二維液相色譜法檢測嬰幼兒奶粉中的?；撬?/h1>
2019-06-10 03:48:10鄭國建沈龍?zhí)禅Q林毅侃王承平楊保剛
中國乳品工業(yè) 2019年4期
鄭國建，沈龍?zhí)禅Q，林毅侃，王承平，楊保剛
（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院，上海 200233)
0 引 言
?；撬?Taurine)又名2-氨基乙磺酸，是人體重要的氨基酸，可促進大腦的損傷修復(fù)[1,2]、提高免疫力[3]、減輕炎癥反應(yīng)[4]、促進視覺機能的發(fā)育[5]。
目前用于食品中牛磺酸測定的方法主要包括液相色譜法[6-11]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[12-14]。由于食品中?；撬岷扛?，且液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀價格昂貴，所以主要使用液相色譜法，如國家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.169-2016[15]。該標(biāo)準(zhǔn)第一法為柱后衍生法。由于該方法使用的色譜柱價格高，且需要使用柱后衍生裝置，對實驗室要求較高，所以大多數(shù)實驗室使用標(biāo)準(zhǔn)中的第二法，既丹磺酰氯柱前衍生法。但在第二法中某些基質(zhì)樣品中的雜質(zhì)會對?；撬釞z測產(chǎn)生干擾。本研究將建立一種二維液相色譜法檢測嬰幼兒配方奶粉中的牛磺酸，該方法具有準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、操作簡便等優(yōu)點。
1 實驗
1.1 材料與試劑
?；撬針?biāo)準(zhǔn)品，丹磺酰氯為分析純，鹽酸甲胺為分析純，甲酸、三氟乙酸、甲醇、乙腈為色譜純，亞鐵氰化鉀、乙酸鋅為化學(xué)純，超純水（由Millipore Milli-Q超純水儀生產(chǎn)）。
1.2 儀器與設(shè)備
Thermo U 3000雙三元高效液相色譜儀，配有紫外檢測器(DAD)、熒光檢測器(FLD)和一個六通閥；Eppendorf 5804離心機；Wiggens Votex 3000渦旋振蕩儀。
1.3 方法
1.3.1 色譜條件
第一維色譜柱：Agilent XDB-C18：3.0 mm×150 mm，3.5μm；第二維色譜柱：Thermo Gold PFP(全氟苯基柱)：4.6 mm×150 mm，5μm。
A1和B1流動相對應(yīng)泵1，A2和B2對應(yīng)泵2，流動相A1為甲醇，流動相A2為乙腈，流動相B1為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸水溶液，流動相B2為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液。泵1的流速為0.4 mL/min，泵2的流速為1 mL/min；柱溫為35℃；進樣量10μL；一維使用紫外檢測器，其檢測波長為254 nm；二維使用熒光檢測器，其激發(fā)波長為330 nm，發(fā)射波長為530 nm。泵1和泵2的梯度如表1所示。
表1 二維液相色譜流動相梯度
1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
標(biāo)準(zhǔn)儲備液(質(zhì)量濃度約50 mg/L)：精密稱量5 mg標(biāo)準(zhǔn)品用水定容到100 mL。分別準(zhǔn)確取適量上述儲備液，用水稀釋為質(zhì)量濃度2，5，10，15，20 mg/L的溶液。
1.3.3 樣品處理
樣品處理過程參照GB 5009.169-2016[15]第二法：準(zhǔn)確稱取1 g樣品(精確到0.1 mg)于50 mL容量瓶中，加入30 mL水，渦旋10 s，放入超聲振蕩器中超聲提取10min。加入1.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%亞鐵氰化鉀水溶液，渦旋混合，1.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%乙酸鋅水溶液，渦旋混合，用水定容至刻度，充分混勻。樣液于8 000 r/min下離心3 min。
準(zhǔn)確吸取1.00 mL上清液，1.00 mL濃度為80 mmol/L（pH值為9.5）碳酸鈉緩沖液，1.00 mL質(zhì)量濃度為1.5 g/L丹磺酰氯溶液于10 mL離心管中，渦旋10 s，于室溫避光處靜置反應(yīng)2 h(1 h后振搖1次)，加入0.10 mL質(zhì)量濃度為20 mg/L鹽酸甲胺溶液渦旋混合，避光靜置至沉淀完全。取上清過0.22μm尼龍濾膜后進液相色譜分析。
2 結(jié)果與分析
基于多種分離機理的多維色譜可用于復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)化合物的分離和定量測定[16-24]。其中的二維色譜技術(shù)結(jié)構(gòu)簡單，對設(shè)備要求低，已經(jīng)越來越多的應(yīng)用到食品分析中[16,24-26]。
實驗對第二維色譜的的流動相進行了考察，分別考察了純水、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸水溶液、以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液作為B2相。實驗發(fā)現(xiàn)在使用純水時?；撬岬纳V峰峰寬較寬，且對稱性差；使用酸性溶液能明顯改善峰型，而使用0.1%甲酸溶液時?；撬岬臒晒忭憫?yīng)要大于在0.1%三氟乙酸水溶液中的響應(yīng)（色譜圖未給出）。所以最終選擇0.1%甲酸水溶液作為B2相。
2.1 二維色譜流路構(gòu)建與切換時間的確定。
2.1.1 閥切換時間的確定
為了保證將一維色譜柱中的?；撬崛壳懈畹降诙S色譜柱，首先使用標(biāo)準(zhǔn)品對一維色譜圖中的?；撬岢龇逦恢眠M行確認(rèn)，如圖1所示。由圖1可以看出?；撬嵩谝痪S色譜柱的保留時間為4.7 min。因此將閥切換時間的設(shè)定在4.2 min和5.2 min。二維液相色譜的具體連接方法如圖2所示。在0~4.2 min，六通閥處于1、2連通狀態(tài)；在4.2~5.2 min，六通閥處于1和6連通狀態(tài)；5.2~15min，六通閥處于1和2連通狀態(tài)。
圖1 ?；撬針?biāo)準(zhǔn)品一維色譜
圖2 二維液相系統(tǒng)連接示意圖
2.1.2 色譜柱的選擇
二維液相色譜既要考慮2個維度的體系的兼容性，又要考慮這2個維度存在一定的差異，因此該研究選用了C18作為第一色譜柱，PFP色譜柱作為第二色譜柱。在表1液相條件下，?；撬峥梢院碗s質(zhì)得到很好的分離，如圖3所示。
圖3 樣品中?；撬岬亩S液相色譜色譜
2.2 線性關(guān)系和檢出限
使用儲備液，用水稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，然后經(jīng)過和樣品一樣的衍生過程反應(yīng)后，過濾進樣分析。以標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，該方法的線性相關(guān)系數(shù)r≥0.999。以3倍信噪比（S/N）計算方法的檢出限為0.02 mg/100g，以10倍信噪比(S/N)計算方法的定量限為0.05 mg/100g。GB5009.168-2016[18]第二法的定量限為0.1 mg/100g，該方法可以滿足日常嬰幼兒奶粉中牛磺酸的定量需求。
2.3 回收率和精密度
使用乳清粉進行加標(biāo)回收率和精密度實驗。
以定量限、1倍目標(biāo)值和1.5倍目標(biāo)值三個水平進行加標(biāo)回收實驗。結(jié)果如表2所示。
由表2可知：該方法加標(biāo)回收率為97.8%~99.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.56%~3.25%。表明方法回收率和精密度良好。
2.4 實際樣品檢測
采用該方法和GB5009.168-2016第二法[18]對市售的6種嬰幼兒配方奶粉，1個部分水解配方奶粉，以及1個有機奶粉原料進行測定，結(jié)果如表3所示。
表3 實際樣品檢測結(jié)果 mg/100g
由表3可以看出：對于1~6號樣品采用兩種方法得到的結(jié)果基本一致，結(jié)果偏差在小于5%。說明該方法在檢測普通嬰幼兒配方奶粉時和國標(biāo)方法具有很好一致性。
在檢測部分水解配方奶粉時，使用GB5009.168-2016第二法測得的結(jié)果為65.2 mg/100 g，按產(chǎn)品能量為2 000 k J/100 g計算，牛磺酸的含量為3.26 mg/100 kJ，超出國標(biāo)限量要求。使用該方法的測得值為1.84 mg/100 kJ，符合國標(biāo)限量要求。
對于有機奶粉原料樣品，我們從供應(yīng)商得知該樣品為還未添加牛磺酸的原料粉，其本底?；撬豳|(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)該很低。但是使用GB5009.168-2016第二法得到的數(shù)值為29.5 mg/100 g，明顯大于該方法得到的9.12 mg/100 g。
從水解配方奶粉和有機奶粉原料的數(shù)據(jù)可以進一步說明使用該方法可很好的消除某些特殊基質(zhì)樣品中的基質(zhì)干擾，得到比國標(biāo)方法更加準(zhǔn)確的牛磺酸含量。
3 結(jié)論
本文建立了一種使用二維液相色譜檢測嬰幼兒配方奶粉中?；撬岷康臋z測方法，對該方法進行了方法學(xué)驗證，該方法在2~20 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性，線性相關(guān)系數(shù)r≥0.999；定量限為0.05 mg/100g；在 0.05 mg/100g，40 mg/100g，60 mg/100g三個質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平的加標(biāo)回收在97.8%~99.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.56%~3.25%。使用該方法對實際樣品進行檢測，證明該方法準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、操作簡單，抗干擾能力強，適用于嬰幼兒奶粉中?；撬岬臏y定。
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1.2 儀器與設(shè)備
Thermo U 3000雙三元高效液相色譜儀，配有紫外檢測器(DAD)、熒光檢測器(FLD)和一個六通閥；Eppendorf 5804離心機；Wiggens Votex 3000渦旋振蕩儀。
1.3 方法
1.3.1 色譜條件
第一維色譜柱：Agilent XDB-C18：3.0 mm×150 mm，3.5μm；第二維色譜柱：Thermo Gold PFP(全氟苯基柱)：4.6 mm×150 mm，5μm。
A1和B1流動相對應(yīng)泵1，A2和B2對應(yīng)泵2，流動相A1為甲醇，流動相A2為乙腈，流動相B1為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸水溶液，流動相B2為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液。泵1的流速為0.4 mL/min，泵2的流速為1 mL/min；柱溫為35℃；進樣量10μL；一維使用紫外檢測器，其檢測波長為254 nm；二維使用熒光檢測器，其激發(fā)波長為330 nm，發(fā)射波長為530 nm。泵1和泵2的梯度如表1所示。
表1 二維液相色譜流動相梯度
1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
標(biāo)準(zhǔn)儲備液(質(zhì)量濃度約50 mg/L)：精密稱量5 mg標(biāo)準(zhǔn)品用水定容到100 mL。分別準(zhǔn)確取適量上述儲備液，用水稀釋為質(zhì)量濃度2，5，10，15，20 mg/L的溶液。
1.3.3 樣品處理
樣品處理過程參照GB 5009.169-2016[15]第二法：準(zhǔn)確稱取1 g樣品(精確到0.1 mg)于50 mL容量瓶中，加入30 mL水，渦旋10 s，放入超聲振蕩器中超聲提取10min。加入1.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%亞鐵氰化鉀水溶液，渦旋混合，1.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%乙酸鋅水溶液，渦旋混合，用水定容至刻度，充分混勻。樣液于8 000 r/min下離心3 min。
準(zhǔn)確吸取1.00 mL上清液，1.00 mL濃度為80 mmol/L（pH值為9.5）碳酸鈉緩沖液，1.00 mL質(zhì)量濃度為1.5 g/L丹磺酰氯溶液于10 mL離心管中，渦旋10 s，于室溫避光處靜置反應(yīng)2 h(1 h后振搖1次)，加入0.10 mL質(zhì)量濃度為20 mg/L鹽酸甲胺溶液渦旋混合，避光靜置至沉淀完全。取上清過0.22μm尼龍濾膜后進液相色譜分析。
2 結(jié)果與分析
基于多種分離機理的多維色譜可用于復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)化合物的分離和定量測定[16-24]。其中的二維色譜技術(shù)結(jié)構(gòu)簡單，對設(shè)備要求低，已經(jīng)越來越多的應(yīng)用到食品分析中[16,24-26]。
實驗對第二維色譜的的流動相進行了考察，分別考察了純水、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸水溶液、以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液作為B2相。實驗發(fā)現(xiàn)在使用純水時?；撬岬纳V峰峰寬較寬，且對稱性差；使用酸性溶液能明顯改善峰型，而使用0.1%甲酸溶液時?；撬岬臒晒忭憫?yīng)要大于在0.1%三氟乙酸水溶液中的響應(yīng)（色譜圖未給出）。所以最終選擇0.1%甲酸水溶液作為B2相。
2.1 二維色譜流路構(gòu)建與切換時間的確定。
2.1.1 閥切換時間的確定
為了保證將一維色譜柱中的?；撬崛壳懈畹降诙S色譜柱，首先使用標(biāo)準(zhǔn)品對一維色譜圖中的?；撬岢龇逦恢眠M行確認(rèn)，如圖1所示。由圖1可以看出?；撬嵩谝痪S色譜柱的保留時間為4.7 min。因此將閥切換時間的設(shè)定在4.2 min和5.2 min。二維液相色譜的具體連接方法如圖2所示。在0~4.2 min，六通閥處于1、2連通狀態(tài)；在4.2~5.2 min，六通閥處于1和6連通狀態(tài)；5.2~15min，六通閥處于1和2連通狀態(tài)。
圖1 ?；撬針?biāo)準(zhǔn)品一維色譜
圖2 二維液相系統(tǒng)連接示意圖
2.1.2 色譜柱的選擇
二維液相色譜既要考慮2個維度的體系的兼容性，又要考慮這2個維度存在一定的差異，因此該研究選用了C18作為第一色譜柱，PFP色譜柱作為第二色譜柱。在表1液相條件下，?；撬峥梢院碗s質(zhì)得到很好的分離，如圖3所示。
圖3 樣品中?；撬岬亩S液相色譜色譜
2.2 線性關(guān)系和檢出限
使用儲備液，用水稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，然后經(jīng)過和樣品一樣的衍生過程反應(yīng)后，過濾進樣分析。以標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，該方法的線性相關(guān)系數(shù)r≥0.999。以3倍信噪比（S/N）計算方法的檢出限為0.02 mg/100g，以10倍信噪比(S/N)計算方法的定量限為0.05 mg/100g。GB5009.168-2016[18]第二法的定量限為0.1 mg/100g，該方法可以滿足日常嬰幼兒奶粉中牛磺酸的定量需求。
2.3 回收率和精密度
使用乳清粉進行加標(biāo)回收率和精密度實驗。
以定量限、1倍目標(biāo)值和1.5倍目標(biāo)值三個水平進行加標(biāo)回收實驗。結(jié)果如表2所示。
由表2可知：該方法加標(biāo)回收率為97.8%~99.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.56%~3.25%。表明方法回收率和精密度良好。
2.4 實際樣品檢測
采用該方法和GB5009.168-2016第二法[18]對市售的6種嬰幼兒配方奶粉，1個部分水解配方奶粉，以及1個有機奶粉原料進行測定，結(jié)果如表3所示。
表3 實際樣品檢測結(jié)果 mg/100g
由表3可以看出：對于1~6號樣品采用兩種方法得到的結(jié)果基本一致，結(jié)果偏差在小于5%。說明該方法在檢測普通嬰幼兒配方奶粉時和國標(biāo)方法具有很好一致性。
在檢測部分水解配方奶粉時，使用GB5009.168-2016第二法測得的結(jié)果為65.2 mg/100 g，按產(chǎn)品能量為2 000 k J/100 g計算，牛磺酸的含量為3.26 mg/100 kJ，超出國標(biāo)限量要求。使用該方法的測得值為1.84 mg/100 kJ，符合國標(biāo)限量要求。
對于有機奶粉原料樣品，我們從供應(yīng)商得知該樣品為還未添加牛磺酸的原料粉，其本底?；撬豳|(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)該很低。但是使用GB5009.168-2016第二法得到的數(shù)值為29.5 mg/100 g，明顯大于該方法得到的9.12 mg/100 g。
從水解配方奶粉和有機奶粉原料的數(shù)據(jù)可以進一步說明使用該方法可很好的消除某些特殊基質(zhì)樣品中的基質(zhì)干擾，得到比國標(biāo)方法更加準(zhǔn)確的牛磺酸含量。
3 結(jié)論
本文建立了一種使用二維液相色譜檢測嬰幼兒配方奶粉中?；撬岷康臋z測方法，對該方法進行了方法學(xué)驗證，該方法在2~20 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性，線性相關(guān)系數(shù)r≥0.999；定量限為0.05 mg/100g；在 0.05 mg/100g，40 mg/100g，60 mg/100g三個質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平的加標(biāo)回收在97.8%~99.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.56%~3.25%。使用該方法對實際樣品進行檢測，證明該方法準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、操作簡單，抗干擾能力強，適用于嬰幼兒奶粉中?；撬岬臏y定。
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