除能力[7]

10 μL酵素樣品加入到5 mL ABTS母液中，30 ℃水浴5 min后于734 nm下測(cè)定吸光度。

1.2.5 ·OH清除能力

水楊酸法[7]：酵素樣品135 μL加入到1.4 mL H2O2(6 mmol/L)，再加入2 mL硫酸亞鐵(1.5 mmol/L)和0.6 mL水楊酸鈉(20 mmol/L)，25 ℃水浴1 h后于562 nm下測(cè)定吸光度，其清除率計(jì)算見式(1)。

清除率(%)=[1-(A562-Ai)/Ac]×100

(1)

式中：Ac為空白對(duì)照的吸光度值。

鄰苯三酚法[8]反應(yīng)體系：50 μL樣品、950 μL磷酸緩沖液(0.1 mol/L,pH=7.4)，1 mL NADH、1 mL NBT、1 mL PMS。25 ℃恒溫反應(yīng)5 min后于560 nm下測(cè)吸光度。

1.2.7 還原力測(cè)定

普魯士藍(lán)法[9]。反應(yīng)體系：30 μL樣品，2.5 mL磷酸緩沖液(0.2 mol/L，pH=6.6)，2.5 mL 1%鐵氰化鉀，50 ℃反應(yīng)30 min，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸，4 000 r/min下離心10 min，取2.5 mL上清液，加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵。700 nm下測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄酵素總酚含量的測(cè)定

由圖1可看出，葡萄酵素在發(fā)酵初期0 d～12 d總酚含量緩慢上升，12 d～18 d含量有較大降幅，之后，總酚含量呈逐步上升趨勢(shì)，至36 d總酚含量達(dá)到最大值2.850 mg/mL，之后趨于平穩(wěn)。酚類物質(zhì)含量隨著發(fā)酵過程中有益生菌的增加而增多，當(dāng)菌群達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)酚類物質(zhì)溶出速率平穩(wěn)。

圖1 發(fā)酵過程中總酚含量的變化

2.2 葡萄酵素對(duì)DPPH·清除能力

由圖2可看出，葡萄酵素對(duì)DPPH·的清除能力展示出與發(fā)酵過程中總酚含量(圖1)變化趨勢(shì)一致，但變化幅度較小。清除能力總體較強(qiáng)，峰值出現(xiàn)在第30 d，清除率達(dá)到93.25%，較初始增加了6.80%。葡萄酵素對(duì)自由基的清除率主要原于發(fā)酵過程中酚類物質(zhì)的溶出，展現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。

圖2 發(fā)酵過程中DPPH自由基清除能力的變化

2.3 葡萄酵素對(duì)超氧自由基清除能力

圖3 發(fā)酵過程中超氧自由基清除能力的變化

2.4 葡萄酵素對(duì)羥基自由基(·OH)清除能力

·OH是生物體內(nèi)最活潑的自由基，毒性強(qiáng)、高損傷性，可損傷細(xì)胞膜，輕易地進(jìn)入各種細(xì)胞中，導(dǎo)致疾病發(fā)生。

圖4顯示，葡萄酵素對(duì)·OH的清除能力相對(duì)于其他自由基的清除能力較低，比未發(fā)酵時(shí)增加了4.13%。發(fā)酵初期，葡萄酵素對(duì)·OH的清除能力呈大幅減弱，之后緩慢回升，在42 d時(shí)達(dá)到62.16%。

圖4 發(fā)酵過程中羥基自由基清除能力的變化

2.5 葡萄酵素對(duì)ABTS自由基清除能力

圖5顯示，發(fā)酵過程中葡萄酵素對(duì)ABTS自由基的清除能力呈小幅波浪形變化，但整體清除率較高，發(fā)酵30 d時(shí)出現(xiàn)最大值88.20%，增幅13%左右。

圖5 發(fā)酵過程中ABTS自由基清除能力的變化

2.6 葡萄酵素發(fā)酵過程中還原力的變化

第3頁圖6顯示，葡萄酵素在發(fā)酵過程中還原力變化波動(dòng)較大，初期持續(xù)上升而后驟降，24 d達(dá)到最低值后緩慢回升。18 d時(shí)達(dá)到峰值，發(fā)酵前、后還原力增加了80.41%?？傮w呈上升趨勢(shì)，說明酵素在發(fā)酵過程中抗氧化成分是有所增加的。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，以山西黑雞心葡萄為原料，經(jīng)過多種微生物復(fù)合發(fā)酵制得的黑雞心葡萄酵素抗氧化性能較強(qiáng)，發(fā)酵生產(chǎn)30 d的酵素抗氧化能力最強(qiáng)。發(fā)酵過程中自由基清除能力均呈逐漸增加趨勢(shì)，發(fā)酵

圖6 發(fā)酵過程中還原力的變化

前、后分別提高了6.84%和6.80%、4.13%和13%。還原力變化雖不規(guī)則，但總體呈上升趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)，黑雞心葡萄天然酵素對(duì)4種自由基的清除能力與總酚含量的變化呈相同趨勢(shì)，具有一定相關(guān)性。本研究結(jié)果為黑雞心葡萄酵素的工藝改良提供一定的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。