榮智興，莫紅衛(wèi)，戴智勇，汪家琦，劉洋汝，彭小雨，陳希苗

（澳優(yōu)乳業(yè)（中國(guó)）有限公司，長(zhǎng)沙410200）

0 引 言

乳糖在自然界中僅存在于哺乳動(dòng)物的乳汁中，是乳制品中主要的碳水化合物。在母乳中乳糖是嬰幼兒重要的能量來(lái)源，半乳糖能促進(jìn)腦苷脂類和黏多糖類的生成，因而對(duì)幼兒智力發(fā)育非常重要。但是作為雙糖的乳糖須在乳糖酶作用下，分解成半乳糖和葡萄糖，才能被小腸吸收被人體利用[1-2]。

乳糖不耐受是由于乳糖酶分泌少，不能完全消化分解母乳或牛乳中的乳糖所引起的非感染性腹瀉[3-4]。這在很大程度上限制了人體對(duì)乳制品營(yíng)養(yǎng)成分的消化吸收，從而限制乳制品在人們?nèi)粘Ｉ钪械钠占?。?jù)調(diào)查，亞洲人口中約有70%以上人群患有不同程度的乳糖不耐受癥，中國(guó)人是乳糖不耐受的高發(fā)人群，乳糖酶缺乏發(fā)生率在80%~95%[5-6]。

本文選用由米曲霉發(fā)酵提取的酸性乳糖酶，利用其定向水解奶粉中的乳糖，研究其酸性環(huán)境下水解條件，使乳糖能達(dá)到最大限度的水解，以顯著降低乳糖含量，從而使乳糖不耐受的問題得到解決，也為含乳糖酶的乳制品和直接服用的乳糖酶產(chǎn)品開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

代膳全脂奶粉，酸性乳糖酶（1×105ALU/g），其他所有試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

葡萄糖試劑盒，上海榮盛生物技術(shù)有限公司；搖床振蕩培養(yǎng)箱，上海智成分析儀器有限公司；DK-8AX恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；精密pH計(jì)，METTLER TOLEDO。

1.3 主要檢測(cè)方法

1.3.1 乳糖測(cè)定[7]

采用直接滴定法（GB5009.7—2016）測(cè)定乳粉中的乳糖含量。

1.3.2 乳糖水解率測(cè)定[8]

按照葡萄糖試劑盒說明來(lái)檢測(cè)樣品中葡萄糖的含量（mg/mL）。

乳糖水解率（%）=1.9×樣品中的葡萄糖含量（mg/mL）/水解前的乳糖含量（mg/mL）×100

1.4 工藝流程

全脂乳粉→加水沖調(diào)→調(diào)節(jié)pH→殺菌→冷卻降溫→加酶→搖床恒溫水解→滅酶（100℃，5 min）→降溫→水解率檢測(cè)

1.5 操作要點(diǎn)

（1）沖調(diào)，依據(jù)產(chǎn)品說明書，8平勺（約32 g）放入240 mL溫開水中沖調(diào)；（2）調(diào)節(jié)pH，采用1 moL/L的HCL調(diào)節(jié)到合適pH值；（3）殺菌，沖調(diào)后并調(diào)好pH的奶液水浴65℃，30 min，冷卻至30℃左右；（4）加酶水解，在無(wú)菌條件下加入酸性乳糖酶，放入搖床（150 r/min）中恒溫水解；（5）滅酶檢測(cè)，反應(yīng)完后水解液放入95℃，5 min水浴鍋中滅酶并檢測(cè)乳糖水解率。

1.6 單因素分析酸性乳糖酶的適宜酶解條件

奶粉中乳糖的水解反應(yīng)取決于乳糖酶和底物特性，與水解條件如乳糖酶種類、酶活、底物濃度、溫度、pH值和水解時(shí)間等因素有關(guān)。通過對(duì)酶解反應(yīng)因素對(duì)乳糖水解率的影響，選擇最佳的酶解條件。

1.7 響應(yīng)面優(yōu)化酸性乳糖酶水解條件

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)乳糖酶水解率較大的3個(gè)因素：酶添加量、水解溫度和pH。根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。響應(yīng)面的分析因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析的因素和水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素分析酸性乳糖酶的適宜酶解條件

2.1.1 乳糖酶添加量E/S的確定

由圖1可知，酸性乳糖酶的添加量在0.05%~0.15%時(shí)，乳糖水解率隨添加量的增大而逐漸增大，當(dāng)添加量繼續(xù)增大時(shí)，乳糖的水解率變化很小并逐漸趨于穩(wěn)定，綜合考慮效果和成本，選擇0.15%為酸性乳糖酶的添加量。

2.1.2 酶解溫度的確定

從圖2可以看出，乳糖水解的最適溫度為45℃，乳糖的在酸性乳糖酶作用下的水解率隨溫度的變化為先增后降的規(guī)律。最大水解率出現(xiàn)在中間酶解的最適溫度處，因此選擇45℃為乳糖水解溫度。

2.1.3 酶解pH的確定

從圖3可以看出，乳糖水解的最適pH為5，乳糖的在酸性乳糖酶作用下的水解率隨pH的變化也是先增后降的規(guī)律。最大水解率出現(xiàn)在中間酶解的最適pH處，因此選擇酸性乳糖酶的水解pH 5。

2.1.4 酶解時(shí)間的確定

由圖4可知，乳糖水解率隨時(shí)間呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，在3 h后乳糖的水解率基本趨于穩(wěn)定，此時(shí)水解率達(dá)70%以上。

圖1 E/S對(duì)乳糖水解率的影響

圖2 溫度對(duì)乳糖水解率的影響

圖3 pH對(duì)乳糖水解率的影響

圖4 時(shí)間對(duì)乳糖水解率的影響

2.2 酸性乳糖酶水解條件響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案的結(jié)果

由于乳糖水解率在3 h后基本穩(wěn)定，且后面影響最小，故保持水解時(shí)間為3 h不變，依據(jù)E/S、溫度和pH對(duì)酸性乳糖酶水解工藝的影響，采用響應(yīng)面法Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理[9]，以酸性乳糖酶添加量、水解溫度和pH為自變量，以奶粉中乳糖的水解率為因變量設(shè)計(jì)了3因素3水平共計(jì)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 回歸方程的建立與分析

利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件Design Expert8.05對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，分析結(jié)果見表3和表4。

將17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的數(shù)據(jù)用Design Expert軟件進(jìn)行回歸分析,以乳糖水解率為響應(yīng)值，經(jīng)多元回歸擬合后，各實(shí)驗(yàn)因子對(duì)乳糖水解率的影響可以通過以下二次回歸方程表示：

乳糖水解率=75.72＋6.70A＋2.23B－0.58C－7.29A2－20.94B2－6.03C2+2.45AB－0.40AC＋1.4BC

由表5的分析結(jié)果可知，該模型的F值為71.29，遠(yuǎn)大于 F0.01，達(dá)到極為顯著水平（“Pr＞F”值<0.0001），由“Pr＞F”值可知A、B、A2、B2和C2項(xiàng)也是顯著的，乳糖水解過程中各因素對(duì)乳糖水解率的影響次序?yàn)椋篍/S＞溫度＞pH。該方程失擬項(xiàng)的F值為6.12，P值為0.0563，則失擬檢驗(yàn)不顯著（“Pr＞F”值＞0.05），這表明整個(gè)擬合區(qū)域的擬合情況良好，證明了該模型的合理性，能準(zhǔn)確模擬各因素對(duì)乳糖水解率的影響。

由表4可知，模型的R2為0.9892，說明該模型能解釋98%的乳糖水解率的變化。R2adj＝0.9753和R2＝0.9892值較接近，說明實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)值在可行區(qū)間內(nèi)。由此可說明該模型與實(shí)際情況的擬合較好，可用該模型對(duì)不同條件下的乳糖水解率進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2.2.3 響應(yīng)因素水平的優(yōu)化

用Design Expert軟件，依照回歸方程繪制E/S、溫度和pH的響應(yīng)面，如圖5-圖7所示。

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表

表4 模型可信度分析表

圖5 乳糖酶添加量和溫度對(duì)乳糖水解率

圖6 乳糖酶添加量和pH對(duì)乳糖水解率的影響的影響

圖7 溫度和pH對(duì)乳糖水解率的影響

由圖可以看出，3個(gè)響應(yīng)曲面均為開口向下的凸型曲面，說明響應(yīng)值(乳糖水解率)存在極大值。圖5顯示，在選定的E/S和溫度的條件范圍內(nèi)，乳糖水解率的極大值坐位于兩坐標(biāo)軸編碼的中間區(qū)域。由圖6和圖7可知，回歸方程的響應(yīng)值（乳糖水解率）對(duì)其中兩個(gè)因素水平變化而變化的趨勢(shì)和極大值點(diǎn)都與圖5相似。由表3也可以看出，E/S、溫度和pH三個(gè)因素之間的交互項(xiàng)AB、AC、BC的“Pr＞F”值也均大于0.05，都屬于不顯著水平。由此可知，E/S、溫度和pH值這三個(gè)因素之間的交互作用不明顯。

在選取的各因素范圍內(nèi)，由Design Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析得到，酸性乳糖酶對(duì)奶粉中乳糖水解的最適工藝條件為：E/S 0.16%、溫度45.31℃和pH 4.95，此時(shí)的乳糖水解率是76.87%。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果

為進(jìn)一步驗(yàn)證該實(shí)驗(yàn)的方法條件的可靠性，采用上述條件進(jìn)行奶粉中乳糖的水解并重復(fù)3次試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得奶粉中乳糖水解率為76.5%，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值無(wú)顯著性差異。因此，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化而得到的酸性乳糖酶水解奶粉中乳糖的條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，可操作性好。

3 結(jié) 論

根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)乳糖水解率影響比較明顯的乳糖酶添加量、溫度和pH 3個(gè)工藝條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，得到酸性乳糖酶對(duì)奶粉中乳糖水解的最適工藝條件為：乳糖酶添加量0.16%、溫度45.31℃、pH 4.95，在此條件下奶粉中乳糖的水解率的預(yù)測(cè)值是76.87%；在驗(yàn)證試驗(yàn)中，實(shí)際測(cè)得乳糖水解率為76.5%，與響應(yīng)面優(yōu)化的奶粉中乳糖水解率預(yù)測(cè)值無(wú)顯著性差異。

此研究采用酸性乳糖酶來(lái)水解奶粉中的乳糖，在喝奶時(shí)添加酸性乳糖酶，幫助水解乳糖，促進(jìn)牛奶營(yíng)養(yǎng)成分的吸收和利用，解決乳糖不耐受人群喝奶的困擾，也為含乳糖酶的乳制品和直接服用的乳糖酶產(chǎn)品開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。