汪碧云，伍庭鳳，李舒婷，謝琳玲，曾 蕾

（1.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學附屬中山中醫(yī)院，廣東 中山 528400；3.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡期女性中較常見的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，根據(jù)不同的診斷標準，約影響9%～18%的育齡期女性[1-2]。其主要表現(xiàn)為月經(jīng)失調(diào)、多毛、不孕等，常合并胰島素抵抗（IR）。PCOS發(fā)病機制目前尚不明確，涉及到遺傳、環(huán)境、精神心理因素等多個方面，可能為多因素共同作用的結(jié)果。目前對于PCOS的治療尚無特效藥物，多根據(jù)患者的具體情況個體化治療，包括調(diào)整月經(jīng)周期、促進生育、調(diào)整代謝等。由于PCOS缺乏特異性西藥治療，越來越多的學者關(guān)注中醫(yī)中藥對PCOS的防治。

中醫(yī)古籍沒有關(guān)于PCOS病名的記載，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可歸為“月經(jīng)過少”“月經(jīng)后期”“閉經(jīng)”“崩漏”以及“不孕”等范疇?，F(xiàn)代中醫(yī)各醫(yī)家對PCOS的治療略有差異，但其病機之本多責之于腎、肝、脾，緣此三臟功能失常，致沖任失調(diào)、痰壅胞宮、瘀血阻絡(luò)而發(fā)為本病。丹梔逍遙散原方出自明代薛己的《內(nèi)科摘要》，其方根據(jù)《太平惠民和劑局方》中的逍遙散加減而來，具有疏肝清熱、養(yǎng)血健脾之功效，主治肝郁血虛內(nèi)熱證。臨床多用于PCOS肝經(jīng)郁火證，該證型的患者多有高雄激素的表現(xiàn)。動物實驗證明該方能降低PCOS模型大鼠的抗米勒管激素（AMH）及雄激素（T）的水平，并能改善PCOS的IR情況[3-4]。但由于中藥復(fù)方藥物多且成分復(fù)雜，其具體的作用機制尚不明。因此需要系統(tǒng)地研究藥物、化合物、蛋白、基因及疾病的相互作用過程，以進一步明確該方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，查找丹梔逍遙散的活性成分，并預(yù)測其作用靶點，通過建立藥物——疾病靶點的網(wǎng)絡(luò)圖，探索丹梔逍遙散治療PCOS的作用機制，為中藥復(fù)方的機制論證提供新思路。

1 材料與方法

1.1 丹梔逍遙散活性成分篩查 丹梔逍遙散的主要方藥組成包括牡丹皮、梔子、當歸、白芍、柴胡、茯苓、白術(shù)、甘草等，在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP[5]檢索上述各味中藥，得到相關(guān)活性化合物后，以藥物口服生物利用度（OB）≥30%，藥物相似性（DL）≥0.18為條件進一步篩選。將最終得到的活性成分導(dǎo)入化學信息數(shù)據(jù)庫Pubchem[6]，檢索各個活性成分的規(guī)范SMILES結(jié)構(gòu)和化學結(jié)構(gòu)式。

1.2 丹梔逍遙散潛在靶點的預(yù)測 將各活性成分的結(jié)構(gòu)導(dǎo)入到Swiss Target Prediction[7]數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，預(yù)測其作用靶點，根據(jù)相關(guān)性的高低選取潛在作用靶點。

1.3 PCOS的相關(guān)靶點數(shù)據(jù)構(gòu)建 疾病靶點的查詢基于人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards[8]，以“Polycystic O-vary Syndrome”為關(guān)鍵詞搜索。獲得相關(guān)靶點后，為便于數(shù)據(jù)分析，使用Uniprot[9]將靶點的Gene Symbol轉(zhuǎn)換成Uniprot ID。轉(zhuǎn)換完成后，繪制藥物-疾病靶點的Venn 圖（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），得到藥物作用的潛在靶點。

1.4 構(gòu)建靶點-靶點相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖 將丹梔逍遙散作用與PCOS的潛在靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，對于無相互作用的靶點予以剔除，將全節(jié)點關(guān)系信息導(dǎo)入到Cytoscape構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，使用Network Analyzer插件分析網(wǎng)絡(luò)圖，以Degree值大小對各靶點進行排序，取Degree＞10的核心靶點重新構(gòu)建PPI圖。

1.5 靶點的信號通路分析和生物信息富集分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫對核心靶點進行生物學過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）及細胞成分（cellular component，CC）的 GO 分析；并利用Cytoscape里的ClueGO聯(lián)合CluePedia插件進行KEGG分析。以此明確丹梔逍遙散治療PCOS的相關(guān)生物信息及調(diào)控通路。

2 結(jié)果

2.1 丹梔逍遙散活性成分篩查 在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索丹梔逍遙散各味中藥，共獲得1 081個活性成分，根據(jù)DL及OB進一步篩選后，最終得到162個活性成分，其中牡丹皮8個，柴胡16個，梔子15個，白芍12個，白術(shù)2個，茯苓15個，甘草92個，當歸2個。去除無化學結(jié)構(gòu)式及未預(yù)測到靶點的活性成分，以及刪除重復(fù)項后，最終得到142個有效活性成分，構(gòu)建藥物及活性成分網(wǎng)絡(luò)圖，其中粉色的節(jié)點為藥物共有的活性成分（如圖1所示）。

圖1 各個藥物的活性成分網(wǎng)絡(luò)圖（粉色為共有的活性成分）

2.2 潛在靶點預(yù)測 對活性成分進行靶點預(yù)測后得到483個靶點。在Gene Cards數(shù)據(jù)庫檢索到PCOS相關(guān)靶點共3 619個。在Uniprot數(shù)據(jù)庫中限定物種為人，由于客觀未知原因，最終疾病靶點有3 451個成功轉(zhuǎn)化ID。用Venn圖分析疾病與藥物靶點，得到140個藥物作用的潛在靶點。將潛在靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，將PPI網(wǎng)絡(luò)中全節(jié)點關(guān)系導(dǎo)入到Cytoscape，使用Network Analyzer對網(wǎng)絡(luò)進一步分析，將Degree≤10的節(jié)點剔除。對剩下的84個核心靶點進一步分析，得到網(wǎng)絡(luò)圖2。

2.3 丹梔逍遙散作用于PCOS的核心靶點的網(wǎng)絡(luò)分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫對核心靶點進行GO分析，設(shè)置最小基因富集單位為2，以P＜0.05為有意義，最終得到 286個BP、81個MF和 34個CC。利用Cytoscape對其進行KEGG富集，設(shè)置Kappa score為0.4，最小富集單位為3，篩選P＜0.05的結(jié)果，最終得到83條通路，包括卵巢類固醇生成、磷脂酰肌醇3激酶 /蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路、IR信號通路、雌激素信號通路、子宮內(nèi)膜癌等通路（圖3）。為進一步探索丹梔逍遙散治療PCOS的相關(guān)通路作用機制，通過KEGG中的KEGG Mapper，把核心靶點映射到相關(guān)通路中，最終得到多個通路圖，圖4為其中的一條卵巢類固醇激素生成通路圖，綠色標識為丹梔逍遙散的核心靶點。

3 討論

丹梔逍遙散為中醫(yī)古籍的經(jīng)典方劑，但和其他中醫(yī)方劑一樣，中藥成分的復(fù)雜性導(dǎo)致其難以解釋藥物治療疾病的具體作用機制。通過生物信息學構(gòu)建藥物和疾病的互作網(wǎng)絡(luò)，整合藥物作用的靶點，對藥物的作用機制及開發(fā)有一定的指導(dǎo)意義。

圖2 藥物與疾病核心靶點交互作用的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 Cytoscape中ClueGO對核心靶點富集出的KEGG通路圖

圖4 卵巢類固醇激素生成通路圖，綠色標識為本研究中的核心靶點

丹梔逍遙散作為治療PCOS常用的方劑之一，對于PCOS以高雄激素血癥為主要表現(xiàn)的患者有較好的治療效果，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法探索本方療效的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機制。

3.1 化合物作用靶點 目前已經(jīng)有關(guān)于本方中關(guān)鍵化合物對PCOS的作用機制研究。槲皮素（quercetin）是一種黃酮類化合物，為柴胡、梔子、牡丹皮及甘草的共有的化合物。已經(jīng)證明槲皮素可以促進肝臟己糖激酶（HK）和葡糖激酶（GK）活性，并降低 PCOS大鼠白介素 1β（IL-1β）、白介素 6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的水平，改善大鼠的胰島素抵抗（IR）狀態(tài)[10-11]。它還可以增加PCOS模型大鼠子宮的雌激素受體α（ERα）和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白 4（GLUT4）基因的表達[11]，這可能是PCOS合并不孕的新的治療方向。同樣在人體也已經(jīng)證明口服槲皮素可以通過上調(diào)脂聯(lián)素受體和激活A(yù)MP激活蛋白激酶（AMPK）改善患者的IR狀態(tài)[12-13]。

芍藥苷（paeoniflorin）可以抑制大鼠卵巢睪酮的合成，并對刺激大鼠卵巢芳香酶活性以促進雌二醇合成[14]，還能促進脂肪細胞腺苷的釋放，激活腺苷A1受體，增加葡萄糖的攝取[15]。

黃芩苷（baicalin）可以通過抑制PCOS模型大鼠的卵巢HSD3B2基因表達，降低雄激素的生成[16]，還能上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2（GLUT2）和GLUT4的表達，刺激肝細胞對細胞外葡萄糖濃度的瞬時響應(yīng)和長期響應(yīng)，對葡萄糖轉(zhuǎn)運進行精細調(diào)控，從而改善肝IR狀態(tài)[17]。

茯苓酸（pachymic acid）可以調(diào)節(jié)IL-6、TNF-α抑制PCOS的炎癥狀態(tài)，減少氧化應(yīng)激，改善IR，減少卵巢顆粒細胞的凋亡，促進卵泡發(fā)育[18]。藏紅花酸（crocetin）作為一種天然類胡蘿卜素，能改善肥胖誘導(dǎo)的IR[19]，還可以調(diào)節(jié)PCOS小鼠的動情周期，恢復(fù)其紊亂的激素水平，從而促進排卵[20]。

以上各類化合物以及其他山柰（kaempferol）、柚皮素（naringenin）等均能通過不同的途徑改善PCOS的高雄激素血癥/IR/低度炎癥情況，體現(xiàn)了丹梔逍遙散治療PCOS多成分、多靶點的特點。

3.2 核心靶點的富集分析 對核心靶點的GO富集分析提示丹梔逍遙散作用于PCOS可能與甾體激素合成、細胞增殖、氧化還原等多個BP過程有關(guān)。MF層分析其涉及到酪氨酸激酶、類固醇激素、ATP等；CC層面分析提示其涉及到細胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、細胞質(zhì)、受體復(fù)合物及膜筏等多細胞成分。

在對核心靶點的KEGG富集分析中，進一步體現(xiàn)了丹梔逍遙散通過多個通路對PCOS產(chǎn)生作用，包括氧化應(yīng)激、激素合成、代謝等多個方面，涉及到PI3K/Akt、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、甾體激素合成及胰島素等多個信號通路。

IR作為PCOS病機的關(guān)鍵之一，不僅存在于PCOS患者的外周組織中，同時也表達于卵巢及子宮內(nèi)膜局部，降低患者的受孕機率并增加流產(chǎn)風險。胰島素信號傳導(dǎo)通路主要有2條，一條為PI3K/Akt途徑。當胰島素與胰島素受體結(jié)合，促進胰島素受體底物（IRS）磷酸化，進而激活PI3K，生成第二信使PIP3，激活下游的Akt，調(diào)節(jié)糖代謝。PCOS患者的胰島素受體底物-1（IRS-1）介導(dǎo)的PI3K活性下降以及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（GLUT4）減少，造成IR狀態(tài)[21]。同時，PCOS-IR患者的胰島素可能通過PI3K/Akt通路促進子宮內(nèi)膜的異常增生[22]。另一條為絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（MAPK/ERK）促有絲分裂通路。當PCOS-IR時，2條信號通路失衡，MAPK/ERK活化，導(dǎo)致PI3K/Akt信號通路缺陷，可以進一步促進IR 形成[23]。

目前的研究已經(jīng)證實PCOS患者存在代謝性炎癥狀態(tài)，且其代謝性炎癥可進一步促進患者的代謝紊亂。而PI3K/Akt通路不僅與PCOS的胰島素代謝有關(guān)，還與PCOS患者的炎癥及氧化應(yīng)激狀態(tài)相關(guān)，Zhao等人[24]利用特異性抑制劑探索 NF-κB、Akt、JNK、Erk1/2等通路，發(fā)現(xiàn)WNT5a主要依賴于PI3K/Akt/NF-κB信號通路誘導(dǎo)PCOS患者的炎癥及氧化應(yīng)激。

高雄激素血癥表現(xiàn)的痤瘡、脫發(fā)、油脂分泌旺盛等中醫(yī)多辨證為肝郁化火，治以丹梔逍遙散多有療效。已用實驗證明丹梔逍遙散能降低PCOS瘦素水平，抑制AMH分泌等，從而改善高雄激素血癥[3，25]。另外根據(jù)關(guān)鍵靶點的KEGG通路圖所知（如圖4所示），丹梔逍遙散降雄的機理可能與 CYP17、CYP19A1、CYP1B1、17β-HSD 等有關(guān)。CYP17主要調(diào)節(jié)17α-羥化酶和17，20-裂解酶活性，為雄激素合成的關(guān)鍵酶。PCOS患者的17α-羥化酶活性增加而17，20-裂解酶活性下降，致使兩者活性失調(diào)從而引起雄激素合成增加[26]。CYP17可能為丹梔逍遙散作用的重要靶點之一，具體需待進一步實驗認證。

綜上所述，網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)果提示丹梔逍遙散在治療PCOS上共涉及到142個活性成分、84個核心靶點，其作用機制包括甾體激素合成、氧化還原等，涉及到卵巢類固醇生成、PI3K/Akt、IR等多個信號通路，體現(xiàn)了中藥治療疾病的多中心、多靶點、多途徑的作用特點。本研究涉及到的部分靶點及分子機制已被相關(guān)研究證實，另有一部分挖掘出的靶點及相關(guān)通路可作為下一步研究的理論基礎(chǔ)，為丹梔逍遙散的作用機制的進一步研究提供方向。