宋洋, 楊艷, 任芳

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院， 遼寧 沈陽 110000)

卵巢癌是女性癌癥死亡的第5大原因，也是世界上致死率最高的婦科腫瘤[1]。因卵巢癌發(fā)病較為隱匿，就診時有超過60%的患者已發(fā)展到晚期。盡管對卵巢癌用腫瘤切除手術配合鉑類或紫杉烷類化療藥物進行積極治療，但其5年生存率仍然只有40%[2]。人類基因組序列數據顯示，只有2%的基因編碼了蛋白質，因此大多數轉錄產物都被認為是非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)，其中長度>200個堿基的ncRNA被稱為長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)[3]。lncRNA已被證明與多種人類疾病以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，這其中也包括卵巢癌[4]。研究發(fā)現lncRNASNHG1能夠促進肺癌[5]、肝癌[6]以及胃癌[7]等的惡性發(fā)展，但對卵巢癌的作用還未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床樣本 收集2014年5月～2018年10月進行手術的上皮性卵巢癌以及癌旁組織22對(患者在手術前未經放化療治療)。組織標本取材后迅速置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.1.2細胞株 人卵巢癌細胞SK-OV-3、OV-90、TOV-112D、HO-8910購自上海中喬新舟生物科技有限公司，CAOV3購自武漢普諾賽生命科技有限公司。SK-OV-3細胞和HO-8910細胞培養(yǎng)于含有雙抗以及15%胎牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)液中，其余細胞均培養(yǎng)于42.5% MCDB105(含1.5 g/L碳酸氫鈉)及42.5% M199(含2.2 g/L碳酸氫鈉)培養(yǎng)液中，同時加入15%胎牛血清以及1%的雙抗。細胞置于含有5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)消化傳代，選用對數生長期的細胞進行實驗。

1.1.3主要試劑 細胞培養(yǎng)液以及胎牛血清均購自Gibco，NC siRNA、lncRNASNHG1 siRNA及NC mimic和miR-199a-3p mimic委托上海吉瑪基因合成，Lipofectamine 2000轉染試劑購自Invitrogen公司，TRLzol試劑以及TIANSeq M-MLV反轉錄酶購自百泰克生物技術有限公司，SYBR Green qPCR Mix購自TOYOBO公司，CCK-8檢測試劑購自日本同仁公司，pMIR-reporter熒光素酶載體購自美國Ambion公司，雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1Real-time PCR 采用TRLzol試劑提取總RNA并通過TIANSeq M-MLV反轉錄成cDNA，實驗過程均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。采用SYBR Green qPCR Mix進行Real-time PCR反應，反應條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72℃ 10 s，35個循環(huán)后檢測其溶解曲線并分析樣本Ct值。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。SNHG1的正向引物為5′-AGGCTGAAGTTACAGGTC-3′，反向引物為5′-TTGGCTCCCAGTGTCTTA-3′；GAPDH正向引物為5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，反向引物為5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。

1.2.2細胞轉染 將對數生長期的細胞接種于6孔板中，待細胞增長到70%融合時采用Lipofectamine 2 000轉染試劑進行細胞轉染，按照試劑盒說明書操作。實驗設置對照組、NC siRNA轉染組和SNHG1 siRNA轉染組。SNHG1 siRNA的序列為5′-CAGCAGTTGAGGGTTTGCTGTGTAT-3′，將此序列打亂后經分析不干擾任何基因表達的序列作為NC siRNA序列。

1.2.3CCK-8實驗 按照1.0×103個細胞每孔的密度將細胞接種至96孔板。分別于細胞轉染后的0、24、48、72及96 h時加入10 μL的CCK-8試劑，2 h后于酶標儀上測量OD450值。

1.2.4雙熒光素酶檢測 分別將含有SNHG1野生型序列(5′-TGACCACTTTCGTAAACTACTGA-3′)的質粒WT-SNHG1和突變型序列(5′-TGACCACTTTCGTAACGATGACA-3′)的質粒MUT-SNHG1與miR-199a-3p mimic或NC mimic共轉染至293T細胞內，24 h后采用雙熒光素酶檢測試劑檢測各組的熒光強度。以熒光素酶pGL-3.0為內參，分析各組的熒光素酶的活性。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 7.0 軟件進行數據分析。用t檢驗進行兩組間的差異比較、單因素方差分析進行3組間的差異比較，P<0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LncRNA SNHG1在卵巢癌、癌旁組織以及卵巢癌細胞株中的表達

Real-time PCR結果表明(圖1)，卵巢癌組織lncRNASNHG1表達水平高于癌旁組織[(0.038±0.057)vs (0.010±0.007)]，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。卵巢癌細胞株CaOV3和OV-90中l(wèi)ncRNASNHG1的表達水平最高(圖1)，因此選擇這兩株細胞用于后續(xù)研究。

2.2 siRNA下調癌細胞株的lncRNA SNHG1表達

如圖2所示，OV-90細胞中SNHG1 siRNA組與NC siRNA組比較，lncRNASNHG1的表達水平分別為(0.37±0.06)和(0.99±0.10)，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CaOV3細胞中SNHG1 siRNA組和NC siRNA組lncRNASNHG1的表達水平分別為(0.19±0.09)和(0.96±0.09)，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果表明SNHG1 siRNA有效下調了兩株細胞中l(wèi)ncRNASNHG1的表達，而轉染NC siRNA未影響lncRNASNHG1的表達。

(1)與癌組織比較，P<0.05圖1 卵巢癌組織、癌旁組織及癌細胞株中l(wèi)ncRNA SNHG1的表達Fig.1 Expression of lncRNA SNHG1 in ovarian cancer tissue, the adjancet tissues and cancer cell strains

注：A為OV-90，B為CaOV3；(1)與NC siRNA組比較，P<0.05圖2 轉染siRNA后OV-90及CaOV3卵巢癌細胞株中l(wèi)ncRNA SNHG1的表達Fig.2 Expression of lncRNA SNHG1 after transfection with siRNA

2.3 下調lncRNA SNHG1對卵巢癌細胞增殖的影響

如圖3所示，與NC siRNA轉染組比較，轉染SNHG1 siRNA 48 h時，OV-90細胞的增殖能力顯著降低(P<0.05)，而CaOV3細胞在SNHG1 siRNA轉染24 h后細胞增殖能力顯著降低(P<0.05)。此結果表明下調lncRNASNHG1能夠抑制卵巢癌細胞的增殖。

(1)與NC siRNA組比較， P<0.05圖3 下調lncRNA SNHG1對細胞增殖的影響Fig.3 Effects of down-regulation of lncRNA SNHG1 on cell proliferation

2.4 lncRNA SNHG1對miR-199a-3p的調控作用

雙熒光素酶結果顯示，野生型SNHG1與miR-199a-3p mimic共轉染能夠顯著降低雙熒光素酶的活性，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而將SNHG1與miR-199a-3p的結合序列突變的突變型SNHG1與miR-199a-3p mimic共轉染則不影響雙熒光素酶的活性，差異具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4。此結果表明lncRNASNHG1能夠通過miR-199a-3p特異性結合序列吸附miR-199a-3p、進而調控其表達。

(1)與MUT-SNHG1+miR-199a-3p mimic組比較， P<0.05圖4 lncRNA SNHG1對miR-199a-3p的調控作用Fig.4 Regulatory effects of lncRNA SNHG1 on miR-199a-3p

3 討論

現已證明許多l(xiāng)ncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，lncRNA表達的異常也已被作為多種腫瘤的預后標志物，如lncRNAAFAP1-AS1[8]、lncRNAUCA1[9]等。lncRNASNHG1位于11號染色體，在多種腫瘤組織中異常高表達并且能夠促進肺癌[5]、肝癌[6]、胃癌[7]、食管癌[10]以及前列腺癌[11]細胞的增殖，并且與這些腫瘤的不良預后密切相關。然而lncRNASNHG1在卵巢癌中的作用還未見報道。本研究分析了22對卵巢癌及癌旁組織，結果發(fā)現lncRNASNHG1在卵巢癌中的表達水平顯著高于癌旁組織，因此本研究推測lncRNASNHG1在卵巢癌的發(fā)展中也發(fā)揮了重要作用。

眾所周知，異常增殖是腫瘤細胞的標志之一，抑制腫瘤細胞的增殖是抗腫瘤研究的關鍵所在[12-14]。前人研究發(fā)現下調lncRNASNHG1能夠抑制胃癌細胞的增殖、克隆形成以及細胞周期轉換[7]。在肺癌細胞中下調lncRNASNHG1不僅能夠抑制肺癌細胞的增殖還能夠誘導其凋亡[5]。類似的作用在其他腫瘤細胞中也多次被證明[15-17]。本研究在已明確lncRNASNHG1在卵巢癌組織中高表達的情況下，在兩株lncRNASNHG1表達最高的卵巢癌細胞中下調了lncRNASNHG1的水平，Real-time PCR結果顯示干擾效率均在60%以上，可以進行后續(xù)研究。本研究的CCK-8結果顯示下調lncRNASNHG1后細胞的增殖能力顯著受到抑制，表明lncRNASNHG1參與了卵巢癌細胞的增殖，并且lncRNASNHG1具有作為抗卵巢癌治療靶點的潛力。越來越多的證據表明，lncRNA參與了許多重要的生物學過程，例如細胞信號調節(jié)、基因印跡、染色質修飾、轉錄激活、轉錄后調節(jié)以及蛋白功能調控等[18]。自2011年Salmena等[19]提出競爭性內源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)的假說后，人們對lncRNA作用機制又有了新的認識。ceRNA假說中指出lncRNA可以通過miRNA反應元件(microRNA response elements，MRE)結合miRNA，發(fā)揮類似海綿的作用吸附miRNA進而調控miRNA的表達。這種作用機制已經在多種腫瘤細胞中被反復證明[20-22]。本研究通過生物信息學分析發(fā)現lncRNASNHG1上包含有miR-199a-3p的MRE，而雙熒光素酶檢測發(fā)現，野生型SNHG1和miR-199a-3p mimic共轉染工具細胞293T確實能夠顯著降低熒光素酶的活性，而突變型SNHG1載體與miR-199a-3p mimic共轉染則對熒光素酶的活性沒有影響，因此，lncRNASNHG1確實能夠通過MRE結合miR-199a-3p。Yasuto等[23]通過miRNA芯片分析發(fā)現miR-199a-3p在卵巢癌細胞中表達顯著降低。在卵巢癌細胞中過表達miR-199a-3p能夠抑制卵巢癌細胞的增殖、侵襲、黏附，抑制卵巢癌細胞異種移植瘤的體內生長并且阻礙促腫瘤信號通路c-Met、ERK以及AKT的激活[23]。因此本研究推測下調lncRNASNHG1可能通過釋放miR-199a-3p而發(fā)揮了抑制卵巢癌細胞增殖的作用。

綜上，本研究結果表明lncRNASNHG1與卵巢癌的進展密切相關，可作為卵巢癌預后的指示分子。此外，下調lncRNASNHG1能夠抑制卵巢癌細胞的增殖，因此，lncRNASNHG1有望成為治療和預防卵巢癌的潛在靶點。