周萍 李櫻紅 尹志紅 呂澤田 尹君 王靜 徐初

（1 杭州碧于天保健品有限公司，桐廬 311500；2 浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，杭州 310052；3 中國蜂產(chǎn)品協(xié)會(huì)蜂膠專業(yè)委員會(huì)，北京 100050）

蜂膠是工蜂采集膠源植物樹脂等分泌物與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的膠黏性物質(zhì)[1]。蜜蜂主要用蜂膠堵塞蜂巢縫隙，以防止有害細(xì)菌、病毒或真菌的入侵，保證蜂箱潔凈衛(wèi)生。蜂膠的化學(xué)成分復(fù)雜，含有多種活性物質(zhì)，其功效成分主要為黃酮類、酸類、酯類化合物等[2]?！吨腥A人民共和國藥典》（2015年版一部）載明蜂膠補(bǔ)虛弱，化濁脂，止消渴；外用解毒消腫，收斂生?。挥糜隗w虛早衰，高脂血癥，消渴；外治皮膚皸裂，燒燙傷[3]。蜂膠憑借獨(dú)特的醫(yī)療保健作用，正越來越受到消費(fèi)者的青睞。蜂膠的活性成分和安全性已成為研究熱點(diǎn)。

氯霉素（CAP）是一種廣譜抗生素，是預(yù)防和治療蜜蜂細(xì)菌性疾?。乐抻紫x腐臭病、歐洲幼蟲腐臭病等）的有效藥物。然而，氯霉素易在蜂產(chǎn)品中殘留，人們食用后會(huì)引起粒細(xì)胞缺乏病、再生障礙性貧血等[4]，美國、日本等許多國家和歐盟都禁止氯霉素在動(dòng)物源性食品中檢出。中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第193號(hào)公告中明確指出，氯霉素禁用于所有食品動(dòng)物。為了保證國內(nèi)消費(fèi)市場(chǎng)和進(jìn)出口市場(chǎng)中蜂產(chǎn)品的質(zhì)量，亟須開發(fā)方便有效的檢測(cè)蜂產(chǎn)品中氯霉素殘留的方法，以提高蜂產(chǎn)品的質(zhì)量。

目前關(guān)于蜂蜜和蜂王漿中氯霉素檢測(cè)方法的報(bào)道比較多，主要有高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5-8]、氣相色譜 - 質(zhì)譜法[9，10]、酶聯(lián)免疫法[11，12]等。然而，目前，尚無蜂膠中氯霉素殘留量檢測(cè)的國家標(biāo)準(zhǔn)，已報(bào)道的蜂膠中氯霉素檢測(cè)方法主要集中在高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-15]。其中，周萍等[14]首次報(bào)道了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)蜂膠中的氯霉素殘留，為蜂膠企業(yè)提供了氯霉素的內(nèi)控檢測(cè)方法，楊黎等[15]報(bào)道了以蜂膠為主要原料的保健食品中氯霉素殘留的檢測(cè)方法，為蜂膠制品中氯霉素殘留分析提供了思路。然而，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)儀器要求較高，短時(shí)間內(nèi)無法在蜂產(chǎn)品企業(yè)中普及應(yīng)用，而膠體金免疫層析法[16-18]具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，也不需要復(fù)雜的儀器，能在短短幾小時(shí)內(nèi)檢測(cè)幾十到幾百個(gè)樣品，可適用于大規(guī)?？焖贆z測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控產(chǎn)品中藥物殘留。

由于蜂膠的成分與蜂蜜、蜂王漿有很大差別，基質(zhì)更加復(fù)雜，本文通過合適的前處理手段，首次建立了膠體金免疫層析法快速測(cè)定蜂膠及蜂膠乙醇提取物中氯霉素殘留的檢測(cè)方法，可指導(dǎo)蜂農(nóng)對(duì)生產(chǎn)的蜂膠原料進(jìn)行質(zhì)量控制，為蜂膠收購者提供蜂膠原料或者蜂膠提取物中氯霉素殘留量的快速監(jiān)測(cè)與篩查，從而保證蜂膠源頭的品質(zhì)，進(jìn)而保證蜂膠制品的品質(zhì)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Sartorius BS224S電子天平（德國賽多利斯公司），Philips HR2100/40攪拌機(jī)（飛利浦（中國）投資有限公司），Philips HP8260電吹風(fēng)機(jī)（飛利浦（中國）投資有限公司）。

氯霉素（chloramphenicol，CAS：56-75-7，純度＞99.9%）購自美國Sigma-Aldrich公司，乙腈為色譜純（德國Merck公司），氫氧化鈉、高氯酸、氯化鈉、乙酸乙酯、正己烷等均為分析純，水為娃哈哈純凈水或相當(dāng)者，CAP-203氯霉素免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板購自杭州南開日新生物技術(shù)公司。

蜂膠和蜂膠乙醇提取物由中國蜂產(chǎn)品協(xié)會(huì)蜂膠專業(yè)委員會(huì)提供。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用乙腈定容至10ml，混勻，于-18℃冰箱保存，可保存24個(gè)月。

1.2.2 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液

吸取適量1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈稀釋成濃度為0.1μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)中間液，于4℃冰箱保存，可保存6個(gè)月。

1.2.3 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)使用液

臨用時(shí)吸取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液100μl，用娃哈哈純凈水稀釋定容至10ml，混勻，即得濃度為1μg/l的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.3 樣品制備

取蜂膠原料適量于攪拌機(jī)塑料杯中，粉碎30s，取下塑料杯，混合一次繼續(xù)粉碎30s，如此3～5次，取砂粒狀較細(xì)的物料用于檢測(cè)。當(dāng)膠含量大于30%時(shí)，需要冷藏2h再進(jìn)行粉碎。

1.4 樣品處理

向50ml塑料離心管中加入8ml蜂膠溶解液A（5%氫氧化鈉溶液）和8ml水，混合均勻，稱入蜂膠原料4g（或蜂膠乙醇提取物稱取3g），擰緊瓶蓋，在掌心上輕輕拍打5min，使蜂膠溶解，加入蜂膠沉淀劑B（20%高氯酸溶液），用力震搖1min，過濾，收集全部濾液。加入0.25ml堿化劑C（80%氫氧化鈉溶液），混合均勻，加入16ml乙酸乙酯，充分振蕩1min，靜置2～5min，吸取上層清液于蒸發(fā)皿中，用電吹風(fēng)機(jī)吹干。加入4ml 1mol/l氯化鈉水溶液（含5%（V/V）乙醇）使溶解，加4ml乙酸乙酯，充分振蕩1min，靜置2～5min，吸取上層清液于蒸發(fā)皿中，用電吹風(fēng)機(jī)吹干，加入5滴復(fù)溶液（氯霉素免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板自帶）反復(fù)吹吸蒸發(fā)皿上的殘?jiān)?，直到全部溶解。加?ml正己烷，反復(fù)吹吸樣液和正己烷，靜置分層2min，樣液層待測(cè)定。

1.5 測(cè)定

1.5.1 具體操作

取出氯霉素免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板，置于水平臺(tái)面上，直至恢復(fù)至室溫。吸取“1.4”中蒸發(fā)皿里的全部樣液層，加至加樣孔中，在10min后目測(cè)讀取結(jié)果。

1.5.2 空白對(duì)照

每批樣品需做一孔空白對(duì)照，以復(fù)溶液代替試樣提取液，按“1.5.1”進(jìn)行。

1.5.3 平行測(cè)定

設(shè)定每個(gè)樣品的平行樣數(shù)量≥2，各自按“1.4”和“1.5.1”進(jìn)行。

1.5.4 檢測(cè)限試驗(yàn)

稱取陰性蜂膠原料樣品4g（或蜂膠乙醇提取物稱取3g），加入1μg/l的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)使用液400μl（蜂膠乙醇提取物樣品則加600μl），相當(dāng)于添加量水平蜂膠原料為0.1μg/kg，蜂膠乙醇提取物為 0.2μg/kg。

注：不同試劑板制造商的產(chǎn)品組成和操作會(huì)有細(xì)微的差別，應(yīng)嚴(yán)格按說明書要求規(guī)范操作。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品凈化方法優(yōu)化

蜂膠溶解液A用于溶解蜂膠中氯霉素和其他水溶性活性物質(zhì)，蜂膠沉淀劑B用于沉淀蜂膠中的樹脂類、蜂蠟等雜質(zhì)。過濾時(shí)，蜂膠原料樣品和蜂膠提取物樣品的過濾時(shí)間因樣品不同略有差異。由于不同來源的蜂膠樣品差異較大，過濾后的樣品或澄清或不澄清，這是因?yàn)榉淠z原料中存在某些蛋白質(zhì)、膠體、雜質(zhì)，不影響后續(xù)操作。

濾液中加入堿化劑后，其有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、膠體、酚類、黃酮類化合物形成鹽類，此時(shí)加入乙酸乙酯振蕩，可充分提取氯霉素。由于乙酸乙酯微溶于水，振蕩時(shí)可能使樣液乳化，影響分層效果。經(jīng)過多次預(yù)試驗(yàn)，加入16ml乙酸乙酯可充分保證提取和分層效果，故乙酸乙酯添加量確定為16ml。在靜置時(shí)管壁可能粘附有樣液，吸取乙酸乙酯層時(shí)易被誤吸入，此時(shí)，可以用手輕敲管壁，管壁振動(dòng)使樣液自然落下，再靜置幾分鐘即可吸取乙酸乙酯層。

將乙酸乙酯提取液置于90cm蒸發(fā)皿中，用電吹風(fēng)機(jī)吹干。一般膠體金快速檢測(cè)方法推薦的乙酸乙酯層吹干方法是將液體置于窄口的離心管中，由于管口較窄，不利于熱風(fēng)進(jìn)入，也不利于乙酸乙酯揮發(fā)，比較耗時(shí)。本方法將乙酸乙酯層置于敞口的蒸發(fā)皿中，方便吹干，實(shí)踐表明吹干時(shí)間平均為6min，速度非?？臁?/p>

蒸發(fā)皿中的殘?jiān)恍璧渭?.16ml氯霉素復(fù)溶液就可以溶解，具體操作時(shí)用1ml滴管滴加5滴氯霉素復(fù)溶液，先沖洗浸潤然后用滴管反復(fù)吹吸殘留物，浸潤過的殘留物很容易被溶解在復(fù)溶液中。最后，將滴管頭部浸在復(fù)溶液中，復(fù)溶液會(huì)全部虹吸到滴管中，全部滴加到氯霉素免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板的加樣孔中即可檢測(cè)。

為了降低方法的檢測(cè)限，本方法增加了鹽析凈化過程，大幅度降低了雜質(zhì)水平，減少干擾，從而降低了本方法的檢測(cè)限。

2.2 結(jié)果及表述

結(jié)果判讀見圖1。

無效：如空白對(duì)照控制線（C線）不出現(xiàn)紅色條帶，說明檢測(cè)試劑板失效或操作不當(dāng)，為無效結(jié)果，不能進(jìn)行檢測(cè)。

陰性：試樣檢測(cè)線（T線）出現(xiàn)紅色條帶，且顏色比控制線（C線）深或一樣深，結(jié)果為陰性（蜂膠原料氯霉素殘留量＜0.1μg/kg，蜂膠乙醇提取物＜0.2μg/kg）。

圖1 結(jié)果示意圖

陽性：試樣檢測(cè)線（T線）出現(xiàn)紅色條帶，但顏色比控制線（C線）淺或檢測(cè)線（T線）未出現(xiàn)紅色條帶，結(jié)果為陽性（蜂膠原料氯霉素殘留量≥0.1μg/kg，蜂膠乙醇提取物≥0.2μg/kg）。

2.3 檢測(cè)限與回收率

分別取0.3μg/l、1μg/l濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液5滴點(diǎn)到試劑板樣品孔中，5min后目測(cè)，0.3μg/l標(biāo)準(zhǔn)溶液的C線比T線的顏色淺，1μg/l標(biāo)準(zhǔn)溶液的C線比T線的顏色明顯更深，所以，試劑板檢測(cè)氯霉素的靈敏度是1μg/l。

取陰性蜂膠原料樣品，分別加入0.1μg/kg和0.2μg/kg添加水平的氯霉素，按本方法檢驗(yàn)，0.1μg/kg、0.2μg/kg添加時(shí)均可得到陽性結(jié)果。取陰性蜂膠乙醇提取物樣品，分別加入0.1μg/kg和0.2μg/kg添加水平的氯霉素，按本方法檢驗(yàn)，0.1μg/kg的C線比T線的顏色不能更深，0.2μg/kg添加時(shí)可得到陽性結(jié)果。由此可見，本方法蜂膠原料檢測(cè)限為0.1μg/kg，蜂膠乙醇提取物檢測(cè)限為0.2μg/kg。

按蜂膠原料中乙醇提取物含量為30%計(jì)，在本方法檢測(cè)限以下的蜂膠原料，加工成提取物時(shí)，氯霉素殘留最高值0.3μg/kg，蜂膠制品中的蜂膠乙醇提取物含量為30%時(shí)，可滿足限量0.1μg/kg的要求。蜂膠乙醇提取物檢測(cè)限為0.2μg/kg，蜂膠制品中的蜂膠乙醇提取物含量為50%時(shí)，可滿足限量0.1μg/kg的要求。

2.4 與質(zhì)譜結(jié)果的一致性驗(yàn)證

取28份蜂膠樣品，分別采用本文的膠體金免疫層析法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14]進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表1。由表中可見，膠體金免疫層析法的結(jié)果與液質(zhì)確證結(jié)果一致，假陽性率和假陰性率均為0%，說明方法準(zhǔn)確可行。

從數(shù)據(jù)上看，采用本文的膠體金免疫層析法檢測(cè)到8個(gè)陰性樣品，說明均在檢測(cè)限以下，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)結(jié)果均為＜0.1μg/kg，假陰性率均為0%。采用本文的膠體金免疫層析法檢測(cè)到20個(gè)陽性樣品，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)氯霉素為0.11～22.9μg/kg，假陽性率均為0%。其中有3個(gè)樣品T線、C線同時(shí)顯色，且C線顏色稍深，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)氯霉素為0.11～0.13μg/kg，證實(shí)氯霉素殘留處于較低水平，稍高于檢測(cè)限而呈弱陽性。其余膠體金免疫層析法檢測(cè)為陽性的17個(gè)樣品，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)到的氯霉素為0.34～22.9μg/kg，其中0.34μg/kg～0.53μg/kg的樣品T線、C線同時(shí)顯色，且C線顏色明顯較深，而0.67μg/kg的樣品T線幾乎不顯色了。綜上所述，膠體金免疫層析法與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)氯霉素結(jié)果完全一致，未出現(xiàn)假陰性與假陽性的情形。

此外，本方法已經(jīng)經(jīng)過杭州天廚蜜源保健品有限公司驗(yàn)證，驗(yàn)證樣品的檢測(cè)結(jié)果與方法開發(fā)者一致。

表1 膠體金免疫層析法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法氯霉素結(jié)果判定表

2.5 檢測(cè)時(shí)間

按本方法檢測(cè)，單個(gè)樣品用時(shí)約30min，同時(shí)檢測(cè)6個(gè)樣品，需時(shí)2.5h，平均每個(gè)樣品需時(shí)25min。

3 結(jié)論

（1）本文首次采用膠體金免疫分析方法對(duì)蜂膠及其乙醇提取物中的氯霉素殘留量進(jìn)行了研究。樣品在堿性條件下溶解稀釋，20%高氯酸溶液除雜過濾后，加入堿化劑適量，經(jīng)乙酸乙酯提取，鹽析凈化后，再用乙酸乙酯提取吹干，加入正己烷和復(fù)溶液溶解后，用膠體金快速檢測(cè)試劑板快速檢測(cè)。結(jié)果表明，膠體金免疫層析法對(duì)蜂膠及蜂膠提取物中氯霉素殘留量的檢測(cè)限分別為0.1μg/kg和0.2μg/kg。經(jīng)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證，假陽性率和假陰性率均為0%。本方法操作簡(jiǎn)便快速、重復(fù)性好、靈敏度高、準(zhǔn)確度好，是蜂膠源頭收購中監(jiān)控蜂膠中氯霉素殘留量的有效實(shí)用的方法。

（2）按本文建立的方法對(duì)中國蜂產(chǎn)品協(xié)會(huì)蜂膠專業(yè)委員會(huì)的28份蜂膠樣品進(jìn)行氯霉素殘留量測(cè)定，陰性率僅為28.6%，從結(jié)果看，蜂膠中氯霉素殘留量情況不容樂觀。蜂膠已經(jīng)被公認(rèn)為是良好的保健食品原料和中藥，需要業(yè)內(nèi)人士借助本檢測(cè)方法的應(yīng)用努力解決此安全問題。

（3）氯霉素是動(dòng)物禁用藥物，在蜂產(chǎn)品行業(yè)，自2001年以來，氯霉素問題通過業(yè)內(nèi)人士的共同努力，在蜂王漿、蜂蜜等蜂產(chǎn)品原料中已經(jīng)基本檢測(cè)不到氯霉素了。蜂膠屬于脂溶性物質(zhì)，與氯霉素有高度的相溶性，由于蜂膠長(zhǎng)期粘附在巢框、箱蓋中，每次取膠時(shí)不能全部從上面取凈，導(dǎo)致下次取膠時(shí)不同程度留有上次的蜂膠。2010年，周萍等[14]檢測(cè)到的蜂膠原料中氯霉素殘留量遠(yuǎn)高于本次28個(gè)樣品，側(cè)面說明我國蜂膠原料中的氯霉素殘留量正在逐年減少。

（4）為了解決蜂膠中的氯霉素問題，本文做如下建議：如果蜂群所取蜂膠氯霉素陽性，建議全新更換蜂箱、巢框；蜂農(nóng)用藥時(shí)，對(duì)蜂藥中的禁用藥物進(jìn)行檢測(cè)，堅(jiān)決不用含有禁用藥物的蜂藥；對(duì)周邊環(huán)境、水源進(jìn)行調(diào)查，必要時(shí)可以取水樣檢測(cè)氯霉素殘留量。