張敏， 劉莉， 王洪鳳， 孟小夏， 王鵬嬌， 高秀麗**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025; 2.貴陽(yáng)德昌祥藥業(yè)有限公司， 貴州 貴陽(yáng) 550002)

銀翹散出自清代醫(yī)學(xué)家吳瑭《溫病條辯》，被稱為“辛涼平劑”，該方由金銀花、連翹、薄荷、牛蒡子、荊芥穗、淡豆豉、蘆根、淡竹葉、桔梗和甘草十味中藥組成，在臨床上廣泛用于治療外感風(fēng)寒，發(fā)熱頭痛，咽喉疼痛等[1-3]，亦被收載于《中國(guó)藥典》2015年版中?！吨袊?guó)藥典》2015年版中銀翹散僅以方中牛蒡子中牛蒡苷作為含量測(cè)定控制指標(biāo)[4]，但處方中又以金銀花、連翹為君藥，入藥量較大，因此僅以牛蒡苷單一成分的含量測(cè)定不足以較好地控制本品質(zhì)量。用常規(guī)方法測(cè)定多個(gè)成分含量來(lái)評(píng)價(jià)藥品的研究已有報(bào)道[5-7]，但這些方法存在著對(duì)照品消耗量大，操作復(fù)雜及繁鎖的缺陷。因此，本實(shí)驗(yàn)引入“一測(cè)多評(píng)”法對(duì)銀翹散進(jìn)行多指標(biāo)的質(zhì)量控制，以牛蒡苷為內(nèi)參物，通過(guò)建立其與綠原酸、連翹酯苷A、連翹苷的相對(duì)校正因子進(jìn)行含量計(jì)算，探討一測(cè)多評(píng)法在銀翹散質(zhì)量評(píng)價(jià)中應(yīng)用的可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 高效液相色譜儀，賽默飛UltiMate3000高效液相色譜儀，Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Thermo SyncronisC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，TB-215D型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；SG8200H型超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司)。銀翹散購(gòu)于貴州德昌祥藥業(yè)有限公司，牛蒡苷(批號(hào)120903-201109)，綠原酸(批號(hào)110753-201415)，連翹苷(批號(hào)110821-201514)，連翹酯苷A(批號(hào)111810-201405)對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，乙腈、甲醇為色譜純，娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1色譜條件 色譜柱Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)梯度洗脫，線性洗脫程序?yàn)?～10 min，14%～15%A；10～20 min，15%～17%A；20～25 min，17%～24%A；25～30 min，24%～28%A；30～40 min，28%～32%；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃，分析時(shí)間40 min。上述色譜條件下，各組分分離度良好。

1.2.2混合對(duì)照品溶液制備 分別取牛蒡苷、綠原酸、連翹苷以及連翹酯苷A對(duì)照品適量，精密稱定，加80%甲醇制備成濃度分別為309，344、452、76 mg/L的混合對(duì)照品溶液。

1.2.3供試品溶液制備 取銀翹散樣品適量(約0.5 g)，精密稱定，精密加人80%甲醇25 mL置具塞錐形瓶中、密塞、稱定重量，超聲處理(功率500 W，頻率59 kHz)30 min，放冷后再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量、搖勻、過(guò)濾，取續(xù)濾液。

1.2.4陰性樣品溶液制備 按銀翹散處方比例(金銀花100 g、連翹100 g、桔梗60 g、薄荷60 g、淡豆豉50 g、淡竹葉40 g、牛蒡子60 g、荊芥40 g、蘆根100 g和甘草40 g)，分別制得不含金銀花、連翹、牛蒡子的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液，結(jié)果見圖1。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系考察

按“1.2.2”項(xiàng)下制備混合對(duì)照品溶液，以80%的甲醇逐級(jí)稀釋得線性關(guān)系考察所需的系列混合對(duì)照品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以各對(duì)照品峰面積(y)對(duì)其相應(yīng)的質(zhì)量濃度(x)進(jìn)行線性回歸，得到各對(duì)照品的回歸方程，見表1，結(jié)果顯示，相關(guān)系數(shù)(r)≥0.999 1，各對(duì)照品在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 校正因子計(jì)算

分別精密吸取“1.2.2”項(xiàng)下制備各質(zhì)量濃度混合對(duì)照品溶液10 μL，在上述色譜條件下，進(jìn)樣測(cè)定，按公式fk/m=fk/fm=(Wk×Am)/(Wm×Ak)(Ak為內(nèi)參物峰面積，Wk為內(nèi)參物的質(zhì)量或濃度，Am為其他組分m的峰面積；Wm為其他組分m的質(zhì)量或濃度)[8]，以牛蒡苷為內(nèi)參物，分別計(jì)算其對(duì)綠原酸、連翹酯苷A、連翹苷的相對(duì)校正因子f，見表2。

2.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液10 μL連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄4種成分保留時(shí)間及峰面積，結(jié)果牛蒡苷，綠原酸、連翹酯苷A、連翹苷的峰面積(RSD)分別為1.23%，2.22%，0.89%，2.51%，均小于3%，表明精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取銀翹散粉末約0.5 g、共6份，精密稱定，按1.2.3項(xiàng)下制備供試品溶液。結(jié)果顯示，綠原酸、連翹酯苷A、連翹苷及牛蒡苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.73%、1.42%、0.19%及0.87%；綠原酸、連翹酯苷A、連翹苷、牛蒡苷的RSD分別為1.55%，1.67%，2.34%，1.02%，均小于3%，說(shuō)明該方法的重復(fù)性良好。

注：1為綠原酸，2為連翹酯苷A，3為連翹苷，4為牛蒡苷；A為混合對(duì)照品,B為銀翹散樣品，C為金銀花陰性，D為連翹陰性，E為牛蒡子陰性圖1 混合對(duì)照品、供試品及陰性樣品的HPLC結(jié)果Fig.1 HPLC of mixed reference substances, Yinqiaosan sample, and negative samples

表1 銀翹散中4種成分的線性回歸方程及其線性范圍Tab.1 Linear regression equations and linear range of the components

表2 銀翹散中3種成分相對(duì)牛蒡苷的校正因子Tab.2 Relative correction factors of four constituents in Yinqiaosan

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液10 μL，于0，2，4，8，12，24 h分別進(jìn)樣，記錄保留時(shí)間及峰面積。結(jié)果綠原酸、連翹酯苷A、連翹苷及牛蒡苷的峰面積RSD分別為1.28%、1.19%、2.04%及0.98%，均小于3%， 說(shuō)明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 加樣回收率

精密稱取已知含量的銀翹散0.25 g，共6份，加入一定量對(duì)照品溶液，按1.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按1.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，銀翹散中綠原酸、連翹苷、連翹酯苷A和牛蒡苷回收率分別為100.6%、100.6%、99.52%和99.88%，RSD均小于3.0%，說(shuō)明此方法能夠準(zhǔn)確測(cè)定銀翹散中4種指標(biāo)性成分的含量。

2.7 校正因子重復(fù)性考察

試驗(yàn)分別考察了Agilent 高效液相色譜儀及Thermo UltiMate3000高效液相色譜儀兩種色譜系統(tǒng)和Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)及Thermo Syncronis C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)兩種色譜柱，所得的相對(duì)校正因子見表3。結(jié)果顯示，相對(duì)校正因子在不同的儀器及不同的色譜柱下具有良好的重現(xiàn)性。

表3 不同儀器和不同色譜柱測(cè)得相對(duì)校正因子Tab.3 Different instruments and columns measured relative correction factor

2.8 待測(cè)組分色譜峰的定位

建立QAMS法的目的是只使用一種對(duì)照品即牛蒡苷，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)綠原酸、連翹酯苷A以及連翹苷3種成分的同步測(cè)定。本文采用各待測(cè)成分相對(duì)于牛蒡苷的相對(duì)保留值作為色譜峰定位標(biāo)準(zhǔn)，考察了其在不同品牌高效液相色譜儀和不同色譜柱上的重復(fù)性，結(jié)果表明在不同儀器和不同色譜柱下，各成分間相對(duì)保留值變化不大，RSD在0.30%～4.3%，見表4。因此，本研究選用相對(duì)保留值作為目標(biāo)色譜峰的定位指標(biāo)較為合適。

2.9 樣品測(cè)定

取銀翹散樣品，共計(jì)10批次，分別按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄綠原酸、連翹酯苷A、連翹苷和牛蒡苷的色譜峰峰面積，分別采用外標(biāo)一點(diǎn)法(ESM)和一測(cè)多評(píng)法(QAMS)，計(jì)算銀翹散中4種成分的含量，并對(duì)兩種方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較(表5)，兩種方法的相對(duì)偏差均在3%以內(nèi)，說(shuō)明一測(cè)多評(píng)法用于銀翹散進(jìn)行多指標(biāo)成分的質(zhì)量評(píng)價(jià)是可行的。

表4 不同儀器和色譜柱測(cè)得的相對(duì)保留值Tab.4 Relative retention time of different instruments and columns

表5 ESM及QAMS樣品測(cè)定結(jié)果比較(n=3)Tab.5 Determination of samples

3 討論

銀翹散作為一直沿用至今的中醫(yī)經(jīng)典方劑，具有良好的解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌等功效，臨床上也被廣泛用于治療流行性感冒、急性扁桃腺炎、咽喉炎、肺炎、皰疹、麻疹、流行性腮腺炎等病毒性感染疾病。但是，銀翹散屬于中藥復(fù)方制劑，其質(zhì)量控制成為一大難點(diǎn)。中藥多成分、多功效的作用特點(diǎn)，決定著單一成分難以全面評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量，因此，多成分多指標(biāo)的含量測(cè)定成為當(dāng)前國(guó)際上廣泛認(rèn)可的質(zhì)量評(píng)價(jià)模式[9-11]。目前為止，采用外標(biāo)法測(cè)定銀翹散中單個(gè)或多個(gè)成分來(lái)評(píng)價(jià)其質(zhì)量的研究已有很多報(bào)道，由于需要多種成分的定量測(cè)定，所以這些方法存在對(duì)照品消耗量大、成本高、操作繁瑣等缺點(diǎn)。因此，本研究首次采用一測(cè)多評(píng)法測(cè)定銀翹散中綠原酸、連翹苷、連翹酯苷A和牛蒡苷的含量。選用廉價(jià)易得的牛蒡苷對(duì)照品為內(nèi)參物，建立銀翹散中多指標(biāo)成分定量的一測(cè)多評(píng)法。

本實(shí)驗(yàn)考察了不同儀器和不同色譜柱條件下的相對(duì)校正因子的重現(xiàn)性，結(jié)果表明各成分相對(duì)校正因子的重現(xiàn)性較好。對(duì)比外標(biāo)一點(diǎn)法的定量測(cè)定結(jié)果，一測(cè)多評(píng)法計(jì)算所得含量與外標(biāo)一點(diǎn)法測(cè)定所得實(shí)測(cè)值無(wú)顯著性差異，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)計(jì)算所得的相對(duì)校正因子可以用于銀翹散中4種成分的定量測(cè)定。