杜佳燕，黃海月，蘇曉明，魏 崢

(1.福州大學化學學院，福建 福州 350002；2.福州大學化肥催化劑國家工程研究中心糖生化研究所，福建 福州 350002)

肝素(heparin, HP)和硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS) 是帶有負電荷的線性糖胺聚糖，參與了眾多生物活動過程，如血管形成、血液凝固、細胞粘附及增生和腫瘤轉移等[1-6]。它們的結構是影響糖胺聚糖與蛋白質結合的關鍵因素[7-9]，它們與蛋白質的相互作用與其生物功能息息相關。肝素和硫酸乙酰肝素均由重復的二糖單元組成，二糖單元是由己糖醛酸(hexuronic acid, HexA)和葡萄糖胺(glucosamine, GlcN)以1-4糖苷鍵連接而成，含有較多的N-硫酸化葡萄糖胺(N-sulfated Glucosamine, GlcNS)、N-乙?；咸烟前?N-acetylated, GlcNAc)和較少的N-非取代葡萄糖胺(N-unsubstituted glucosamine, GlcNH3+)殘基。其中，己糖醛酸以葡糖醛酸和艾杜糖醛酸兩種差向異構體形式存在，具有C-2位氧硫酸化。葡萄糖胺上的修飾方式具有C-6位氧硫酸化、N位硫酸化、N位乙?；约昂币姷腘位非取代和C-3位氧硫酸化[10-11]。在肝素/硫酸乙酰肝素的生物合成途徑中，葡糖醛酸和N-乙?；咸烟前肥紫纫?-4糖苷鍵交替連接的方式合成無硫酸化的前體[12-14]，該前體中的N-乙?；咸烟前窔埢贜-脫乙酰/N-磺基轉移酶的作用下生成N-非取代葡萄糖胺中間體，然后該中間體發(fā)生N-硫酸化修飾，生成N-硫酸化葡萄糖胺。隨后發(fā)生的修飾主要有葡糖醛酸的C-5位差向異構化與C-2位氧硫酸化，N-硫酸化葡萄糖胺的C-6位與C-3位氧硫酸化和N-乙?；咸烟前返腃-6位氧硫酸化。多種修飾作用模式和不同修飾程度的組合，導致肝素/硫酸乙酰肝素的結構具有多樣性且高度復雜。

在N-脫乙酰化和隨后的N-硫酸化過程中，N-脫乙酰/N-磺基轉移酶的活性受到限制，產生含量較低的N-非取代葡萄糖胺。在不同來源的生物體中，N-非取代葡萄糖胺的含量存在差異。除了在牛腎硫酸乙酰肝素中，N-非取代葡萄糖胺的含量高達12%[11]外，在其他硫酸乙酰肝素中其含量都普遍較低，通常占0.2%～4%[15-18]。雖然N-非取代葡萄糖胺在硫酸乙酰肝素中的含量較低，但其與一些重要的細胞生物學和病理生理學現(xiàn)象關系緊密[12,19,20-22]。 Hering等[3]研究表明，N-非取代葡萄糖胺殘基可能影響到生物體對損傷組織的再生應答。在腫瘤發(fā)生和轉移的相關研究領域中，N-非取代葡萄糖胺殘基同樣引起了極大關注。有報道[23]指出，乳腺癌細胞中存在含高濃度N-非取代葡萄糖胺殘基的硫酸乙酰肝素，抑制了乙酰肝素酶的活性。利用人工化學合成含有N-非取代葡萄糖胺殘基的四糖進行體外實驗，發(fā)現(xiàn)可以通過抑制乙酰肝素酶的活性從而抑制乳腺癌細胞的轉移。因此，通過建立和表征含N-非取代葡萄糖胺殘基的糖庫[24-26]，可以為闡明含N-非取代葡萄糖胺殘基的糖胺聚糖與蛋白質間的相互作用提供重要的體外實驗來源。但由于其含量少，檢測難度大，N-非取代葡萄糖胺殘基的組分分析和結構表征仍然是一個難題。在天然的肝素/硫酸乙酰肝素或人工合成的衍生物中，構建N-非取代葡萄糖胺殘基的分離和分析方法都具有極大挑戰(zhàn)和重要意義，是更好地理解N-非取代葡萄糖胺殘基生物功能的基礎。

分析肝素和硫酸乙酰肝素的組分含量時，通常使用肝素裂解酶酶解產生12種肝素/硫酸乙酰肝素二糖，再對二糖進行分析測定。目前，分析肝素/硫酸乙酰肝素二糖的方法主要有高效液相色譜法[11]、毛細管電泳法[27]、凝膠色譜法[28]和液相色譜-質譜聯(lián)用法等。其中，液相色譜-質譜聯(lián)用法使用的液相色譜包括排阻色譜[20,29]、親水作用色譜[30-31]和反相離子對色譜[32-34]等。另外，可利用2-氨基吖啶酮(2-aminoacridone, AMAC)與肝素/硫酸乙酰肝素二糖的還原胺化反應，結合反相液相色譜-質譜聯(lián)用技術分析肝素/硫酸乙酰肝素二糖[35-38]。

本研究基于反相液相色譜-電噴霧-離子阱-飛行時間質譜法(RP-LC-ESI-IT-TOF MS)，擬采用AMAC標記二糖，建立高分辨、高重現(xiàn)性的定性和定量體系來分析12種不同的肝素/硫酸乙酰肝素二糖，其中包括4種低含量的N-非取代二糖。希望能夠更好地理解N-非取代葡萄糖胺殘基的生理和病理作用。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

液相色譜-電噴霧-離子阱-飛行時間質譜儀：日本島津公司產品，配有LC-20AD 二元泵、DGU-20A3R 脫氣裝置、SIL-20AC 自動進樣器、CBM-20A 基本通信模塊、PDA 光敏檢測器、CTO-20A 柱溫箱、SPD-M20A 二極管陣列檢測器；CT02-50SR型恒溫真空冷凍濃縮儀：德國Christ公司產品；ODS-2 HYPERSIL C18色譜柱(5 μm×250 mm×4.6 mm)：美國Thermo公司產品。

1.2 主要材料與試劑

肝素鈉：中國國藥集團化學試劑有限公司產品；12種肝素/硫酸類肝素標準二糖(ΔHexA(2S)-GlcNAc(6S)、ΔHexA-GlcNAc(6S)、ΔHexA(2S)-GlcNAc、ΔHexA-GlcNAc、ΔHexA(2S)-GlcNS(6S)、ΔHexA-GlcNS(6S)、ΔHexA(2S)-GlcNS、ΔHexA-GlcNS、ΔHexA(2S)-GlcNH3+(6S)、ΔHexA-GlcNH3+(6S)、ΔHexA(2S)-GlcNH3+、ΔHexA-GlcNH3+)：英國Iduron公司產品；肝素裂解酶Ⅰ(肝素酶EC4.2.2.7)、肝素裂解酶Ⅱ(無EC號)、肝素裂解酶Ⅲ (肝素酶EC4.2.2.8)：中國北京ADHOC公司產品；乙酸銨、2-氨基吖啶酮、氰基硼氫化鈉、乙酸：美國Sigma-Aldrich公司產品；甲醇(色譜純)：美國J. T. Baker公司產品；其他試劑均為國產分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1含N-非取代葡萄糖胺殘基的肝素衍生物的制備 本實驗選擇3種含N-非取代葡萄糖胺殘基的肝素衍生物，制備方法參照文獻[26-27]，簡述如下：1) 將肝素鈉溶液通過H型陽離子交換樹脂，收集流出液，用吡啶中和后，冷凍干燥得肝素吡啶。將肝素吡啶溶于一定比例的二甲亞砜中，反應液透析后冷凍干燥得脫N-硫酸化肝素(2S,6S,NH3+-HP)；2) 將肝素吡啶溶于一定比例的1-甲基-2吡咯烷酮中反應，用NaOH溶液調至pH 8～9后進行透析，反應液冷凍干燥得脫6,N-硫酸化肝素(2S,NH3+-HP)；3)將脫6,N-硫酸化肝素(2S,NH3+-HP)溶于NaOH溶液中反應，用乙酸中和，透析后冷凍干燥得全脫2,6,N-硫酸化肝素(NH3+-HP)。

1.3.2肝素衍生物的肝素酶酶解 取20 μg脫2,6,N-硫酸化肝素溶于30 μL 0.1 mol/L的乙酸鈉緩沖溶液(含0.1 mmol/L乙酸鈣，pH 7.0)中，加入肝素裂解酶Ⅰ、肝素裂解酶Ⅱ和肝素裂解酶Ⅲ各5 mIU，于37 ℃酶解24 h，于100 ℃水浴2 min終止反應。以10 000 r/min離心10 min，取上清液，濃縮至干。脫6,N-硫酸化肝素和脫N-硫酸化肝素均采用上述步驟操作，得到濃縮干燥的酶解產物。

1.3.3肝素二糖的AMAC標記和標準溶液的配制 稱取12種標準肝素/硫酸類肝素二糖各5 μg，混合均勻，加入10 μL 0.1 mol/L的AMAC溶液(AMAC溶解于乙酸-二甲亞砜(V/V,3∶17))，渦旋振蕩20 min。在上述反應溶液中加入10 μL 1.0 mol/L的氰基硼氫化鈉溶液，于45 ℃反應4 h[39]。最后，用50%二甲亞砜將上述AMAC標記的二糖混合物稀釋，分別配制成濃度為20、22、25、30、40 mg/L的系列混合標準溶液，用于建立液相色譜-質譜分析的標準曲線。

肝素衍生物的AMAC標記：采用上述標準肝素/硫酸類肝素二糖的AMAC標記方法對肝素衍生物的干燥樣品進行標記，最后用50%二甲亞砜將AMAC標記后的肝素衍生物混合液的濃度稀釋到0.4 mg/L，用于后續(xù)的液相色譜-質譜分析。

1.3.4RP-LC-ESI-IT-TOF MS分析 色譜條件：ODS-2 HYPERSIL C18色譜柱(5 μm×250 mm×4.6 mm)；流動相：A 為乙酸銨溶液(20、40、60、80 mmol/L，pH 5.6)，B為甲醇；線性梯度洗脫程序：0～100 min(2%～20%B)，100～120 min(20%～50%B)；流速0.3 mL/min；柱溫45 ℃；進樣量10 μL。

質譜條件：電噴霧離子源(ESI)負離子模式；噴霧電壓-3.5 kV；霧化氣(氮氣)流速1.50 mL/min；質量掃描范圍m/z200～1 000；檢測器電壓1.8 kV；加熱模塊(BH)和曲形脫溶劑管(CDL)溫度200 ℃。

標準曲線的建立：測定上述AMAC標記后的肝素/硫酸類肝素二糖混合物的系列混合標準溶液，以AMAC標記后各二糖的母離子響應峰面積(y)對進樣的肝素/硫酸類肝素二糖質量(x)繪制標準曲線。

2 結果與討論

2.1 分離AMAC標記的肝素/硫酸類肝素二糖的RPLC-MS-IT TOF方法

據(jù)文獻報道，Acquity UPLC BEH C18柱[35]和ODS-2 HYPERSIL C18柱[38]已經成功用于定量分析heparin/HS中含量較高的N-取代二糖。Galeotti等[37]和Antia等[38]建立了分析12種肝素/硫酸類肝素二糖的方法，但由于N-非取代二糖與其他二糖的保留時間過于接近，該方法無法實現(xiàn)12種肝素/硫酸類肝素二糖的基線分離。

12種AMAC標記的肝素/硫酸類肝素標準二糖的詳細信息列于表1。本研究選擇多種反向柱，分別對其進行分離分析，結果表明，使用ODS-2 HYPERSIL C18柱分析二糖時，既能夠對8種常規(guī)二糖(N-硫酸化二糖和N-乙酰化二糖)實現(xiàn)基線分離，也可以對另外4種N-非取代二糖達到基線分離。因此選擇ODS-2 HYPERSIL C18柱進行下一步實驗。

表1 肝素/硫酸類肝素二糖的結構和AMAC標記后的相對分子質量Table 1 Structures of heparin/HS disaccharides and relative molecular mass of AMAC-labeled disaccharides

首先，分別使用20、40、60和80 mmol/L的乙酸銨溶液(pH 5.6)作為分離檢測的流動相體系，考察乙酸銨濃度對12種肝素/硫酸類肝素二糖分離效率的影響，結果示于圖1。結果表明，當乙酸銨濃度為20 mmol/L時，ΔHexA(2S)-GlcNH3+(6S)和ΔHexA(2S)-GlcNAc(6S)、ΔHexA-GlcNH3+(6S)和ΔHexA-GlcNAc(6S)、ΔHexA(2S)-GlcNH3+和ΔHexA(2S)-GlcNAc這3對含有相同亞硫酸根個數(shù)的二糖在提取離子流色譜圖中的出峰位置基本一致，糖峰重疊，無法分開。當乙酸銨濃度為40 mmol/L時，12種二糖都能實現(xiàn)基線分離，且峰形較窄，分離效果良好。與圖1a相比，其保留時間明顯增加。在N-硫酸化二糖中，首先被洗脫出來的二糖為ΔHexA(2S)-GlcNS(6S)，然后為含有2個亞硫酸根的ΔHexA-GlcNS(6S)與ΔHexA(2S)-GlcNS，最后為ΔHexA-GlcNS。這可能是因為ΔHexA(2S)-GlcNS(6S)的疏水性最弱[38]。同樣，在N-乙?；蚇-非取代二糖中，首先被洗脫出來的分別是ΔHexA(2S)-GlcNAc(6S)和ΔHexA(2S)-GlcNH3+(6S)。當流動相A中乙酸銨溶液濃度進一步提高時，分離效果和保留時間幾乎不受影響(圖1c和1d)。在質譜分析過程中，使用的流動相鹽濃度越低，對質譜的損傷越小。因此，在保證12種肝素/硫酸類肝素二糖具有良好分離效果的情況下，選擇40 mmol/L作為乙酸銨的最佳分離濃度，盡可能降低對儀器的損傷。

基于該分離方法實現(xiàn)了12種二糖的基線分離，不僅可以在液相色譜-質譜聯(lián)用中使用各二糖各自的m/z分離和分析AMAC標記的肝素/硫酸類肝素二糖，還可以在常規(guī)液相色譜中利用二糖特征的紫外吸收檢測或AMAC的熒光吸收檢測完成定性分析。

注：圖a、b、c、d中流動相A中乙酸銨的濃度分別為20、40、60和80 mmol/L；1.ΔHexA(2S)-GlcNS(6S)；2.ΔHexA-GlcNS(6S)；3.ΔHexA(2S)-GlcNS；6.ΔHexA(2S)-GlcNAc(6S)；7.ΔHexA-GlcNH3+(6S)；8.ΔHexA-GlcNAc(6S)；9.ΔHexA(2S)-GlcNH3+；10.ΔHexA(2S)-GlcNAc；11.ΔHexA-GlcNH3+；12.ΔHexA-GlcNAc；含有2個或3個亞硫酸基團的二糖峰下有重疊峰，為質譜離子源上的亞硫酸根丟失 圖1 乙酸銨濃度對肝素/硫酸類肝素二糖在色譜分離中的影響Fig.1 Influence of the concentration of ammonium acetate on the LC separation of heparin/HS disaccharides

檢測器電壓、加熱模塊和曲形脫溶劑管溫度在AMAC標記的肝素/硫酸類肝素二糖的檢測靈敏度上也起著關鍵性作用。因此，實驗對這些參數(shù)進行了系列調控。結果表明，檢測電壓過低會導致二糖的靈敏度下降。當電壓為1.6 kV時，無法檢測到ΔHexA(2S)-GlcNS(6S)二糖；當電壓為1.7 kV時，ΔHexA(2S)-GlcNS(6S)的檢測靈敏度只有電壓為1.8 kV時的8%。經實驗優(yōu)化，選擇1.8 kV為最佳檢測電壓。此外，加熱模塊和曲形脫溶劑管溫度升高，二糖的檢測靈敏度也會提高。當溫度從100 ℃提高至200 ℃時，二糖在質譜中的檢測靈敏度提高了81%～100%。因此，在后續(xù)分析AMAC標記的肝素/硫酸類肝素二糖的實驗中，選擇檢測電壓為1.8 kV，加熱模塊和曲形脫溶劑管的溫度為200 ℃。

上述質譜分析中，均采用負離子模式，每種N-非取代二糖的質譜圖示于圖2。由圖2可見，ΔHexA-GlcNH3+二糖產生碎片離子m/z530.18；ΔHexA(2S)-GlcNH3+和ΔHexA-GlcNH3+(6S)屬于同分異構體，均出現(xiàn)了碎片離子m/z610.13；ΔHexA(2S)-GlcNH3+(6S)產生了碎片離子m/z690.08，在m/z610.130處的小峰可能是含有單個亞硫酸根的N-非取代二糖(ΔHexA(2S)-GlcNH3+或ΔHexA-GlcNH3+(6S))，這是由于ΔHexA(2S)-GlcNH3+(6S)在MS離子源中脫掉1個亞硫酸根所致。

注：a.ΔHexA-GlcNH3+；b.ΔHexA(2S)-GlcNH3+；c.ΔHexA-GlcNH3+(6S)；d.ΔHexA(2S)-GlcNH3+(6S)；這些二糖分別對應圖1b中的11、9、7、5二糖峰圖2 AMAC標記的N-非取代硫酸類肝素二糖的質譜圖Fig.2 Mass spectra of AMAC-labeled N-unsubstituted HS disaccharides

2.2 肝素/硫酸類肝素標準二糖的定量分析

每個二糖在質譜中具有不同的離子化效率，含有2個或3個亞硫酸根的二糖，在MS離子源中會丟失亞硫酸根。因此，為了校正每個二糖的離子化效率和在質譜離子源上由亞硫酸根丟失引起的質量偏差，采用2.1節(jié)中優(yōu)化的RP-LC-ESI-IT-TOF MS分析方法對AMAC標記后的肝素/硫酸類肝素二糖混合物的系列混合標準溶液進行分析。以AMAC標記后的肝素/硫酸類肝素二糖各自的母離子響應峰面積(y)對相應的質量(x，200～400 ng)做線性回歸，標準曲線示于圖3，線性方程和相關系數(shù)列于表2。從表2的相關系數(shù)R2可以發(fā)現(xiàn)，除ΔHexA-GlcNS(6S)、ΔHexA(2S)-GlcNS和ΔHexA-GlcNH3+的R2為0.98以外，其余二糖的R2均不小于0.99，呈現(xiàn)良好的線性關系。以10倍信噪比S/N確定定量限，ΔHexA(2S)-GlcNS(6S)的定量限為170 ng，ΔHexA(2S)-GlcNH3+和ΔHexA-GlcNH3+的定量限為50 ng，其余二糖的定量限均小于50 ng。

注：a.N-硫酸化二糖；b.N-乙?；牵籧.N-非取代二糖；各二糖序號標識同圖1圖3 AMAC標記的12種二糖的標準曲線Fig.3 Curves of 12 AMAC-labeled disaccharides

肝素/硫酸類肝素二糖Heparin/Heparansulfate disaccharides線性方程Linearequations相關系數(shù)Correlationcoefficients(R2)ΔHexA(2S)-GlcNS(6S)y=0.031x-4.9970.990ΔHexA-GlcNS(6S)y=0.322x+1.7420.983ΔHexA(2S)-GlcNSy=0.352x-9.4850.986ΔHexA-GlcNSy=0.750x-17.6580.992ΔHexA(2S)-GlcNAc(6S)y=0.192x-6.5390.992ΔHexA-GlcNAc(6S)y=1.008x-28.9200.990ΔHexA(2S)-GlcNAcy=1.654x-144.1520.992ΔHex-GlcNAcy=2.715x-178.1060.993ΔHexA(2S)-GlcNH3+(6S)y=0.072x-9.5490.999ΔHexA-GlcNH3+(6S)y=0.160x-7.2670.998ΔHexA(2S)-GlcNH3+y=0.108x-8.0270.997ΔHexA-GlcNH3+y=0.219x-7.7170.983

為評估該方法的準確度和精密度，采用已知組分的AMAC標記的二糖混合物進行驗證。結合各二糖的線性方程，通過3組平行實驗重復測量得到各二糖的含量，列于表3。結果表明，利用本方法得到的混合物中每種二糖的組分含量與實際組分含量基本一致。因此，對含有N-非取代二糖的肝素/硫酸類肝素二糖組分進行定性和相對定量分析時，采用AMAC標記與RPLC-MS-IT-TOF MS相結合的方法具有高分辨、高重現(xiàn)性。

2.3 肝素衍生物樣品的二糖分析

含N-非取代葡萄糖胺殘基的硫酸類肝素具有多種生化功能，特別是其抗腫瘤活性的研究越來越受到關注[23]。因此，在天然的肝素/硫酸類肝素或人工合成的衍生物中，定性與定量檢測N-非取代二糖均具有重要意義。本實驗室已制備出多種N-非取代肝素衍生物，選擇脫N-硫酸化肝素(2S,6S,NH3+-HP)、脫6,N-硫酸化肝素(2S,NH3+-HP)和全脫2,6,N-硫酸化肝素(NH3+-HP)作為測試樣品，采用本研究建立的分析方法對以上3種測試樣品的N-非取代二糖組分進行定性和相對定量分析。每種N-非取代肝素衍生物均取兩份進行平行實驗，用肝素裂解酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的混合物完全酶解后進行AMAC標記，然后進行RPLC-MS-IT-TOF MS分析。三種N-非取代肝素衍生物的提取離子流色譜圖示于圖4。通過表2的線性方程計算得到樣品中每個二糖的組分含量，列于表4。

表3 已知組分的AMAC標記的二糖混合物的相對定量分析Table 3 Relative quantification analysis of AMAC-labeled disaccharide mixtures containing known composition of disaccharides

市售肝素樣品中只含有4種N-硫酸化二糖和4種N-乙酰化二糖。在本實驗選取的3種N-非取代肝素衍生物中，檢測到4種N-乙?；?ΔHexA(2S)-GlcNAc(6S)、ΔHexA-GlcNAc(6S)、ΔHexA(2S)-GlcNAc和ΔHexA-GlcNAc和4種N-非取代二糖(ΔHexA(2S)-GlcNH3+(6S)、ΔHexA-GlcNH3+(6S)、ΔHexA(2S)-GlcNH3+和ΔHexA-GlcNH3+)，但是沒有檢測到 ΔHexA(2S)-GlcNS(6S)、ΔHexA-GlcNS(6S)、ΔHexA(2S)-GlcNS和ΔHexA-GlcNS這幾種N-硫酸化二糖。表明利用各種脫硫酸化反應已成功將N-硫酸化基團轉化為N-非取代基團。

注：a.全脫2,6,N-硫酸化肝素(NH3+-HP)；b.脫6,N-硫酸化肝素(2S,NH3+-HP)；c.脫N-硫酸化肝素(2S,6S,NH3+-HP) ；二糖序號標識同圖1圖4 AMAC標記的N-非取代肝素衍生物二糖的提取離子流色譜圖Fig.4 Extracted ion chromatograms of AMAC-labeled disaccharides of N-unsubstituted heparin-derivative

在脫N-硫酸化肝素(2S,6S,NH3+-HP)中含量最豐富的二糖為ΔHexA(2S)-GlcNH3+(6S)，占二糖總量的39.70%；其余3種N-非取代二糖ΔHexA-GlcNH3+(6S)、ΔHexA(2S)-GlcNH3+和ΔHexA-GlcNH3+的組分含量分別為14.91%、9.98%和3.80%。4種N-非取代二糖的組分差異較大。脫6,N-硫酸化肝素(2S,NH3+-HP)中ΔHexA(2S)-GlcNH3+占總糖量的41.90%，ΔHexA-GlcNH3+為19.28%，ΔHexA-GlcNH3+(6S)為6.24%，沒有檢測到ΔHexA(2S)-GlcNH3+(6S)。全脫2,6,N-硫酸化肝素(NH3+-HP)中最豐富的二糖是ΔHexA-GlcNH3+，占二糖總量的42.50%。脫N-硫酸化肝素(2S,6S,NH3+-HP)、脫6,N-硫酸化肝素(2S,NH3+-HP)和全脫2,6,N-硫酸化肝素(NH3+-HP)中N-非取代二糖的總產率分別高達60.51%、67.43%和68.39%。

表4 3種N-非取代肝素衍生物的二糖組分分析Table 4 Disaccharide composition analysis of 3 N-unsubstituted heparin-derivative

以上結果表明，該方法適用于分析N-非取代二糖存在較大差異的人工合成的肝素衍生物。

3 結論

本研究將AMAC標記與RPLC-MS-IT-TOF MS結合，為肝素/硫酸類肝素二糖分析提供了良好的分離和相對定量效果，能夠實現(xiàn)在同一系統(tǒng)內分離和分析12種肝素/硫酸類肝素二糖，尤其適用于分析少量N-非取代二糖。在肝素衍生物中，不同的N-非取代二糖的含量明顯不同。該方法可以定性、定量分析生物樣品中含有的N-非取代葡萄糖胺的二糖，為進一步研究N-非取代葡萄糖胺的結構與功能提供了可行的檢測方法，有助于更好地理解N-非取代葡萄糖胺殘基在人類健康與疾病管理中的重要作用。