于 巍，陳立峰，王智琴，韓 靜

(1.沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽 110016；2.沈陽化工大學(xué)，遼寧 沈陽 110142；3.遼寧千一測試評價科技發(fā)展有限公司，遼寧 本溪 117000)

吡蚜酮屬于吡啶類或三嗪酮類殺蟲劑，是全新的非殺生性殺蟲劑。關(guān)于吡蚜酮在農(nóng)作物中的殘留量測定已有很多報道，如，馮義志等[1]研究了吡蚜酮在小麥中的含量測定方法；徐金麗等[2]研究了吡蚜酮在煙草中的含量測定方法；劉建華、吳亞堅等[3-4]研究了吡蚜酮不同劑型的含量測定方法；齊暢等[5]研究了果蔬中吡蚜酮的測定方法。目前，尚未見吡蚜酮在大鼠組織等生物樣品中測定方法的報道。

本研究擬采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)測定大鼠組織中的吡蚜酮，探討最高非致死染毒劑量下吡蚜酮原藥在大鼠體內(nèi)的組織分布特征，考察大鼠主要臟器中吡蚜酮濃度的動態(tài)變化過程，并驗證HPLC-MS/MS法的專一性、準(zhǔn)確性及可靠性，以期為吡蚜酮的慢性毒性以及致癌性研究的劑量選擇提供依據(jù)，為其安全性評價提供數(shù)據(jù)支持。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

LC-20A/API4000高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國AB Sciex 公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源(ESI)及Analyst 軟件；電子天平：德國Sartorius公司產(chǎn)品；超純水儀：美國Millipore公司產(chǎn)品，配有0.22 μm終端過濾膜；臺式高速冷凍離心機(jī)：德國Sigma公司產(chǎn)品，配有1.5 mL 轉(zhuǎn)子；高速分散機(jī)：德國IKA公司產(chǎn)品；移液器、電動移液器：德國Eppendorf 公司產(chǎn)品；-20 ℃低溫冷凍儲藏箱：海爾公司產(chǎn)品；大鼠代謝籠：上海辛迪實驗器材有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料、試劑與實驗動物

吡蚜酮原藥：純度99.3%，沈陽科創(chuàng)化學(xué)品有限公司產(chǎn)品；吡蚜酮、內(nèi)標(biāo)吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品：純度均大于99.8%，北京萬佳首化生物科技有限公司產(chǎn)品；乙腈、50%甲酸：色譜純，美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；實驗用水：由Millipore Synergy UV型超純水機(jī)制備。

SPF級SD大鼠，質(zhì)量(200±20) g，許可證號為SCXK(遼)2010-0001，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供。動物引入后，飼養(yǎng)于遼寧千一測試評價科技發(fā)展有限公司屏障環(huán)境動物實驗室。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：Phenomenex Luna C18柱(50 mm×4.6 mm×5 μm)，100 A；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸-乙腈溶液；流速：0.5 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；梯度洗脫程序：0～0.5 min(95%A)，0.5～2.0 min(95%～5%A)，2.0～3.0 min(5%A)，3.0～3.1 min(5%～95%A)，3.1～5.0 min(95%A)。

1.3.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI源)；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)正離子模式(ESI+)；定量離子對：m/z218.3>105.3(吡蚜酮)，m/z256.1>175.1(內(nèi)標(biāo)吡蟲啉)；離子源溫度：500 ℃；噴霧電壓(IS)：5 000 V；碰撞氣(CAD)：20.7 kPa；去簇電壓(DP)：41 V；輔助加熱氣(GAS1)：344.7 kPa；霧化氣(GAS2)：379.2 kPa；氣簾氣(CUR)：172.3 kPa；碰撞能量(CE)：30.0 eV。

1.4 實驗方法

1.4.1溶液配制 準(zhǔn)確稱取吡蚜酮原藥，用0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液配成100 g/L供試品溶液，需在24 h內(nèi)使用。用乙腈配制1.00 g/L吡蚜酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃密閉保存，使用時用乙腈逐級稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。用乙腈配制1.00 g/L吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃密閉保存，使用時用乙腈稀釋成500 μg/L內(nèi)標(biāo)溶液。

1.4.2劑量設(shè)計及染毒 根據(jù)吡蚜酮在大鼠體內(nèi)的毒代動力學(xué)實驗結(jié)果[6]，兼顧雄性大鼠急性經(jīng)口毒性半數(shù)致死劑量LD50大于5 000 mg/kg，將給藥劑量1 000 mg/kg設(shè)為上限[7-8]。隨機(jī)取21只雄性大鼠，分成6組：1組空白對照(1只)，其余大鼠分成5組，每組4只，按設(shè)計劑量開始投藥，投藥前須禁食約18 h。以經(jīng)口胃投法一次給足設(shè)計劑量，給藥后將大鼠放回代謝籠內(nèi)，自由進(jìn)食、飲水。

1.4.3樣品采集 給藥前將空白對照組大鼠解剖，給藥后分別在10 min、2 h、96 h、120 h、144 h時間點解剖一組動物(4只)。采用CO2麻醉，腹主動脈放血后解剖，取心、肝、脾、肺、腎、腦、肌肉、睪丸、脂肪等臟器，分別用生理鹽水和蒸餾水沖洗后，濾紙吸干水分，裝入惰性塑料袋中，置于-20 ℃冷凍，待測。

1.4.4樣品前處理 取約1.00 g室溫解凍后的大鼠臟器樣品(睪丸除外，取一側(cè)睪丸全部處理)，不足1.00 g的臟器全部處理，準(zhǔn)確稱其質(zhì)量；將樣品剪碎后，加入兩倍量的乙腈，置于勻漿機(jī)勻漿至均勻，即為組織勻漿液。移取適量組織勻漿液至1.5 mL離心管中，以15 000 r/min離心10 min，取200 μL上清液，加入200 μL內(nèi)標(biāo)溶液，混勻，待儀器分析。

超過定量上限的樣品，采用空白組織基質(zhì)稀釋后，再依照上述方法進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析方法驗證

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量范圍、準(zhǔn)確度與精密度

依據(jù)文獻(xiàn)[9-10]方法考察了吡蚜酮在肝組織基質(zhì)中濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量范圍，同時考察了吡蚜酮在心、肝、脾、肺、腎、腦、肌肉、脂肪、睪丸等組織基質(zhì)中的準(zhǔn)確度和精密度。

用乙腈將吡蚜酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成濃度分別為1.0、2.0、4.0、8.0、20、80、160、200 mg/L標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，用空白肝組織勻漿液稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，配制成濃度分別為50、100、200、400、1 000、4 000、8 000、10 000 μg/L標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。按1.4.4節(jié)方法將樣品處理后進(jìn)行儀器分析。吡蚜酮的保留時間約2.3 min，內(nèi)標(biāo)吡蟲啉的保留時間約2.9 min，吡蚜酮的最小檢出量為0.5×10-9g，最小檢出濃度為50 μg/L。以吡蚜酮與其內(nèi)標(biāo)吡蟲啉峰面積之比為縱坐標(biāo)，二者濃度之比為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為y=ax+b，結(jié)果列于表1。結(jié)果表明，吡蚜酮在50～10 000 μg/L范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)大于0.98。吡蚜酮標(biāo)樣的典型色譜圖示于圖1，空白組織色譜圖示于圖2，給藥后的組織樣品色譜圖示于圖3。

用乙腈將吡蚜酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成濃度分別為1.6、16、160 mg/L質(zhì)控樣品工作溶液，用空白心、肝、脾、肺、腎、腦、肌肉、睪丸、脂肪組織勻漿液序列稀釋質(zhì)控樣品工作溶液，配制成濃度分別為80 μg/L(LQC)、800 μg/L(MQC)、8 000 μg/L(HQC)質(zhì)控樣品，每個濃度重復(fù)5次，經(jīng)前處理后進(jìn)行測定，結(jié)果列于表2。3個濃度的質(zhì)控樣品準(zhǔn)確度在80%～120%之間，批內(nèi)精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于15%，說明該方法有較好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。

表1 吡蚜酮肝組織基質(zhì)線性方程參數(shù)Table 1 Linear equation parameters of pymetrozine in liver tissue matrix

注：a.吡蚜酮；b.內(nèi)標(biāo)圖1 吡蚜酮標(biāo)樣色譜圖 (肝組織基質(zhì)，1 000 μg/L)Fig.1 Standard chromatograms of pymetrozine (liver tissue matrix, 1 000 μg/L)

注：a.吡蚜酮；b.內(nèi)標(biāo)圖2 空白肝組織基質(zhì)色譜圖Fig.2 Chromatograms of blank liver tissue matrix

注：a.吡蚜酮；b.內(nèi)標(biāo)圖3 給藥10 min后大鼠肺組織樣品色譜圖Fig.3 Chromatograms of rat lung tissue sample after administration

組織基質(zhì)Tissue matrix理論濃度 Theoretical concentration/(μg/L)準(zhǔn)確度Accuracy/%精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Precision RSD/%心8084.11±3.052.31肝108.00±2.640.87脾103.44±4.892.18肺97.78±3.261.01腎100.80±5.332.66腦104.59±6.891.65肌肉103.07±2.792.00睪丸103.97±4.541.80脂肪85.60±1.562.03心80089.26±6.228.05肝105.80±7.890.45脾102.86±8.353.21肺99.54±6.122.00腎104.53±2.542.10腦102.91±6.770.69肌肉101.73±2.760.77睪丸101.92±4.560.70脂肪89.53±3.220.64心800087.28±5.225.98肝102.17±7.441.69脾103.31±5.211.11肺104.17±6.552.25腎104.49±8.691.50腦101.73±5.431.09肌肉101.60±4.681.31睪丸101.78±4.321.26脂肪87.41±5.192.77

2.1.3生物樣品穩(wěn)定性 因組織樣品采集后不能及時進(jìn)行處理和分析，需考察實際操作儲存條件下吡蚜酮組織樣品的穩(wěn)定性。配制理論濃度分別為80 μg/L和8 000 μg/L的肝組織基質(zhì)樣品，每個濃度配制3個平行樣品，分為3組。將第1組生物樣品3次凍融循環(huán)，即于-20 ℃條件下冷凍超過48 h后取出，室溫解凍放置12 h，再次冷凍—解凍，共循環(huán)3次，按照1.4.4節(jié)方法處理和分析；將第2組樣品于室溫放置6 h，按照1.4.4節(jié)方法處理和分析；將第3組樣品于-20 ℃條件下放置15天以上，室溫解凍，按照1.4.4節(jié)方法處理和分析。每一組樣品與新配制的LQC及HQC樣品各測3個平行樣，考察3組穩(wěn)定性樣品峰面積與新配制樣品峰面積之比，結(jié)果列于表3。結(jié)果表明，穩(wěn)定性樣品與新配制樣品的峰面積比值均在80%～120%之間，說明吡蚜酮在本研究考察的儲存條件下較穩(wěn)定[9]。

2.2 吡蚜酮在大鼠組織中的分布研究

分析1.4.3節(jié)獲取的生物樣品中吡蚜酮的濃度，得到吡蚜酮在大鼠各臟器組織中的動態(tài)分布結(jié)果[11-12]，列于表4?？梢?，吡蚜酮在大鼠體內(nèi)各臟器組織中均有分布，10 min時，肺中藥物濃度最高，脾、心、肌肉和腦次之。比較不同臟器組織中藥物濃度隨時間的變化可以發(fā)現(xiàn)，腦和肌肉中藥物濃度峰值出現(xiàn)在10 min，其他組織出現(xiàn)在2 h，比較各組織中藥物濃度峰值，按照由高到低順序排序為：肝>脾>心>肺>腎>肌肉>腦>睪丸>脂肪。在藥物濃度達(dá)到峰值后，各臟器組織內(nèi)藥物濃度隨時間延長逐漸下降，至144 h時，除肝內(nèi)可檢出少量吡蚜酮外，其他各臟器組織中均無檢出。

表3 吡蚜酮在肝組織基質(zhì)中的穩(wěn)定性Table 3 Stability of pymetrozine in liver tissue matrix n=3)

注：表中數(shù)據(jù)=(穩(wěn)定性樣品峰面積/理論樣品峰面積)×100%

表4 大鼠經(jīng)口染毒吡蚜酮后在不同組織中的動態(tài)分布結(jié)果Table 4 Dynamic distribution of pymetrozine in rats after oral administration n=4 μg/L)

注：

以上結(jié)果表明，吡蚜酮廣泛分布于大鼠全身各臟器組織中，其在組織中的分布動態(tài)變化趨勢與在血漿中的變化趨勢基本一致[6]，并且消除較快，無蓄積傾向。同時，吡蚜酮可迅速通過血腦屏障到達(dá)腦組織，也可通過血睪屏障進(jìn)入睪丸組織，但至144 h時，已消除至低于最低檢測限，更進(jìn)一步證明其無致畸作用[13]。

3 結(jié)論

本研究采用HPLC-MS/MS法測定大鼠組織中吡蚜酮濃度，并對分析方法進(jìn)行確證。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好、線性范圍較寬。吡蚜酮組織生物樣品在不同儲存條件下均較穩(wěn)定，進(jìn)一步證實了本研究測試條件的可靠性。

由吡蚜酮在大鼠組織中的分布結(jié)果可知，該除草劑經(jīng)口染毒后，在動物組織中的濃度迅速達(dá)到峰值，隨后迅速下降，至144 h已經(jīng)基本完全消除，不存在蓄積傾向，因此是一種較安全的除草劑。

本研究只考察了吡蚜酮原型在大鼠體內(nèi)的分布狀態(tài)，尚未考察是否存在代謝產(chǎn)物，因此還需進(jìn)一步開展深入研究。