高曉月 范維 陳淑敏 李瑩瑩 王守偉 郭文萍

摘 要：以微生物顯色為原理，建立一種對畜禽肉中單一或配伍使用的抗生素進行聯(lián)合初篩的高通量方法，并用色譜法對陽性樣品進行驗證。以大腸埃希氏菌（Escherichia coli，CICC 23657）作為指示菌，選取適當?shù)目股貧埩籼崛》椒?，并通過單因素試驗優(yōu)化檢測液配方及檢測體系組成，最終實現(xiàn)對不同類別抗生素的聯(lián)合檢測。結(jié)果表明：選取檸檬酸-丙酮緩沖液進行提取，提取效率達到86%～88%，相對標準偏差為3.9%～4.3%;蛋白胨添加量為1.0 g/100 mL、溴甲酚紫指示劑添加量為2.0 mg/100 mL、pH值為7.2時，檢測液顯色效果較好;菌懸液初始吸光度（A600 nm）為0.4，檢測液、菌液、樣品提取液體積為150 μL∶50 μL∶100 μL時，檢測效果最佳，對畜禽肉中喹諾酮類抗生素的檢出限為60～180 μg/kg，氨基糖苷類檢出限為60～140 μg/kg，喹諾酮類與氨基糖苷類配伍使用時的檢出限為40～180 μg/kg;進一步用色譜法對50 份樣品的初篩結(jié)果進行驗證，無假陰性樣品存在，說明該方法可用于畜禽肉中抗生素殘留的初篩。

關鍵詞：微生物顯色法;畜禽肉;抗生素殘留;高通量

Abstract： A new microbial chromogenic assay was developed for high throughput screening for single and compatible combinations of antibiotic residues in livestock and poultry meat， and it was validated by liquid chromatography （LC）. Escherichia coli was used as the indicator strain to detect a variety of antibiotics simultaneously. The optimal extraction conditions were determined and the reaction system and conditions were optimized by one-factor-at-a-time method. The results showed that citric acid-acetone mixture was the solvent of choice for the extraction procedure， giving an extraction efficiency of 86%–88% with a relative standard deviation ranging from 3.9% to 4.3%. Addition of 1.0 g/100 mL of peptone and?2.0 mg/100 mL of bromocresol purple and pH adjustment to 7.2 were found to be the optimal conditions for chromogenic reaction. The optimal detection conditions were as follows： initial absorbance value （A600 nm） of bacterial suspension 0.4， and ratio of reaction system to bacterial suspension to sample extract 150：50：100 （V/V）. The limit of detection of the proposed method was 60–180， 60–140 and 40–180 μg/kg for quinolones， aminoglycosides and their combinations in livestock and poultry meat， respectively. For 50 positive samples with antibiotic residue determined by the microbial chromogenic assay， no false negative results were obtained.? Thus this assay can be used in screening for antibiotic residues in livestock and poultry meat.

Keywords： microbial chromogenic assay; livestock and poultry meat; antibiotic residues; high-throughput

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190222-032

中圖分類號：TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2019）04-0036-06

喹諾酮類抗生素是一類廣譜抗生素，在畜禽獸藥中得到廣泛應用[1-3]，用于預防和治療動物疾病或微生物污染以及作為膳食補充劑[4-6]。相關研究[7-8]表明，畜禽肉中喹諾酮類和氨基糖苷類抗生素的殘留率較高，這主要是因為國內(nèi)養(yǎng)殖業(yè)為了縮短療程，降低藥物毒副作用，減少致病菌耐藥情況發(fā)生，常常把氨基糖苷類等抗生素與其配伍使用，這無形中加大了抗生素殘留檢測的難度，尋求高通量檢測方法將成為未來發(fā)展的主要方向[9-11]?？股貧埩舻臋z測方法包括微生物檢測法、免疫分析法和色譜法[12-14]。在這3 類方法中，色譜法和免疫分析法具有靈敏性強、準確度高等特點，但是均存在檢測具有單一性、實驗室設備投入大和對技術人員要求高等問題[15-17]，不能滿足高通量、快速檢測的發(fā)展需要。相較于以上2 種方法，微生物檢測法在應用中具有操作便捷、成本較低、有廣泛篩查性的特點[18-20]，可作為一種高通量初篩方法用于畜禽肉中抗生素殘留的檢測，在中小型禽畜肉養(yǎng)殖加工企業(yè)中具有良好的推廣前景。

目前，在我國微生物顯色法主要采用嗜熱脂肪芽孢桿菌[21-23]、蠟樣芽孢桿菌[24]等作為指示菌對原料乳中殘留的青霉素類抗生素進行檢測，在畜禽肉中應用較少[25-27]，主要原因有兩點：一是由于畜禽肉的體系較復雜，抗生素提取存在困難;二是由于現(xiàn)有指示菌對禽畜肉中常見的喹諾酮類抗生素不敏感。因此，本研究針對以上技術難題選擇大腸埃希氏菌為指示菌[28-29]，開發(fā)適合畜禽肉中抗生素殘留檢測的提取方法，并優(yōu)化檢測液配方及檢測體系組成，建立一種可同時對畜禽肉中喹諾酮類及常與其配伍使用的氨基糖苷類抗生素進行聯(lián)合初篩的高通量方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與樣品

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供、菌號為CICC 23657的標準菌株;禽畜肉購自農(nóng)貿(mào)市場。

1.1.2 試劑

喹諾酮類：恩諾沙星、環(huán)丙沙星、司帕沙星、麻保沙星、達氟沙星、氟甲喹、二氟沙星;氨基糖苷類：慶大霉素、鏈霉素、新霉素、安普霉素、丁胺卡那霉素標準品 美國Sigma公司;蛋白胨、牛肉浸膏、葡萄糖、溴甲酚紫指示劑、營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（violt red bile agar，VRBA） 北京陸橋技術有限責任公司;其他試劑為分析純或色譜純。

1.2 儀器與設備

ESJ120-4電子天平 龍騰儀器有限公司;PHSJ-4A實驗室pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;UltiMate 3000高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配備電噴霧離子源）、1510-07269C酶標儀 美國Thermo公司;BPC-150F培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;KDC-140HR離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

1.3.1.1 溶液配制

標準工作液的配制：準確量取各抗生素標準儲備液，用去離子水稀釋成適當濃度的標準工作液。

混合標準工作液的配制：準確量取各抗生素標準儲備液，兩兩等體積混合，用去離子水稀釋成適當濃度的混合標準工作液。

檸檬酸-丙酮緩沖溶液的配制：將0.2 mol/L檸檬酸溶液和0.5 mol/L氫氧化鉀溶液等體積混合，向35 mL混合液中加入35 mL丙酮和30 mL蒸餾水，充分混勻。

檸檬酸-乙醇緩沖溶液的配制：將0.2 mol/L檸檬酸溶液和0.5 mol/L氫氧化鉀溶液等體積混合，向35 mL混合液中加入35 mL乙醇和30 mL蒸餾水，充分混勻。

檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液的配制：將0.2 mol/L磷酸氫二鈉16.47 mL、0.1 mol/L檸檬酸3.53 mL充分混勻。

1.3.1.2 樣液提取

取3 個50 mL離心管，分別加入10 g均質(zhì)好的肌肉組織樣品，再向各管中分別加入20 mL檸檬酸-丙酮緩沖溶液、20 mL檸檬酸-乙醇緩沖溶液和20 mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，用漩渦振蕩器振蕩3 min，充分振蕩后于70～75 ℃水浴20 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液作為樣液。

1.3.1.3 提取液的選擇

對3 種提取液（檸檬酸-丙酮緩沖溶液、檸檬酸-乙醇緩沖溶液和檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液）的蛋白沉淀效果進行比較，并將各上清液進行色譜法測定，確定不同提取液中各類抗生素的提取效率，最終選取適宜的抗生素提取液。

1.3.2 檢測液配方優(yōu)化

檢測液配制方法為：蛋白胨0.5～2.0 g、溴甲酚紫指示劑2.0～8.0 mg、葡萄糖1.0 g、NaCl 0.5 g、牛肉浸膏0.3 g、加水定容至100 mL，pH值調(diào)至6.8～7.4，加熱煮沸至完全溶解，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.3.2.1 反應變色時間及指示菌菌落總數(shù)的確定

按檢測液∶菌懸液∶生理鹽水體積比3∶1∶2的比例進行混合后，于36 ℃恒溫培養(yǎng)，確定變色（檢測液由紫紅色變黃色）時間。之后取1 mL進行梯度稀釋，選擇適宜的稀釋度，傾注于平皿中，倒入VRBA液體培養(yǎng)基，充分混勻，待瓊脂凝固后，再加入3～4 mL VRBA覆蓋平皿表層，翻轉(zhuǎn)平板，置于36 ℃培養(yǎng)24 h后計數(shù)，確定指示菌生長情況。

1.3.2.2 蛋白胨添加量的確定

在100 mL檢測液中分別加入0.5、1.0、1.5、2.0 g的蛋白胨，滅菌冷卻后按照1.3.2.1節(jié)的方法進行變色時間和菌落總數(shù)測定，選取蛋白胨的最佳加入量。

1.3.2.3 溴甲酚紫添加量的確定

分別取2.0、4.0、6.0、8.0 mg溴甲酚紫指示劑添加到100 mL檢測液中，按照1.3.2.1節(jié)的方法進行實驗，選取指示劑的最佳加入量。

1.3.2.4 檢測液初始pH值的確定

將檢測液初始pH值分別調(diào)為6.8、7.0、7.2、7.4，按照1.3.2.1節(jié)的方法進行變色時間和菌落總數(shù)測定，從而選取最適的檢測液初始pH值。

1.3.3 菌懸液初始吸光度測定和檢測體系組成的確定

無菌狀態(tài)下，挑取已培養(yǎng)好的指示菌菌落接入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，配制成不同初始吸光度（A600 nm）的菌懸液，其吸光度分別為0.1、0.4、0.6、0.8、1.0，加入到以下3 組體系中，體系比例如表1所示，于36 ℃恒溫培養(yǎng)，確定各組檢測液的變色時間。選擇變色時間較短的檢測體系組成，將體系中的生理鹽水換成等體積的0.1 μg/mL環(huán)丙沙星標準溶液或環(huán)丙沙星與鏈霉素混合標準溶液，于同一溫度下恒溫培養(yǎng)，進行抗生素敏感性驗證實驗，觀察變色情況，選出檢測液仍呈紫色組，最終確定最適的菌懸液初始吸光度及檢測體系組成。

1.3.4 微生物顯色法檢測

按樣品數(shù)取出所需數(shù)量的微孔板，將樣品和對照組對應微孔按序編號，每個樣品和對照做2 孔平行。按照1.3.3節(jié)優(yōu)化的比例，向各微孔中依次加入檢測液和菌懸液，再按照編號向各微孔中加入陽性對照（不同抗生素標準液）、陰性對照（無抗生素殘留的肉提取液）、空白對照（生理鹽水）及樣液，于36 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察變色情況。當陰性對照孔變成黃色時，觀察其他樣品孔顏色變化。

1.3.5 抗生素檢出限的確定

1.3.5.1 單標檢出限確定

用去離子水對12 種標準儲備液進行梯度稀釋，稀釋成10 個梯度。按上述微生物法進行檢測，確定各種抗生素的檢出限。

1.3.5.2 聯(lián)用檢出限確定

對常配伍使用的喹諾酮類和氨基糖苷類抗生素進行混合，使2 種抗生素在混合體系中的終質(zhì)量濃度均為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 μg/mL，具體如表2所示。按上述微生物法進行檢測，確定各種聯(lián)用抗生素檢出限。

1.3.6 樣品的測定

將50 份樣品按照1～50進行編號，為保證一定的陽性檢出比例，部分樣品采用人工添加的方式。用微生物顯色法進行測試，結(jié)果用色譜法進行驗證。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)和繪圖均采用Origin 8.0數(shù)據(jù)分析軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素提取液的確定

通過觀察3 種提取液的蛋白沉淀效果發(fā)現(xiàn)，檸檬酸-丙酮緩沖溶液沉淀蛋白效果較好，上清液呈無色澄清狀，其他2 種提取液處理的樣品上清液呈微紅色，并有少許殘渣存在。取上清液進行色譜法檢測，由表3可知，檸檬酸-丙酮緩沖溶液的提取率及穩(wěn)定性均較高，因此，選擇檸檬酸-丙酮緩沖溶液作為提取液。

2.2 檢測液配方優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 蛋白胨添加量的確定結(jié)果

由圖1可知，隨著蛋白胨添加量的增加，菌落總數(shù)呈先升高后下降的趨勢，這與劉冬梅等[30]的研究結(jié)果相似。當?shù)鞍纂颂砑恿繛?.0 g/100 mL時，菌落總數(shù)對數(shù)值最高，達7.81 （lg（CFU/mL）），之后隨著蛋白胨添加量的提高，培養(yǎng)基的pH值降低，從而影響了菌種的生長繁殖。從反應時間上看，菌落總數(shù)越高，檢測液變色時間相對越短，這主要是由于較高濃度的指示菌產(chǎn)酸較多，使指示劑變色較快。因此選擇蛋白胨添加量為1.0 g/100 mL。

2.2.2 溴甲酚紫添加量的確定結(jié)果

由圖2可知：當溴甲酚紫指示劑的添加量為2.0、4.0 mg/100 mL時，檢測液的初始顏色呈紫色，反應終點顏色變成黃色，區(qū)分度明顯[31]，且反應時間可控制在4 h內(nèi);隨著溴甲酚紫指示劑添加量的提高，檢測液初始顏色呈紫黑色，終點顯色不明顯，且變色時間較長，因此選擇溴甲酚紫添加量為2.0 mg/100 mL。

2.2.3 檢測液初始pH值的確定結(jié)果

溴甲酚紫指示劑的變色范圍是pH值5.2～6.8，為了保證指示劑正常變色，將檢測液初始pH值設定為高于6.8。由圖3可知，當檢測液初始pH值為7.2時，菌落總數(shù)對數(shù)值達到最高，說明該pH值是指示菌生長的最適pH值。并且從反應時間可知，隨著檢測液初始pH值的升高，反應時間隨之延長，當pH值小于7.2時，反應時間可以控制在4 h內(nèi)。由于抗生素對微生物的抑制作用需要一定的反應時間[32]，為防止由于檢測液初始pH值設定過低，導致藥效沒產(chǎn)生之前指示菌的產(chǎn)酸量就使其變色，失去檢測意義，因此選擇最適檢測液初始pH值為7.2。

2.3 菌懸液初始吸光度和檢測體系組成的確定結(jié)果

用生理鹽水作為樣品提取液，確定菌懸液初始吸光度和檢測體系組成對檢測液變色時間的影響。由表4可知，當菌懸液初始吸光度不小于0.4時，B、C組均能在4 h內(nèi)變色。因此，用B、C 組檢測體系組成進行實驗時，反應時間較短。

由表5可知，對于抗生素敏感性來說，菌懸液初始吸光度大于0.4或加入體積為80 μL時，反應終點檢測液變?yōu)辄S色，抗生素對菌的抑制效果不明顯，達不到檢測目的。因此選擇菌懸液初始吸光度為0.4，檢測液∶菌液∶樣品提取液為150 μL∶50 μL∶100 μL時，檢測效果最佳。

2.4 抗生素的檢出限

按照1.3.5節(jié)的方法進行檢測，確定各抗生素的最小檢測濃度（顏色未發(fā)生變化時的抗生素標準液濃度）。由表6～7可知，本方法選擇的大腸埃希氏菌對喹諾酮類和氨基糖苷類抗生素均有較好抑制作用，其中喹諾酮類檢出限為60～180 μg/kg、氨基糖苷類檢出限為40～140 μg/kg，均低于我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定的動物性食品中獸藥最高殘留限量[33]，因此該法可以滿足喹諾酮類及氨基糖苷類抗生素初篩檢測的要求。

2.5 樣品測定結(jié)果

將50 份樣品用微生物顯色法進行測定，結(jié)果用色譜法進行驗證。由表8可知，采用微生物法測定時，共有15 個樣品檢出結(jié)果呈陽性，其中12 個陽性樣品人為添加了抗生素，其余3 個樣品經(jīng)過與色譜方法比對，發(fā)現(xiàn)是假陽性樣品。用色譜法對35 個呈陰性樣品進行驗證，沒有測出以上藥物殘留，說明該微生物顯色法無假陰性結(jié)果存在，結(jié)果較可靠。

3 結(jié) 論

以大腸埃希氏菌作為指示菌，選取檸檬酸-丙酮緩沖液作為提取液，通過單因素試驗優(yōu)化檢測液配方及檢測體系組成，選擇菌懸液初始吸光度為0.4，檢測液（蛋白胨含量1.0 g/100 mL、溴甲酚紫指示劑含量2.0 mg/100 mL、pH 7.2）∶菌液∶樣品提取液為150 μL∶50 μL∶100 μL進行實驗，之后用色譜法對陽性樣品進行驗證。優(yōu)化后的檢測方法可在3～4 h內(nèi)使指示劑變色（檢測液由紫變黃），顏色變化明顯，易用肉眼區(qū)分。該方法適用于畜禽肉中喹諾酮類、氨基糖苷類單獨或二者配伍使用時抗生素殘留的檢測，其檢出限均低于我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定的動物性食品中獸藥最高殘留限量，滿足初篩要求。用色譜法對微生物法測定結(jié)果呈陰性的35 個樣品進行復測，以上抗生素均未檢出，說明該方法測定準確性較高，沒有假陰性結(jié)果存在。本方法使用微孔板作為反應器，微孔可根據(jù)樣品數(shù)量自由獨立拆分，可同時對多個樣品進行檢測，不受樣品數(shù)量限制，便于操作者使用。此外，該方法所用試劑均以微升計，較傳統(tǒng)微生物法省時、省力，且重復性較好，無需大型儀器[34]，大大降低了檢測成本。因此，本研究建立的微生物顯色法可在中小型禽畜肉養(yǎng)殖加工企業(yè)中推廣，并可應用在農(nóng)產(chǎn)品安全監(jiān)管環(huán)節(jié)中。

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