張冰琳，夏霜莉，馬琛婧，李秀芳，代 蓉

（云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南 昆明 650500）

下肢缺血性疾病是動脈狹窄或閉塞而導(dǎo)致肢體遠端組織灌注不足的一類疾病，以動脈硬化閉塞癥、血栓閉塞性脈管炎和糖尿病足最為常見[1]，有極高的致殘率、致死率，危害著人類健康。在缺血性疾病發(fā)生發(fā)展過程中，機體具有一定的代償能力，主要表現(xiàn)為血管新生和側(cè)支循環(huán)建立[2]，但這種內(nèi)源性的修復(fù)能力有限，尚不足以有效的緩解缺血部位的功能恢復(fù)，因此，通過藥物促進缺血部位修復(fù)對下肢缺血的治療具有重要意義。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，天麻80%乙醇提物具有促進腦缺血再灌注損傷模型大鼠（Middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）腦內(nèi)血管新生的作用，但其對外周缺血的作用未見報道，因此本實驗通過阻斷股動脈法復(fù)制小鼠下肢缺血模型，觀察天麻醇提物對該模型動物血管新生的作用，為其用于治療下肢缺血性疾病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 TRIzolTM試劑（Thermo Fisher scientific，191012），PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser（perfect Real Time） （Takara，AGH 1533A），PowerUpTMSYBR Green，Master Mix（Thermo Fisher scientific，662399），Anti-Ki67一抗（Abcam，GR3237895-1），Tomato-lectin （Vactor laboratories，TL-1176），羊抗兔 IgG H&L（Alexa Fluor 488）（Abcom，GR3176293-1），F(xiàn)luorshield Mounting Medium With DAPI（Abcam，GR3182624-6），山羊血清（北京索萊寶科技有限公司，SL034），OCT（Thermo Fisher scientific，387208），DNase/RNase-Free Water（北京索萊寶科技有限公司，20180628）。

1.2 天麻醇提物 稱取天麻樣品500 g，粉碎，過10目篩。加80%乙醇6 L，75℃回流提取2 h后，取上清，上清為黃色液體；殘渣加80%乙醇6 L回流提取2 h，合并提取液，濃縮得醇提物46 g。

1.3 儀器 激光散斑血流檢測視頻系統(tǒng)（PeriCam PS），實時熒光定量PCR儀（QuantStudio 5），梯度PCR儀（ABI Veriti），冰凍切片機（CRYOSTAR NX50），熒光顯微鏡（Ci-L），電凝 Pro’sKit（1PKSC109B）。

1.4 實驗動物 SPF級雄性昆明種小鼠，6周齡，體質(zhì)量（20±2）g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，合格證號：SCXK（遼）2015-0001。

1.5 復(fù)制小鼠下肢缺血模型及分組 昆明種小鼠注射10%水合氯醛進行麻醉，小鼠完全麻醉后，將其仰臥位固定于37℃恒溫操作臺，右側(cè)腹股溝皺痕處剃毛消毒后剪一0.5 cm切口，暴露股動脈，小心分離出股神經(jīng)、靜脈、股動脈、髂動脈、旋股外側(cè)動脈，用電凝阻斷股動脈（位置：股動脈中靠近髂外動脈分支處下端，旋股外側(cè)動脈上端處，注意不要損傷靜脈和神經(jīng)），確認無出血后縫合手術(shù)切口并消毒；術(shù)后30 min使用激光散斑檢測兩側(cè)后肢血流量，缺血側(cè)下肢血流量下降至未缺血側(cè)50%以下為造模成功。

將實驗動物隨機分為模型組、假手術(shù)組、天麻醇提物1、3、7、14 d處理組，每組12只。各組小鼠造模后灌胃給予天麻醇提物0.94 g/kg，模型組、假手術(shù)組灌胃給予等量蒸餾水，給藥體積均為0.2 mL/10 g體重。

1.6 檢測指標(biāo)及方法

1.6.1 激光散斑檢測血流量 用異氟烷麻醉小鼠后，將其仰臥位固定于37℃恒溫操作臺，右側(cè)腹股溝皺痕處剃毛消毒，將小鼠后肢腳掌部置于激光散斑儀的紅外十字投射區(qū)域，調(diào)整位置并對齊，分別監(jiān)測小鼠兩個后肢的血流量，并記錄后肢血流的基礎(chǔ)值。

1.6.2 免疫熒光檢測新生血管 術(shù)后第7、14天，處死小鼠，取缺血側(cè)下肢腓腸肌，置于4%多聚甲醛固定后，依次進行梯度脫水、OCT包埋、冰凍切片處理。采用免疫熒光法，檢測 Ki67、Tomato-Lectin、DAPI的表達，3個指標(biāo)重合區(qū)域即為新生血管，進行熒光顯微鏡拍照（1∶200）。

1.6.3 促血管新生因子mRNA表達的影響 給予天麻醇提物1、3、7、14 d后，取小鼠缺血下肢腓腸肌按照試劑說明提取總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明，進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以其為模板，GAPDH做內(nèi)參，各血管新生調(diào)控因子引物序列見表1，反應(yīng)條件：95℃變性15 s，60℃退火1 min，反應(yīng)完畢，計算各基因的相對表達水平，相對表達水平等于 2-△△Ct，其中△Ct=Ct目的基因－Ct GAPDH；△△Ct=△Ct處理樣本－△Ct對照樣本（對照樣本為假手術(shù)組）。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血流量變化情況 激光散斑檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠手術(shù)側(cè)血流量明顯下降（P<0.001），缺血側(cè)下肢血流量下降至未缺血側(cè)50%的動物視為造模成功；與模型組比較，術(shù)后3、7 d，天麻醇提物組小鼠手術(shù)側(cè)血流量增加（P<0.001），見表2、圖1。

表2 天麻醇提物對下肢缺血小鼠手術(shù)側(cè)血流量的影響（±s，n=12，%）

表2 天麻醇提物對下肢缺血小鼠手術(shù)側(cè)血流量的影響（±s，n=12，%）

注：與假手術(shù)組相比，△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

時間 假手術(shù)組 模型組 天麻醇提物組缺血前 1.02±0.18 0.99±0.19 0.96±0.16缺血 30 min 0.98±0.16 0.39±0.10△△△ 0.45±0.10 3 d 0.95±0.12 0.45±0.11△△△ 0.64±0.14***7 d 0.94±0.16 0.51±0.10△△△ 0.69±0.14***14 d 0.99±0.20 0.64±0.12△△△ 0.70±0.13

圖1 天麻醇提物對下肢缺血小鼠血流量的影響

圖2 天麻醇提物對下肢缺血小鼠7 d新生血管的影響

2.2 Tomato-Lectin、Ki67的陽性表達 肌肉組織的熒光免疫分析結(jié)果顯示：與模型組比較，術(shù)后7、14 d，天麻醇提物組小鼠缺血側(cè)下肢腓腸肌Tomato-Lectin、Ki67的陽性表達增多，見圖2、圖3。

圖3 天麻醇提物對下肢缺血小鼠14 d新生血管的影響

2.3 qPCR檢測結(jié)果

2.3.1 VEGF-A的表達情況 qPCR檢測結(jié)果分析顯示：與假手術(shù)組比較，術(shù)后1、14 d，模型組小鼠下肢缺血側(cè)腓腸肌VEGF-A表達增加（P<0.05，P<0.001）；與模型組比較，術(shù)后1、3 d，天麻醇提物組小鼠下肢缺血側(cè)腓腸肌VEGF-A表達增加（P<0.01，P<0.05），見表3。

表3 下肢缺血小鼠腓腸肌中VEGF-A mRNA的表達（±s，n=6）

表3 下肢缺血小鼠腓腸肌中VEGF-A mRNA的表達（±s，n=6）

注：與假手術(shù)組相比，△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

時間 假手術(shù)組 模型組 天麻醇提物組1 d 1.00±0.00 1.63±0.56△ 3.55±1.15**3 d 1.00±0.00 1.15±0.31 2.38±1.25*7 d 1.00±0.00 0.85±0.41 2.00±1.20 14 d 1.00±0.00 1.93±0.41△△△ 1.97±0.64

2.3.2 VEGFR-2的表達情況 qPCR檢測結(jié)果分析顯示：與假手術(shù)組比較，術(shù)后14 d，模型組小鼠下肢缺血側(cè)腓腸肌VEGFR-2表達增加（P<0.001）；與模型組比較，術(shù)后7 d，天麻醇提物組小鼠下肢缺血側(cè)腓腸肌VEGFR-2表達增加（P<0.05），見表4。

2.3.3 Angpt2的表達情況 qPCR檢測結(jié)果分析顯示：與假手術(shù)組比較，術(shù)后 1、3、7、14 d，模型組小鼠下肢缺血側(cè)腓腸肌Angpt2表達增加（P<0.05、P<0.01）；與模型組比較，術(shù)后 1、3、7 d，天麻醇提物組小鼠下肢缺血側(cè)腓腸肌Angpt2表達增加（P<0.05、P<0.01），見表 5。

表4 下肢缺血小鼠缺血側(cè)腓腸肌中VEGFR-2 mRNA的表達（±s，n=6）

表4 下肢缺血小鼠缺血側(cè)腓腸肌中VEGFR-2 mRNA的表達（±s，n=6）

注：與假手術(shù)組相比，△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

時間 假手術(shù)組 模型組 天麻醇提物組1 d 1.00±0.00 1.17±0.27 1.18±0.12 3 d 1.00±0.00 1.04±0.39 1.35±0.62 7 d 1.00±0.00 1.67±0.72 3.74±1.79*14 d 1.00±0.00 2.61±0.79△△△ 2.89±2.44

表5 下肢缺血小鼠缺血側(cè)腓腸肌中Angpt2 mRNA的表達（±s，n=6）

表5 下肢缺血小鼠缺血側(cè)腓腸肌中Angpt2 mRNA的表達（±s，n=6）

注：與假手術(shù)組相比，△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

時間 假手術(shù)組 模型組 天麻醇提物組1d 1.00±0.00 2.55±0.99△△ 4.62±1.37*3d 1.00±0.00 2.86±1.33△△ 8.44±5.42**7d 1.00±0.00 4.08±2.41△ 17.14±13.60*14d 1.00±0.00 14.37±12.92△ 8.54±7.36

3 討論

下肢缺血性疾病是常見的外周動脈疾病之一，主要原因是動脈狹窄或閉塞而引起下肢動脈的供氧量與需氧量之間不平衡所致[3]。臨床主要表現(xiàn)為間歇性跛行、靜息痛、潰瘍及壞疽，嚴重者甚至可導(dǎo)致截肢或死亡。目前常見的治療方法有外科手術(shù)、介入治療、藥物溶栓等，但均達不到良好的治療效果[4-7]。近年來促血管新生技術(shù)的出現(xiàn)，使得在缺血部位重建側(cè)肢循環(huán)，恢復(fù)有效血供逐漸成為可能，從而為缺血性疾病提供了新的治療策略[8-10]。課題組前期實驗結(jié)果表明，天麻醇提物能促進腦缺血后腦內(nèi)血管新生，但其對外周缺血的作用未見報道，為進一步研究其是否具有促進外周缺血部位血管新生作用，本實驗采用股動脈阻斷法復(fù)制小鼠下肢缺血模型，該模型能夠較好地模擬臨床病人下肢缺血的病理狀態(tài)，反應(yīng)機體下肢嚴重缺血、供血不足的多個階段，包括發(fā)生、演進和修復(fù)等過程[11]。給予天麻醇提物后，采用激光散斑掃描儀檢測術(shù)后1、3、7、14 d的缺血側(cè)下肢血流量，觀察血流恢復(fù)情況，結(jié)果顯示，術(shù)后3、7 d，缺血側(cè)血流增加（P<0.001），提示天麻醇提物能促進下肢缺血小鼠的血流恢復(fù)；采用免疫熒光三標(biāo)法，檢測術(shù)后7、14 d的Ki67、Tomato-Lectin、DAPI的表達。Ki67是增殖細胞的標(biāo)記物，Tomato-Lectin可以標(biāo)記血管內(nèi)皮細胞，DAPI標(biāo)記細胞核，3個指標(biāo)重合區(qū)域為新生血管。結(jié)果顯示，術(shù)后7 d，Ki67/Tomato-Lectin的陽性表達明顯，提示天麻醇提物可以促進模型動物缺血側(cè)的血管新生。

血管新生是一個多信號介導(dǎo)、多細胞參與調(diào)控的過程。在缺血/缺氧情況下，缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxiainduciblefactor-1，HIF-1）在組織缺血部位聚集，作為缺血情況的傳感器，激活與缺血性損傷相關(guān)的血管新生過程[12]。其中VEGF-A/VEGFR-2信號通路參與調(diào)控血管新生的整個過程。在缺血早期VEGF-A和Angpt2大量表達，VEGF-A選擇性的作用于內(nèi)皮細胞膜上的酪氨酸受體VEGFR-2，使血管通透性增加并促進血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、出芽參與損傷部位的血管生成[13-15]，而血管生成素家族成員Angpt2在VEGF-A存在的條件下，能促進血管結(jié)構(gòu)松解，消除血管基底膜和周細胞對內(nèi)皮的支撐作用，使內(nèi)皮容易浸潤、遷移、黏附，增強了VEGF-A的促血管新生作用[16-19]。qPCR 檢測術(shù)后 1、3、7、14 d 促血管新生因子的表達，實驗結(jié)果表明，術(shù)后1、3 d，缺血側(cè)VEGFA、Angpt2表達上調(diào)，術(shù)后7 d，VEGFR-2和Angpt2表達上調(diào)，提示天麻醇提物能促進模型動物下肢缺血是通過調(diào)節(jié)VEGF-A/VEGFR-2信號通路中促血管新生因子VEGF-A、VEGFR-2、Angpt2 mRNA的表達而發(fā)揮作用的。

綜上所述，天麻醇提物對小鼠下肢缺血模型具有促血管新生，增加缺血部位血流量，促進側(cè)支循環(huán)建立的作用，其作用機制可能與促進促血管新生因子VEGF-A及其受體VEGFR-2、Angpt2的表達相關(guān)。