魏曉雪　姜明月　張文天　呂躍東　張妍妍

摘?要：為探索野生興安百里香組織培養(yǎng)最佳培養(yǎng)條件獲得完整再生植株，以五大連池野生興安百里香為研究對象，研究外植體類型、消毒時間和培養(yǎng)基種類對興安百里香莖芽增殖與微枝生根的影響。結果表明：帶腋芽莖段為興安百里香組培的最佳外植體，采用質(zhì)量濃度0.1%升汞浸泡4 min的方法消毒效果最佳;最適愈傷組織誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg/L+2，4-D0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉6 g/L;最適莖芽增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg/L+2，4-D0.5 mg/L;最適微枝生根培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 0.8 mg/L。此研究結果為通過工廠化育苗技術培育野生興安百里香優(yōu)質(zhì)觀賞苗木奠定了基礎。

關鍵詞：興安百里香;帶芽莖段;組織培養(yǎng);再生體系

中圖分類號：S573.9???文獻標識碼：A??文章編號：1006-8023（2019）04-0022-06

Plant Regeneration of the Stem Bud Proliferation Pathway of Thymus dahuricus

WEI Xiaoxue1， JIANG Mingyue1， ZHANG Wentian1， LV Yuedong2， ZHANG Yanyan2*

（1. Institute of Volcanoes and Mineral Springs， Heilongjiang Academy of Science， Wudalianchi 164155; 2.Forestry Research Institute of Heilongjiang Province， Harbin 150040）

Abstract：In order to explore the optimal culture conditions for wild Thymus dahuricus tissue culture to obtain a complete regenerated plant， we studied the effects of explant type， disinfection time and medium variety on stem bud proliferation and microbranched rooting of Thymus dahuricus with Wudalianchi wild Thymus dahuricus. The results showed that： the best explants for tissue culture of Thymus dahuricus were axillary bud stem segment. The best disinfection effect was achieved by soaking for 4 min with a mass concentration of 0.1% mercury. The best medium for callus induction was： MS+6-BA1.0 mg/L+2，4-D0.5 mg/L+ saccharose 30 g/L+ powdered agar 6 g/L. The most suitable medium for stem-bud multiplication was： MS+6-BA1.0 mg/L+2，4-D0.5 mg/L. The best medium for rooting of microtwigs was： MS+6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 0.8 mg/L. The results laid a foundation for the cultivation of high quality ornamental seedlings of wild Thymus dahuricus by means of industrial seedling raising technology.

Keywords：Thymus dahuricus; stem with axillary bud; tissue culture; regeneration system

0?引言

百里香屬（Thymus）植株具有強烈的芳香氣味，其花莖葉可提取芳香油，是重要的芳香和藥用植物，也可作為觀賞、環(huán)保以及蜜源植物[1-3]。百里香芳香油是重要的天然香料，具有一定的商業(yè)價值，廣泛應用于化妝品、醫(yī)療、保健和食品等方面，具有廣闊的開發(fā)前景[4-8]。

一般百里香主要來自野生資源，人們對百里香精油的需求量與日俱增，野生資源不能滿足需要，而且很快會導致野生資源的枯竭，故需要開展人工栽培。目前，百里香的人工栽培主要依靠種子育苗，但種子育苗易受病毒浸染，導致種性退化，產(chǎn)量和品質(zhì)下降，不能適應規(guī)?；蜆藴驶a(chǎn)的需要，因此前人進行了大量百里香屬的組織培養(yǎng)技術研究[9-10]。

以往有關百里香屬組織培養(yǎng)試驗中，主要研究了不同品種、不同外植體、培養(yǎng)基及生長調(diào)節(jié)劑對叢生芽的誘導和生根的影響[10-16]。趙慶臻等[14]對五脈百里香進行了組培快繁嘗試，采用野生帶腋芽莖段作為組培材料。李曉東等[15]以離體培養(yǎng)的百里香不定芽為材料，研究了培養(yǎng)基添加不同濃度的苯丙氨酸或茉莉酸甲酯對不定芽生長以及精油提取率等的影響。徐治朋等[16]研究了Cu2+對離體培養(yǎng)的紅花百里香不定芽生長及揮發(fā)油的影響。雖然百里香屬植物的組培快繁研究已歷時多年，但由于興安百里香（Thymus dahuricus）分布范圍不廣，生境寒冷等原因，關于野生興安百里香組培技術研究較少，現(xiàn)有的百里香屬快速繁殖方法并不適用于野生興安百里香[17-18]。因此急需開展野生興安百里香離體培養(yǎng)再生組培體系的建立與改善工作，為今后工廠化育苗和種質(zhì)資源保存等工作奠定基礎。

1?材料與方法

1.1?外植體篩選

2017年5月，分別選取五大連池野生興安百里香的葉片、帶芽莖段做為供試材料進行外植體誘導。將供試外植體用清水沖洗干凈，用0.1%升汞浸泡4 min，無菌水沖洗3次。剪取長約1.0 cm的帶芽莖段，接種于MS+6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+日產(chǎn)瓊脂粉6 g/L（Solarbio，A8190）的培養(yǎng)基中，pH值調(diào)至5.8～6.0。

選取2～5節(jié)成熟的葉片，把葉片遠軸面向上接種到MS+6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉6 g/L的培養(yǎng)基上，pH值調(diào)至5.8～6.0。

每種外植體接種10瓶，每瓶4個外植體，試驗重復3次。培養(yǎng)30 d后調(diào)查各供試外植體的莖芽誘導情況。培養(yǎng)溫度白天27±1 ℃，夜間22±1 ℃，光照強度2 000 Lux，光照10 h/黑暗14 h。

1.2?外植體滅菌

剪取長約1.0 cm的帶芽莖段，用清水反復沖洗備用。滅菌處理：①75%酒精浸泡30 s，0.1%升汞（HgCl2）浸泡4 min，之后無菌水沖洗3次;②75%酒精浸泡30 s，0.1%升汞浸泡6 min，之后無菌水沖洗3次;③0.1%升汞浸泡4 min，之后無菌水沖洗3次;④0.1%升汞浸泡6 min，之后無菌水沖洗3次;⑤75%酒精浸泡30 s，5%次氯酸鈉浸泡10 min，之后無菌水沖洗3次;⑥75%酒精浸泡30 s，5%次氯酸鈉浸泡20 min，之后無菌水沖洗3次。每處理10個莖段，3次重復，2周后觀察效果。

1.3?基本培養(yǎng)基的篩選

將經(jīng)過滅菌的芽苗接種于以下4種基本培養(yǎng)基進行培養(yǎng)：①1/2MS：大量元素含量減半;②MS;③ WPM;④改良WPM：以Ca（NO3）2·4H2O 684 mg/L（單位下同）、KNO3 190、C10H13FeN2NaO8 73.4和鹽酸硫胺素0.1代替原WPM培養(yǎng)基中的K2SO4、CaCl2、FeSO4和Na2EDTA。培養(yǎng)基中添加蔗糖30 g/L，瓊脂粉6 g/L，pH值調(diào)至5.8～6.0，培養(yǎng)溫度白天27±1 ℃，夜間22±1 ℃，光照強度2 000 Lux，光照10 h/黑暗14 h。每處理10個莖段，2次重復，待培養(yǎng)20 d調(diào)查芽苗數(shù)、平均生長量等指標。

1.4?試管苗初代培養(yǎng)

將接種于基本培養(yǎng)基上未染菌、生長狀況良好的芽苗剪成1.0～1.5 cm的莖段接種于以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加6-BA0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L的培養(yǎng)基上，添加蔗糖30 g/L，瓊脂粉6 g/L，pH值調(diào)至5.8～6.0，每處理10個莖段，3次重復，于接種后的20 d觀察芽苗生長分化情況。培養(yǎng)溫度白天27±1 ℃，夜間22±1 ℃，光照強度2 000 Lux，光照10 h/黑暗14 h。

1.5?試管苗增殖培養(yǎng)

待腋芽伸長后，將試管苗轉(zhuǎn)接于添加了以下幾種激素的MS培養(yǎng)基中：①6-BA0.5 m/L+2，4-D0.5 mg/L;②6-BA1.0 mg/L+2，4-D0.5 mg/L;③6-BA 1.5 mg/L+ 2，4-D 0.5 mg/L;④6-BA2.0 mg/L+2，4-D0.5 mg/L;⑤6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 0.3 mg/L;⑥6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 0.8 mg/L;⑦ 6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L，進行增殖培養(yǎng)。上述培養(yǎng)基均加蔗糖30 g/L，瓊脂粉6 g/L，pH值調(diào)至為5.8～6.0。每個處理接種10瓶，每瓶5個單芽莖段，3次重復，培養(yǎng)30 d后調(diào)查增殖效果。

1.6?試管苗生根培養(yǎng)

當繼代培養(yǎng)中芽苗直徑長至0.5 cm以上時，將生長健壯、高0.5～1 cm的幼苗轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中，每瓶接芽苗3個，觀察生根情況。培養(yǎng)條件同1.5。每個處理接種10瓶，每瓶3個組培苗，重復3次。30 d后統(tǒng)計生根和生長情況。

1.7?數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

按下列方法統(tǒng)計褐化率、出芽率、污染率、生根率、增殖率和增殖系數(shù)，采用 SPSS12.0 軟件進行方差分析及多重比較。

褐化率=（外植體褐化數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%。

出芽率=（外植體誘導出芽數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%。

污染率=（外植體污染數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%。

生根率=（生根苗數(shù)/接種苗數(shù)）×100%。

增殖率=（增殖的苗數(shù)/接種苗數(shù)）×100%。

增殖系數(shù)= 增殖的苗數(shù)/接種苗數(shù)。

2?結果與分析

2.1?不同種類外植體對芽苗生長的影響

葉片接種20 d后，葉片切口邊緣產(chǎn)生肉眼可見的愈傷組織或在傷口邊緣處直接產(chǎn)生晶亮、綠色的不定芽。愈傷組織多為白色、黃綠色或淡黃色，較致密，生長緩慢。產(chǎn)生的愈傷組織有些能繼續(xù)分化出不定芽，而有些隨著培養(yǎng)時間的延長變褐壞死。產(chǎn)生的不定芽多為淺綠色或黃綠色。不定芽大多密集在傷口邊緣，叢生或單生，并且可以在原有培養(yǎng)基上繼續(xù)長出葉片。有些葉片上產(chǎn)生的不定芽須經(jīng)過愈傷組織階段，而有些不定芽不需經(jīng)過愈傷組織階段，直接在傷口邊緣產(chǎn)生。

帶腋芽莖段在接種后的10 d觀察到莖段底部有淡綠色或黃綠色的愈傷組織產(chǎn)生，有部分莖段未產(chǎn)生愈傷組織而褐化死亡。在莖段接種25 d后誘導產(chǎn)生不定芽，如圖1所示，隨著培養(yǎng)時間的延長小葉片也逐漸展開。

在培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)（表1），莖段的誘導率較高，為40.0%，褐化率相對稍低，為48.0%，芽高1.6 cm;葉片的不定芽出芽率為22.0%，褐化率較高，為60.0%，芽高0.5 cm。因此，帶腋芽莖段為興安百里香組培的最佳外植體。

[3]于二汝，王少銘，侯穎輝，等.5種黔引百里香的形態(tài)特征和蒸餾法提取精油的化學型比較研究[J].熱帶作物學報，2018，39（1）：84-92

YU E R， WANG S M， HOU Y H， et al. Botanical characters and composition of essential oils from five varieties of Thyme grown in Guizhou area[J]. Chinese Journal of Tropical Crops， 2018， 39（1）： 84-92.

[4]SAIDI M， GHAFOURIAN S， ZARINABAADI M， et al. In vitro antimicrobial and antioxidant activity of black thyme （Thymbra spicata L.） essential oils[J]. Roum Archives of Microbiology and Immunology， 2012， 71（2）： 61-69.

[5]ZABOROWSKA Z A， PRZYGONSKI K， BILSKA A. Antioxidative effect of thyme （Thymus vulgaris） in sunflower oil[J]. Acta Sci.Pol.， Technol.Aliment， 2012， 11（3）： 283-291.

[6]吳爽，魏鳳香，李紅枝，等.檸檬百里香葉揮發(fā)油成分分析及對肝癌細胞毒性作用[J].中藥材，2013，36（5）：756-759.

WU S， WEI F X， LI H Z， et al. Chemical composition of essential oil from Thymus citriodorus and its toxic effect on liver cancer cells[J]. Journal of Chinese Medicinal Materials， 2013， 36 （5）： 756-759.

[7]劉光發(fā)，宋海燕，羅婉如，等.百里香-丁香羅勒精油抗菌紙對草莓的防腐保鮮效果[J]，包裝工程，2018，39（19）：91-97.

LIU G F， SONG H Y， LUO W R， et al. Effect of antimicrobial paper coated with Thymus vulgaris L. and Ocimum gratissimum L. essential oil on preservation of strawberry[J]. Packaging Engineering， 2018， 39（19）： 91-97.

[8]佟晶晶，王明陽，潘佳雯，等.植物精油抗菌和抗真菌活性的研究進展[J].中國飼料，2018，29 （7）：46-49.

TONG J J， WANG M Y， PAN J W， et al. Research advances in antibacterial and antifungal activity of plant essential oils[J]. China Feed， 2018， 29（7）： 46-49.

[9]李曉東，王永飛，馬三梅，等.東北百里香組培再生體系的建立普通百里香的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2009，48（6）：??1294-1297.

LI X D， WANG Y F， MA S M， et al. Tissue culture and rapid propagation of Thymus vulgaris[J]. Hubei Agricultural Sciences， 2009， 48（6）： 1294-1297.

[10]宋陽，王沖，魏巖.興安百里香播種繁殖研究[J].種子，2014，33（1）：116-118.

SONG Y， WANG C， WEI Y. Study on characteristics of seeds and sowing of Thymus dahuricus Serg.[J]. Seed， 2014， 33（1）： 116-118.

[11]徐世千，李曉東，張建國.不同方法提取組培百里香精油質(zhì)量及成分的比較分析[J].植物科學學報，2013，31（6）：609-615.

XU S Q， LI X D， ZHANG J G. Comparative analysis of essential oil quality and composition from tissue culture seedlings of Thymus vulgaris L using different extraction methods[J]. Plant Science Journal， 2013， 31（6）： 609-615.

[12]徐治朋.紅花百里香組織培養(yǎng)體系優(yōu)化及揮發(fā)油產(chǎn)量的調(diào)節(jié)研究[D].重慶：西南大學， 2016.

XU Z P. Study on optimization of tissue culture system and regulation of essential oil yield of Thymus serpyllum L.[D]. Chongqing： Southwest University， 2016.

[13]王玲，楊麗鵬，張秀珍，等.東北百里香組培再生體系的建立[J].園藝學報，2011，38（6）：1185-1190.

WANG L， YANG L P， ZHANG X Z， et al.The establishment of the adventitious bud regeneration system of Thymus mandschuricus[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2011， 38（6）： 1185-1190.

[14]趙慶臻，閆華超，程霜，等.地椒的組織培養(yǎng)及植株再生[J].植物生理學通訊， 2002， 38（4）：357.

ZHAO Q Z， YAN H C， CHENG S， et al. The tissue culture and plant regeneration of ground pepper[J]. Plant Physiology Communications， 2002， 38（4）：357.

[15]李曉東，徐世千，魯朝輝，等.苯丙氨酸和茉莉酸甲酯對百里香離體培養(yǎng)芽生長及其精油的影響[J].香料香精化妝品，2014，42（2）： ?1-6.

LI X D， XU S Q， LU Z H， et al. Study on the effects of phenylalanine and methyl jasmonate on profile of essential oil from tissue culture of Thymus vulgaris L[J]. Flavour Fragrance Cosmetics， 2014， 42 （2）： 1-6.

[16]徐治朋，李曉東，魯朝暉，等.Cu2+對離體培養(yǎng)的紅花百里香不定芽生長及揮發(fā)油的影響[J].西南大學學報（自然科學版），2016，38（5）：37-44.

XU Z P， LI X D， LU Z H， et al. Effects of Cu（2+） on the growth of the adventitious buds of Thyme serpyllumin in vitro culture and their essential oil[J]. Journal of Southwest University （Natural Science Edition）， 2016， 38（5）： 37-44.

[17]羅彩霞，田永強，潘彥彪.百里香研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2014，42（33）：11669-11672.

LUO C X， TIAN Y Q， PAN Y B. Research progress of Thymus[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences， 2014， 42（33）： 11669-11672.

[18]穆丹，梁英輝.佳木斯地區(qū)百里香的引種栽培及園林應用研究[J].安徽農(nóng)學通報，2013，19（16）：31-32.

MU D， LIANG Y H. Introduction and landscape application of Thyme in Jiamusi region[J]. Anhui Agricultural Science Bulletin， 2013， 19（16）： 31-32.

[19]李艷霞，劉忠玲，劉建明，等.樹莓品種“波拉納”組培繁殖體系建立[J].森林工程，2018，34（2）：26-29.

LI Y X， LIU Z L， LIU J M， et al. Establishment of tissue culture and propagation system for raspberry （Rubus idaeus） cultivar "Polana"[J]. Forest Engineering， 2018， 34（2）： 26-29.

[20]李琳，杜倩，梁素鈺.黑果枸杞無菌苗愈傷組織誘導體系的建立[J].林業(yè)科技，2018，43（06）：1-3.

LI L， DU Q， LIANG S Y. Establishment of callus induction of non-bacterial seedling of lycium ruthenicum[J]. Forestry Science & Technology， 2018， 43（6）：1-3.

[21]覃杰明，何含杰，張黨權，等.6-BA和GA3對鹽脅迫下紅桿鐵皮石斛幼苗生理生化影響[J].亞熱帶植物科學， 2016， 45（1）：27-31.

QIN J M， HE H J， ZHANG D Q， et al. Physiological and biochemical influences of 6-BA and GA3 on red-stem dendrobium officinale under salt stress[J]. Subtropical Plant Science， 2016， 45（1）： 27-31.

[22]李學東，華帥，劉長安.NAA與6-BA對黑金絲柚木組織培養(yǎng)的影響[J].亞熱帶植物科學，2017，46（4）：379-382.

LI X D， HUA S， LIU C A， Effects of NAA and 6-BA on tissue culture of Tecton grandis[J]. Subtropical Plant Science， 2017， 46（4）： 379-382.

[23]張虎，巫建新，許建民，等.6-BA與ZT對芫花莖段外植體組織培養(yǎng)的影響[J].江蘇林業(yè)科技，2018，45（4）：29-32.

ZHANG H， WU J X， XU J M， et al. Effects of 6-BA and ZT on the tissue culture of Daphne genkwa segment explant[J]. Journal of Jiangsu Forestry Science & Technology， 2018， 45（4）： 29-32.