陳香波 呂秀立 劉 楊 趙明水 崔心紅 張冬梅*

(1.上海市園林科學(xué)規(guī)劃研究院，上海 200232； 2.上海城市困難立地綠化工程技術(shù)研究中心，上海 200232； 3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與藝術(shù)學(xué)院，南昌 330045； 4.浙江天目山國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，杭州 311300)

物種瀕危固然有其生態(tài)歷史的原因，但自身的生物學(xué)特性和生存能力也不容忽視，因存在生殖系統(tǒng)障礙或者對外界環(huán)境不適應(yīng)、不能夠產(chǎn)生正常發(fā)育后代個體，也可能導(dǎo)致種群更新不良、數(shù)量銳減直至瀕危[1]。通過對瀕危植物生殖生物學(xué)特性及影響其生殖有效性的生理、生態(tài)因子進(jìn)行研究，探討其內(nèi)在的瀕危機(jī)制并找出提高其生殖有效性的技術(shù)措施，對于實現(xiàn)瀕危物種的有效保護(hù)具有十分重要的意義[2]。

羊角槭為槭樹科(Aceraceae)槭屬(Acer)落葉喬木，為國家二級保護(hù)植物、中國為數(shù)不多的野外生存數(shù)量不足10株的極度瀕危樹種之一，系古老的殘遺種，野外發(fā)現(xiàn)時僅殘存4株[3～4]。國家林業(yè)局與國家發(fā)改委聯(lián)合印發(fā)的《全國極小種群野生植物拯救保護(hù)工程規(guī)劃(2011～2015年)》中，羊角槭被明確列入一期拯救保護(hù)的120種極小種群植物名錄，被IUCN評估為易危種(VN)。近年來由于低溫凍害、植株衰退等原因，野外殘存的幾株羊角槭相繼死亡，生存形勢異常嚴(yán)峻，亟待加強(qiáng)保護(hù)。

迄今，有關(guān)羊角槭的研究報道資料甚少，僅有個別關(guān)于光合熒光特性以及基因組DNA提取分析親緣關(guān)系方面的報道[5～7]。研究發(fā)現(xiàn)羊角槭種子敗育率高，飽滿種胚率低至4.92%，遠(yuǎn)不及其它槭屬植物，加之存在強(qiáng)烈的種子休眠萌發(fā)抑制[8]，天然更新能力極弱，截至目前對于其種子不孕率高的生殖機(jī)理卻知之甚少。

為探明造成羊角槭種子敗育率高的生殖生物學(xué)原因，本研究以天目山自然保護(hù)區(qū)人工栽植的羊角槭植株為研究對象，于花期觀察了兩性花與雄花形態(tài)特征，并分別統(tǒng)計了兩性花與雄花在枝條中不同位置的分布數(shù)量，記錄單株與群體水平開花動態(tài)，分析羊角槭開花生物學(xué)特性與繁育機(jī)制、依此提出有針對性的保護(hù)措施。

表1 羊角槭花發(fā)育分期及對應(yīng)花器官形態(tài)特征

1 研究方法

于2011～2013年觀察天目山自然保護(hù)區(qū)人工栽植的羊角槭花部形態(tài)特征，隨機(jī)摘取30朵正在開放的兩性花與雄花，測定冠口直徑、花絲長，計算平均數(shù)；并于2013年定點5株羊角槭對其開花動態(tài)進(jìn)行了跟蹤觀測。為進(jìn)行開花進(jìn)程統(tǒng)計，首先對不同花發(fā)育時期兩性花、雄花根據(jù)外在形態(tài)進(jìn)行分期(表1)，自4月12日～4月15日每日取材統(tǒng)計，其后自4月18日取材之后每隔5天取材一次至4月28日止。于上午10點剪取開花主枝一枝，對上部、中部以及下部開花小枝分別統(tǒng)計各分期兩性花和雄花的數(shù)量、計算比例，參照典型枝條繪制羊角槭花序示意圖；根據(jù)每一統(tǒng)計日的兩性花、雄花的數(shù)量占比繪制各單株的開花進(jìn)程圖。

于10月底種子成熟時采集上述植株的種子剝出種仁，分別統(tǒng)計含飽滿種胚、敗育種胚以及空癟的種子數(shù)量，計算不同發(fā)育狀況種胚比率，對比揭示開花生物學(xué)與結(jié)實之間的關(guān)系。

2 研究結(jié)果

2.1 羊角槭兩性花、雄花形態(tài)特征與發(fā)育

羊角槭花序頂生，傘房圓錐狀(圖1:A)，復(fù)合花序分主軸、一級側(cè)生軸與二級側(cè)生軸三級分支，一、二級側(cè)生軸分支進(jìn)化為聚傘狀花序(圖2)。一般兩性花多為主軸頂花、一級側(cè)生軸頂花或最末端二級側(cè)生軸頂端(圖1:B)，雄花位于側(cè)生軸頂端或二級側(cè)生軸頂端或下部(圖1:C)。羊角槭花為雜性,雄花與兩性花共生于一個花序(圖1:A～C),具花萼和花瓣各5片，離生雄蕊8枚。兩性花子房成扁球狀突出于花盤之上，其上密披絨毛，柱頭顯著伸出約3～5 mm，先端二裂，彎曲向外翻卷，冠口直徑8.34 mm，花絲較短、為4.83 mm(圖1:B,D)。兩性花具雌蕊，子房上位，2室，每室2枚倒生胚珠，成熟花藥不開裂。觀察到兩種形態(tài)雄花，Ⅰ型雄花子房微型、柱頭極度短縮呈一小黑點(圖1:E)，Ⅱ型雄花一團(tuán)白色絨毛中稍有2裂柱頭隱現(xiàn)(圖1:F)，兩種形態(tài)雄花差別還體現(xiàn)在：Ⅰ型雄花較Ⅱ型雄花早開放大約3～5天，花盤不凹裂(圖1:E)，而Ⅱ型雄花花盤較厚、呈輻射狀凹裂(圖2-1，F(xiàn))，雄花冠口直徑8.92 mm，花絲平均長8.85 mm(表2)。所調(diào)查的3年中，僅在2011年觀察到兩種形態(tài)的雄花，而2012與2013年只觀察到Ⅱ型雄花，Ⅰ型雄花未出現(xiàn)。

表2 羊角槭兩性花、雄花在不同位置枝條中的分布數(shù)量及比例

圖1 羊角槭花序與花形態(tài)特征 A.羊角槭花枝；B.羊角槭花序(箭頭所指示兩性花)；C.羊角槭花序(箭頭所指示雄花開放)；D.兩性花(示雄蕊與雌蕊)；E.Ⅰ型雄花.；F.Ⅱ型雄花；G.兩性花不同分期；H.雄花不同分期 St.雄蕊；Pi.雌蕊Fig.1 The floral morphology of Acer yangjuechi A.Flowering branch; B.Inflorescence(Arrow pointing to bisexual flower); C.Inflorescence(Arrow pointing to male flower); D.Bisexual flower with stamen and pistil; E.TypeⅠmaleflower; F.TypeⅡmaleflower; G.Different stage of bisexual flower; H.Different stage of male flower St.Stamen; Pi.Pistil

圖2 雄花、兩性花在花序上的位置分布 A.羊角槭；B.三角槭 實心圓代表雄花，空心圓代表兩性花。Fig.2 The distribution of male flower and bisexual flower in inflorescence A.Acer yangjuechi; B.Acer buergerianum Solid circle means male flower,hollowcircle means bisexual flower

單個花序開花動態(tài)為：先是主軸頂花開放，其后一級側(cè)生軸頂花、主軸側(cè)生頂花、側(cè)生軸側(cè)生頂花至各軸下部花漸次開放。兩性花開放時，花萼張開成近水平狀，柱頭顯著伸出(圖1，G：[0]期)，此時雌蕊柱頭成熟可接受花粉受精時期。開放第二天，花萼收緊包被子房(圖1，G：[1]期)；隨后兩性花子房日漸膨大，略帶翅形(圖1，G：[2]期)；單花開放后4～6 d柱頭開始萎縮，雄蕊萎蔫脫落，子房明顯膨大呈翅形，邊沿逐漸由淺綠色變?yōu)榧t色；4月下旬，果實兩翅平均間距2 cm(圖1，G：[5]期)；5月以后，翅果漸伸長，至兩翅間距達(dá)到4 cm時，花萼、花瓣均已凋謝脫落。雄花初形成時花萼緊裹，寬度僅5 mm以下(圖1，H：[-2]期)，至4月中旬后，雄花生長到7 mm左右寬度時，花萼逐漸微張(圖1，H：[-1]期)，直至雄花花萼完全張開與花盤成平面(圖1，H：[0]期)，此時為雄花花藥成熟散粉時期，隨后雄花花萼萎蔫、落花凋謝。

2.2 雄花、兩性花在枝條上的數(shù)量比例與位置分布

觀察記錄定點枝條花序上的不同性別分化花的數(shù)量及在枝條分布的相對位置(上部、中部、下部)，統(tǒng)計了位于枝條上部、中部以及下部共計414個花序，其中兩性花總數(shù)877、雄花總數(shù)5 960，雄花比兩性花數(shù)量比例6.89(表2)。每花序兩性花數(shù)隨花序位置自上而下略有減少(2.2→2.19→1.82)，而主花軸兩性花比例卻是隨著花序位置自上而下逐漸增加37.47%→39.32%→46.45%，相應(yīng)的分支軸兩性花比例則有所下降(62.53%→60.68%→53.55%)，說明羊角槭枝條上部花序兩性花著生比例高于中部和下部枝條，但下部枝條主軸兩性花比例較上部和中部枝條居多，而分支軸兩性花數(shù)量卻正好相反，以上部枝條偏多。

與同是槭屬植物的三角槭枝條花序上雄花、兩性花數(shù)量比較發(fā)現(xiàn)，三角槭枝條上雄花與兩性花數(shù)量比為2.63，枝條中兩性花比例較羊角槭的6.89增加了2.6倍，表明三角槭枝條中兩性花數(shù)量較多且更多分布在枝條的外圍處易于接受花粉的位置(圖2)。

2.3 羊角槭開花動態(tài)

2.3.1 單株羊角槭開花進(jìn)程

以苗圃株羊角槭為例(圖3)，4月11日還未見有兩性花開放，4月12日50%兩性花開放，而至4月15日整株已完全看不到未開和正在開放的兩性花，都已進(jìn)入[1]期以后。若對4月12日～4月15日觀察到的兩性花進(jìn)行分期，則兩性花的發(fā)育次序基本為‘花苞(花萼緊密包裹)—花萼微張待開—花萼完全張開與花盤成平面(此時柱頭成熟、可接受花粉受精)—花萼包裹、子房膨大—子房膨大、果兩端略有翅形’，逐日增進(jìn)、漸次發(fā)育，而后只是翅果形態(tài)大小的變化。由圖3，苗圃株羊角槭兩性花開放時期集中于4月12日～4月14日，而對應(yīng)于此時的雄花發(fā)育卻大多數(shù)只在花萼緊密包裹、還未成熟的[-2]期，只有極個別雄花(7%以下)花萼完開處于散粉階段。

圖3 苗圃株花發(fā)育進(jìn)程 圖中數(shù)字代表不同花發(fā)育分期；每一時期分期花數(shù)量占比最多者以灰底色標(biāo)示，代表開花進(jìn)程處于該分期階段。Fig.3 Flowering Process of individual located in nursery The number means different developing stage of flowers.The grey base sign the maximum number of flowers which means flowering process at that developing stage.

羊角槭開花進(jìn)程緊湊，同一植株不同花枝間花發(fā)育進(jìn)程彼此接近。兩性花開放時間短，單個兩性花花萼自包裹[-1]期至完全展開僅1～2天，兩性花柱頭為濕型柱頭，開放時分泌液體，此時具有可授性，隨后花萼收緊、包被子房從而不再接受花粉。柱頭成熟可授期也僅在這短暫的1～2天內(nèi)，整株兩性花開放時間3天以內(nèi)，呈現(xiàn)出集中開放模式。雄花的開放期相對較長，單個雄花經(jīng)歷了‘花萼緊密包裹(花苞階段)—包裹松動、花萼微張—花萼完全張開與花盤成平面—花萼脫落、雄花凋謝’的發(fā)育過程，單花花期約5～6天，而整株雄花花期在10～12天。

2.3.2 群體開花進(jìn)程

浙江天目山羊角槭正常年份于4月中旬始花，以觀測年2013年為計，4月12日只有苗圃株羊角槭有花萼緊密包裹未開花的兩性花占多數(shù)(50%)，處于[-1]分期階段，此時畫眉山莊兩株與禪源寺羊角槭尚有少部分[0]期正在開放的兩性花(比例分別是20%、12.96%、3.85%)，但以[1]期兩性花占多數(shù)，太子庵株羊角槭已進(jìn)入[2]期，未見[0]期兩性花開放。4月15日，苗圃株兩性花開花進(jìn)入[2]期，此時畫眉山莊b株與禪源寺株仍屬[2]期，太子庵株已進(jìn)入[3]期(43.24%)。3天之后的4月18日，多數(shù)植株都在[4]期(苗圃、畫眉山莊a、禪源寺)，畫眉山莊b株在[5]期(55.17%)、太子庵株在[6]期(50%)。后期兩性花子房膨大生長，形態(tài)上只是看到形成的小翅果明顯增大，兩翅間最大距離加寬，至4月底，翅果已基本可以達(dá)到3～4 cm。從單株角度評判，所觀察的5株羊角槭兩性花開花時期不完全一致，存在先后次序，苗圃株明顯落后于其它4株，處于群體兩性花開放的末期，其次是畫眉山莊兩株稍早于苗圃株，處于群體兩性花開放的中期，而禪源寺與太子庵處開花時期稍早，處于群體兩性花開放的早期。從群體角度考慮，推算天目山栽植羊角槭群體兩性花開花盛期應(yīng)集中在4月11～4月13日的三日之內(nèi)。

相對于兩性花開放，雄花開放期跨越時間較長，自4月12日～4月23日各單株均有雄花開放，而占比多數(shù)的開放期在4月18日前后(圖4)。所有株在4月18日之前，多數(shù)雄花仍處于花萼緊密包裹、花苞階段的[-2]期或花萼微張、即將開放的[-1]期，處于開放期的雄花相對占少數(shù)(50%以下)。苗圃株在4月15日前僅有極個別雄花(6.29%)處于開放散粉期，其它株在4月15日處于正開放散粉的[0]期雄花占比在24.81%(畫眉山莊a)～36.69%(太子庵)之間，多數(shù)的雄花處于未開放階段([-2]期或[-1]期)，直到4月18日，[0]期開放雄花比例仍不過32.06%(禪源寺)～44%(太子庵)，未開放雄花略占多數(shù)，至5天后的下一觀測日4月23日，大多數(shù)雄花已進(jìn)入花后階段，花萼脫落、雄花凋謝，僅剩極少數(shù)雄花開放。由此推測，4月20日前后1～2天，應(yīng)是羊角槭雄花盛花期。雄花開花期拉得較長，特別是前期(與兩性花成熟重合期)都只是少數(shù)雄花散粉。比較群體兩性花盛花期(4月11～4月13日)與雄花盛花期(4月19～22日)，兩者間存在一定的時間間隔。就單個植株而言，以苗圃株為例，兩性花大量開放期在4月13日，而雄花大量開花期則在4月20日左右，群體內(nèi)單株間僅有個別交錯的兩性花期與雄花期。

圖4 群體內(nèi)不同單株兩性花與雄花發(fā)育進(jìn)程Fig.4 The flowering process of bisexual flower and male flower in different individuals

2.4 羊角槭單株結(jié)實情況

對天目山人工栽植羊角槭群體結(jié)實情況統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖5)，畫眉山莊兩株羊角槭正常種胚率最高，分別為28.83%和26.21%，其次為太子庵與禪源寺羊角槭植株(23.94%和19.7%)，而苗圃株正常種胚率僅10.53%，近90%的種子為敗育種胚或空籽。

圖5 不同單株羊角槭種胚發(fā)育情況Fig.5 The embryo development of different individuals

根據(jù)Dafni的雜交指數(shù)(OCI)標(biāo)準(zhǔn)[9]，羊角槭植株上著生兩性花與雄花，‘功能性’雌蕊與雄蕊空間上分離，記為1；單個植株存在相對分隔的兩性花期(雌性成熟期)與雄花期(雄性成熟期)，兩性花期短且略先于雄花期，記為1；花朵直徑大于6 mm，記為3，由此判定羊角槭的雜交指數(shù)為5，則其繁育系統(tǒng)應(yīng)為異交為主、部分自交親和，需要傳粉者。畫眉山莊兩株羊角槭相鄰生長，正常種胚率高于其它3株(禪源寺、太子庵、苗圃)，距離相近促成異交結(jié)實利于繁殖成功，與其繁育系統(tǒng)異交為主、部分自交可育是相關(guān)聯(lián)的。

3 討論

3.1 羊角槭花發(fā)育形態(tài)特征及與其它槭屬植物的比較

槭屬植物性別分化復(fù)雜，多數(shù)種的花表現(xiàn)為雜性、雄花和兩性花同株或異株，只有少數(shù)種花單性、雌雄異株[10]。二重雌雄異型異熟是槭屬植物特化的一種繁育機(jī)制，具有兩期雄花，兩期雄花差別很大，雌花在形態(tài)上表現(xiàn)為兩性花，植株雌雄功能按照雄—雌—雄順序依次表達(dá)[11～14]。De Jong經(jīng)過大量形態(tài)學(xué)和生理學(xué)研究之后，將二重雌雄異型異熟歸結(jié)為單花形態(tài)水平上的兩性花和單性花，但功能上僅為雄花和雌花[10]。迄今，已在色木槭(A.mono)、挪威槭(A.platanoides)、歐亞槭(A.pseudoplatanus)等多種槭屬植物中觀察到這一特殊的交配型式樣[10,15]。

羊角槭花序頂生，傘房圓錐狀花序中同時分布有雄花和兩性花，兩種花在形態(tài)方面有很大差別，兩性花子房密披灰白色短絨毛，花柱較長、無毛，中段以上2裂，柱頭反卷；而雄花觀察到兩型，Ⅰ型雄花子房微型、柱頭極度短縮呈黑點狀，Ⅱ型雄花白色絨毛中稍有2裂柱頭隱現(xiàn)，花絲較兩性花長。細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，兩性花與雄花花藥組織相比絨氈層殘留多且解體明顯，花藥成熟時因不具有唇細(xì)胞不能裂開而散出花粉,成為結(jié)構(gòu)性的雄性不育[16]；而雄花胚珠出現(xiàn)珠心組織退化、雙珠被細(xì)胞停止發(fā)育等退化現(xiàn)象，不能完成正常的胚囊發(fā)育，并且Ⅰ型雄花子房退化速度較Ⅱ型雄花更為迅速[17]。與張靈芝等對平基槭、色木槭花發(fā)育觀察結(jié)果相似[15,17]，羊角槭在花發(fā)育過程中通過成熟花藥的不開裂和子房胚珠的敗育而分別產(chǎn)生功能性雌花和雄花。除了花的形態(tài)和功能多樣，就不同類型花在枝條上的分布位置及數(shù)量來看，羊角槭兩性花數(shù)量僅占花序種花總數(shù)的12.83%，而雄花占據(jù)87.17%，兩性花與雄花比例1∶6.89，遠(yuǎn)低于三角槭兩性花在枝條上的分布數(shù)量，兩性花數(shù)量明顯偏少。

廟臺槭與羊角槭親緣關(guān)系非常近，新版《中國植物志》已將兩者歸并為1個種[18]，最新分子生物學(xué)研究通過nrDNA ITS和cpDNA序列比對發(fā)現(xiàn)兩者間差異較大，分子證據(jù)不支持將羊角槭歸并為廟臺槭[19]。曹小勇等觀察發(fā)現(xiàn)廟臺槭具有兩性花、雄花和無性花3種類型的花，兩性花花絲較雄花短，雄花成熟時其雌蕊敗育、兩心皮未合攏呈開裂狀，而脫落時仍為花蕾狀的花被定義為無性花[20]。就單個花序花的分布與開花動態(tài)，廟臺槭與羊角槭非常相似，花序的頂花及Ⅰ級分枝軸的頂花由兩性花或雄花組成，Ⅱ級分枝軸的頂花近乎全為雄花，個別為兩性花，并且均先是頂花與各級分枝軸的頂花開放，由上而下依次進(jìn)行[21]。對羊角槭連續(xù)3年花期觀測中，僅在2011年出現(xiàn)兩期雄花，而在2012與2013年兩性花開放時期未觀察到Ⅰ型雄花，廟臺槭Ⅲ級分枝軸的頂花由無性花組成并及早脫落[20]，是否該脫落無性花即為Ⅰ型雄花，還需做進(jìn)一步觀察比較，以揭示兩者間異同，添加新的分類學(xué)證據(jù)。

3.2 羊角槭開花與授粉結(jié)實

單株水平上兩性花與雄花成熟數(shù)量極不對等，大多數(shù)兩性花柱頭成熟可授粉期時該樹體雄花則只有不及10%的雄花處于成熟散粉階段，只能更多依靠群體內(nèi)其它個體開放雄花提供花粉，而群體內(nèi)單株間只存在有限的兩性花期與雄花期交錯。羊角槭花粉存在部分?jǐn)∮F(xiàn)象，花粉生活力45.97%[16]，而兩性花又呈集中開放模式，開放時間短。據(jù)觀察羊角槭花期傳粉昆蟲以蠅類、娥類居多，大多在晴天的11：00～16:30左右訪花，蟲媒授粉是其主要的傳粉方式[21]。距離較近、相鄰生長便于單株間彼此方便提供花粉授粉，種胚發(fā)育飽滿比例高，在本研究中得到了驗證。當(dāng)然還需進(jìn)一步進(jìn)行花粉量、胚珠比觀察與計算以及人工控制授粉試驗，測定不同授粉處理的結(jié)實率以進(jìn)一步驗證其繁育系統(tǒng)。

3.3 交配型變化及其影響因素

據(jù)對歐亞槭(Acerpseudoplatanus)的研究發(fā)現(xiàn)，不同年份間同一植株會發(fā)生交配型間的相互轉(zhuǎn)換，Ⅰ型雄花并不是每一年份都會出現(xiàn)，可能受氣候與環(huán)境因素影響[10]，推測與植株體內(nèi)的激素調(diào)節(jié)水平有關(guān)[15]。羊角槭在2011年出現(xiàn)兩期雄花，而后兩年未出現(xiàn)Ⅰ型雄花。單株交配型式樣年份間變化情況，需要進(jìn)一步多年跟蹤觀測，分析受影響的內(nèi)、外因素，以更好地揭示交配型與羊角槭有效結(jié)實之間的關(guān)系。

天目山分布的羊角槭植株分布較為分散，花期有先后，群體中個體間相互授粉受距離障礙與花粉量限制影響，導(dǎo)致子房授粉受精不充分，未受精子房雖繼續(xù)膨大而成為空?；驍∮N子，這可能是導(dǎo)致羊角槭種子發(fā)育不良，敗育、空癟嚴(yán)重的最直接原因。因此從提高繁殖效率的角度考慮，應(yīng)建立適生的羊角槭保護(hù)小區(qū)，縮短種植間距、增加單株間花粉供給，擴(kuò)大異交結(jié)實成功率，以實現(xiàn)羊角槭這一極小種群植物可持續(xù)保育的目標(biāo)。