程玉芬, 張志偉, 賈永霞, 陳連福1,, 于慧1,*

?

對葉榕花序不同發(fā)育時期氣味成分的變化及其對傳粉者的吸引作用

程玉芬1,2,3, 張志偉4, 賈永霞3, 陳連福1,3, 于慧1,3*

(1. 中國科學(xué)院植物資源保護(hù)與可持續(xù)利用重點實驗室，廣州 510650; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3. 中國科學(xué)院華南植物園，廣州 510650; 4.曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 山東 曲阜 273165)

為探討榕果發(fā)育過程中氣味揮發(fā)物的動態(tài)變化及其對傳粉者行為的調(diào)節(jié)作用，比較對葉榕()不同發(fā)育時期花序揮發(fā)物的變化，并結(jié)合Y形嗅覺儀檢測對葉榕傳粉榕小蜂對不同花序的選擇性。結(jié)果表明，在3個發(fā)育時期的花序中共檢測到64種化合物，對葉榕采用“泛化”策略吸引傳粉榕小蜂，十一烷、-欖香烯、-芹子烯、-依蘭油烯可能是對傳粉榕小蜂起吸引作用的物質(zhì)。雌前期花序氣味與雌花期相似，間花期與雌前期、雌花期的有顯著差異，傳粉榕小蜂對雌前期和雌花期花序具有明顯的選擇傾向，對間花期花序表現(xiàn)出驅(qū)避性，表明對葉榕與傳粉者存在“推-拉”作用模式。雌前期花序釋放的氣味，有助于傳粉者對寄主的定位。同一時期個體間的氣味成分存在空間異質(zhì)性，這種異質(zhì)性在間花期更加顯著，表明氣味成分受環(huán)境影響。間花期花序氣味由于不需要特異性地吸引傳粉者，因而更容易發(fā)生變化。這有助于更好地理解榕樹揮發(fā)性物質(zhì)的組成特點，以及化學(xué)機制在維持榕樹-榕小蜂共生體系中的關(guān)鍵作用。

對葉榕；隱頭花序；揮發(fā)性化合物；化學(xué)信號

榕屬()植物廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，目前已知有750余種[1]。隱頭花序是本屬植物最典型的特征，俗稱榕果(fig)或者隱頭果(synco- nium), 小花著生在膨大中空的花序托內(nèi)，僅通過小孔苞片(ostiolar bracts)構(gòu)成的小孔與外界相連。榕樹依賴傳粉榕小蜂為其授粉，而傳粉榕小蜂必須借助榕樹隱頭花序果作為孵育后代的場所，兩者在形態(tài)構(gòu)造、生活史上相互配合，共同演化，形成了高度特化的共生體系[2–3]，是研究物種協(xié)同進(jìn)化的經(jīng)典范例[2,4]。在榕樹-傳粉榕小蜂專性共生關(guān)系中，復(fù)雜的生存環(huán)境，有限的花期資源以及傳粉者出飛后短暫的存活時間，決定了傳粉榕小蜂能夠快速找到寄主，是榕樹-傳粉榕小蜂共生關(guān)系得以維持的關(guān)鍵[5]。在寄主遠(yuǎn)距離定位上，傳粉榕小蜂視覺所起到的作用可以忽略[6]。目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，雌花期榕果釋放出特異性氣味，傳粉榕小蜂依靠觸角上多種嗅覺感受器識別寄主花序氣味，從而正確定位寄主的位置[7]。

花香揮發(fā)物屬于植物的次生代謝產(chǎn)物，按生物合成途徑可分為萜烯類、苯丙酸類和脂肪族等三大類, 在迄今調(diào)查的50%以上的科中都有分布[8]，已鑒定的植物揮發(fā)性化合物超過1 700多種，約占已知植物次生代謝物的1%[9]。在植物與傳粉昆蟲互作體系中，植物花氣味被認(rèn)為是一種比視覺信號更古老的引誘劑[10]。缺少運動能力的植物主要通過花器官上的腺體釋放具有一定香味的揮發(fā)性物質(zhì)，而傳粉昆蟲則通過識別植物的氣味來尋找“特異”的植株[11]。對于專性傳粉體系而言，植物釋放的特異性花氣味是維持傳粉者專一性的主要原因[12–13]。植物揮發(fā)物以兩種方式吸引傳粉者[5,14]：第一種是“泛化”(generalization)策略，特異性化學(xué)信號是由一系列常見化合物通過一定配比形成；第二種是“?；?specialization)策略，即通過釋放某一不常見的單一化合物來實現(xiàn)特異性。多數(shù)榕樹通過“泛化”策略吸引傳粉者，僅在雞嗉子榕()中檢測到單一成分對甲基苯甲醚起著特異性化學(xué)信號的作用[15]。

Galil等將榕屬植物隱頭花序的發(fā)育過程劃分為5個時期[16]：雌前期(prefemale phase)，榕果內(nèi)花序發(fā)育至可被授粉或產(chǎn)卵前，又稱為A期；雌花期(female phase)，長短柱雌花成熟，苞片松動或者打開，小蜂可以進(jìn)入果內(nèi)產(chǎn)卵或者授粉，又稱為B期或者接受期(receptive phase)；間花期(interfloral phase)，長柱花授粉至種子發(fā)育成熟前，短柱花經(jīng)產(chǎn)卵至榕果小蜂羽化及雄花成熟前，又稱為C期;以及雄花期(male phase)和花后期(postfloral phase)。傳粉榕小蜂只能在雌花期進(jìn)入花序果給里面的雌花授粉或在其內(nèi)產(chǎn)卵，而榕果的雌花期通常只持續(xù)幾天時間。榕樹有兩種繁殖體系，雌雄同株和雌雄異株，二種類型在數(shù)量上約各占一半。雌雄同株多為高大喬木, 分布于林冠上層，榕果內(nèi)同時分布有雄花、長柱雌花(授粉后發(fā)育成種子)和短柱雌花(產(chǎn)卵后發(fā)育成蟲癭)[17–18]。雌雄異株是雌、雄株分離, 多為灌木, 雄株花序有雄花和短柱的雌花，雌株花序內(nèi)只有長柱雌花。從居群的角度看，雌雄同株榕樹在榕果物候上表現(xiàn)出居群內(nèi)株間異步而株內(nèi)同步的特性，即同一株榕樹上榕果發(fā)育時期往往相同，而在雌雄異株榕樹上，常表現(xiàn)出株內(nèi)異步，即同一株上往往同時有多個發(fā)育時期的榕果，但是雄花期與雌花期較少出現(xiàn)重疊。

關(guān)于榕樹花序氣味的研究中，已有40多種榕樹揮發(fā)性氣味的組成成分被鑒別出來[7]，組成成分都以萜類為主，但每種榕樹所含化合物種類、主要成分、各成分所占比例及特異性化合物組成趨向于泛化或特化的程度都存在著較大差異[14]，多數(shù)研究都集中于種間雌花期花序氣味比較及傳粉前和傳粉后花序氣味成分的變化上[5–6,19–20]，研究結(jié)果顯示雌花期花序?qū)鞣壅呔哂形?，不同種榕樹的雌花期氣味具有特異性[14]，雌花期花序在進(jìn)入間花期后，揮發(fā)性氣味釋放量降低，化合物種類減少[20]。但是，雌前期花序氣味如何過渡到雌花期，兩個發(fā)育時期發(fā)生了怎樣的變化，雌花期在進(jìn)入間花期后氣味如何變化，以及不同發(fā)育時期花序?qū)鞣坌》涞奈θ绾?，相關(guān)研究還較為缺乏。

對葉榕()為?？?Moraceace)榕屬聚果榕亞屬(subgen.)植物，灌木或小喬木, 廣泛分布于廣州地區(qū)，雌雄異株，全年結(jié)果，榕果物候具有明顯的株內(nèi)異步性，即在同一時間段，對葉榕植株上往往同時有雌前期、雌花期、間花期的榕果。其傳粉者為s[21]。利用對葉榕不同花序期氣味揮發(fā)物的分析，可以在同一時間段采集到不同發(fā)育時期的花序氣味，避免了因采樣時間不齊，而引入的新的干擾因素。本研究收集了對葉榕3個發(fā)育時期(雌前期、雌花期、間花期)榕果的氣味揮發(fā)物，并對不同時期的花序進(jìn)行傳粉榕小蜂的Y形嗅覺儀實驗，擬探討對葉榕不同時期隱頭花序氣味化合物組成和變化；對葉榕傳粉榕小蜂對不同時期的花序的選擇傾向。本研究有助于更好地理解榕屬植物特異性化學(xué)信號的構(gòu)成特點，以及化學(xué)信號如何調(diào)控榕樹-榕小蜂專性共生關(guān)系，以揭示化學(xué)信號在物種生殖隔離形成中扮演的重要角色。

1 材料和方法

1.1 材料

選取中國科學(xué)院華南植物園(113°21′ E, 23°11′ N)內(nèi)的對葉榕雄株。該區(qū)年降雨量1 623.6~1 899.8 mm，年均溫為21.8℃，最高溫在7-8月，最低溫在1月[22]，10-翌年3月為干季，4-9月為濕季，降水主要發(fā)生在濕季。

植物氣味的散發(fā)易受溫度、光照等外界條件影響，同種植物不同植株的氣味組合成分不同，因此，為確保數(shù)據(jù)的可靠性以及后期降維分析，采集單個雄株內(nèi)同一發(fā)育時期花序的氣味作為該花序時期的1個樣本，每個樣本的榕果用量(8~28個)取決于榕果大小，每個花序時期的樣本量不少于5個。

1.2 揮發(fā)物采集方法

為避免天氣等因素的干擾，氣味采集都選在晴朗的天氣進(jìn)行。采用動態(tài)頂空吸附法[7]收集對葉榕雌前期、雌花期和間花期花序的揮發(fā)物。吸附劑包括Tenax TA (60/80目)和Carbotrap (20/40目), 購于北京飛美斯分析科技有限公司。采樣前在采樣小管內(nèi)加入100 ngL–1的正壬烷和十二烷作為內(nèi)標(biāo)。采集的榕果裝入一端扎緊的特氟龍膜袋內(nèi)，另一端扎緊與采樣管相連，采樣管后接氣流計。在氣泵的帶動下，氣體以300 mL min–1的流速流經(jīng)采樣管，氣味揮發(fā)物被管內(nèi)的吸附劑吸附。同時相同實驗條件下，收集實驗環(huán)境的空氣作為空白對照。采集到雌前期、雌花期和間花期花序氣味樣品分別為5、5和6個。采集到的樣品及時送往園內(nèi)公共實驗室進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)的分析。

1.3 揮發(fā)物分析方法

采集的對葉榕花序揮發(fā)物樣品利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GCMS-QP2010Plus, SHIMADZU)進(jìn)行分析。GC的分析條件為: HP-5MS石英毛細(xì)管柱(30.0 m×0.25 mm×0.25m); 進(jìn)樣口是PTV1進(jìn)樣口，進(jìn)樣采用分流模式，分流比是10.0。柱溫40℃保持5 min, 程序升溫以7.5 ℃min–1升溫至280℃, 保持8 min；進(jìn)樣口溫度程序40℃保持2.5 min。總流量25.0 mL min–1，柱流量為2.0 mL min–1，線速度51.0 cm s–1，吹掃流量3.0 mL min–1。柱前壓112.0 kPa; 進(jìn)樣量2.0L。載氣為氦氣。MS條件: 電子電離方式, 掃描范圍20~450 amu, 電子能量為70 eV；傳輸線溫度250℃；離子源溫度230℃。

花序揮發(fā)物成分鑒定采用目前普遍認(rèn)可的保留指數(shù)(retention index)定性法[23]。利用物質(zhì)出峰時間可以得到目標(biāo)物質(zhì)的保留指數(shù)，利用標(biāo)準(zhǔn)譜庫(FFNSC1.3、NIST14S、NIST05s)檢索化合物, 查閱檢索出的化合物保留指數(shù)，并與目標(biāo)物質(zhì)的保留指數(shù)比較，最終確定化合物成分。各組分的相對含量用色譜峰面積歸一化法計算。

1.4 傳粉榕小蜂室內(nèi)行為試驗

參照Chen等[16]的方法, 空氣先由活性炭凈化后通過加濕瓶，濕潤的空氣經(jīng)過氣體流量計分別進(jìn)入不同的味源瓶，流量計控制氣體流速100 mL min–1。以某一時期的花序果作為實驗組味源，以其他時期或者空氣作為對照組味源，試驗選在小蜂活力較強的上午8:00-12:00進(jìn)行。每次試驗前一天下午采集將要出蜂的榕果放入紗網(wǎng)袋中帶回實驗室，自然出蜂后用于試驗。作為味源的新鮮榕果在實驗開始前收集，帶回實驗室，立即用于試驗。

共設(shè)置6組行為試驗，分別在3個時期花序和空氣對照以及3個時期花序兩兩之間設(shè)置Y形管進(jìn)行雙向選擇試驗。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010計算各化合物相對含量。采用past 3.0進(jìn)行非度量多維尺度(non-metric multidi- mensional scaling, NMDS)分析，對3個時期氣味樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行以下3個尺度的差異分析：(1) 包含所有出現(xiàn)的化合物；(2) 在某一時期出現(xiàn)次數(shù)≥3次的化合物；(3) 單個樣本中相對含量達(dá)到80%的化合物。NMDS分析基于Bray-Curtis距離，通過降維將樣本的差異以距離的形式展現(xiàn)在二維平面上，距離遠(yuǎn)近對應(yīng)樣本間差異的大小。用應(yīng)力值(stress)來表示NMDS距離與觀察矩陣的擬合程度, 該值越小表明擬合越好。采用Past 3.0進(jìn)行非參數(shù)多元方差分析(PERMANOVA)，用以衡量NMDS分析的差異是否顯著。利用SPSS 16.0進(jìn)行方差分析(ANOVA)和卡方檢驗，方差分析不同花序時期氣味組成成分的數(shù)量差異和同一花序時期不同個體氣味的異質(zhì)性; 卡方檢驗比較傳粉榕小蜂對不同發(fā)育時期隱頭花序選擇的差異。

2 結(jié)果和分析

2.1 花序的揮發(fā)物成分

從對葉榕3個發(fā)育時期花序的氣味中共鑒定出64種化合物(表1，化合物按照保留指數(shù)排列)，其中雌前期、雌花期、間花期花序中的化合物分別有40、45、57種。在氣味成分?jǐn)?shù)量上，間花期多于雌前期(=7.167,=0.087)和雌花期(=9.333,=0.056), 雌前期和雌花期沒有差異(=2.444,=0.819)，這2個時期均出現(xiàn)的化合物達(dá)35種，且化合物的相對含量也有相同的變化趨勢。將化合物按照不同的代謝途徑分類，可分為脂肪酸衍生物、單萜和倍半萜3類, 未檢測到莽草酸途徑的衍生物。倍半萜類化合物在3個時期的花序中均占有最大比例，分別是67.07%、69.48%和91.36%，隨榕果發(fā)育，倍半萜類化合物含量呈現(xiàn)上升趨勢，間花期的倍半萜相對含量高于雌前期(=0.053)和雌花期(=0.078)。相反，脂肪酸衍生物隨花序發(fā)育時期呈現(xiàn)下降趨勢, 且雌前期(=0.045)和雌花期(=0.011)的相對含量明顯高于間花期。

表1 不同發(fā)育期隱頭花序揮發(fā)物的相對含量(%)和檢測到的次數(shù)(O)

續(xù)表(Continued)

2.2 花序的揮發(fā)物成分差異

對3個時期花序的氣味樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行以下3個尺度的差異分析：

(1) 對3個花序時期的全部氣味成分進(jìn)行NMDS分析(stress=0.1772)，結(jié)果表明，雌前期和雌花期的氣味出現(xiàn)重疊，說明這2個時期花序的氣味具有明顯的相似性；而間花期與雌前期、雌花期可以很好的區(qū)分開。PERMANOVA比較結(jié)果表明，雌前期和雌花期的=0.8579，雌前期和間花期的=0.0039< 0.05, 雌花期和間花期的=0.0244<0.05，間花期與雌前期和雌花期在氣味成分上的差異都達(dá)到顯著水平(圖1: A)。

(2) 選擇在任一花序時期中出現(xiàn)次數(shù)≥3次的化合物進(jìn)行NMDS分析(stress=0.1687)，結(jié)果表明, 雌前期與雌花期花序的氣味并無明顯差異，而間花期與雌前期、雌花期均達(dá)到顯著差異(圖1: B)。

(3) 選出樣品中相對含量≥80%的主要化合物進(jìn)行降維分析(stress=0.1856)，結(jié)果與上述兩個尺度的相同，僅間花期與雌花期、雌前期氣味存在顯著差異，而雌前期和雌花期沒有顯著差異(圖1: C)。

2.3 氣味中主要化合物成分的變化

我們對樣品中占總相對含量80%以上的20種化學(xué)成分進(jìn)行分析，這些化合物不僅含量高，而且出現(xiàn)頻率也很高，幾乎在同一時期的所有樣品，或者3個時期的所有樣品中都能被檢測到。己醇在雌前期出現(xiàn)，但在雌花期和間花期消失。月桂烯、順式乙酸-3-己烯酯、乙酸己酯、-蛇麻烯、-依蘭油烯在雌前期和雌花期的相對含量相近，但在間花期的相對含量明顯降低。十一烷、-欖香烯、-芹子烯、-依蘭油烯這4種化合物相對含量在雌花期達(dá)到最高，尤其是-欖香烯，在雌花期個別樣品的相對含量超過50%，在雌前期-欖香烯和-芹子烯的相對含量略低于雌花期。-蓽澄茄油烯、-可巴烯、反式石竹烯、-欖香烯、環(huán)蒜頭烯、反式--香柑油烯和大葉香根烯D在間花期相對含量最高，尤其是前4種化合物的相對含量升高尤為明顯(圖2)。

2.4 同一發(fā)育時期不同個體間氣味成分的差異

對同一花序時期的不同植株樣品進(jìn)行ANOVA檢驗，結(jié)果表明雌前期的=0.153，雌花期的= 0.076，間花期的=0.025，表明對葉榕同一發(fā)育期花序氣味在不同植株間具有異質(zhì)性，尤其是間花期，植株間的差異達(dá)顯著水平。

圖1 對葉榕3個時期花序揮發(fā)物非度量性多維度分析(NMDS)。A: 所有化學(xué)成分; B: 任一時期出現(xiàn)≥3次的化合物; C: 相對含量≥80%的化合物。

圖2 對葉榕20種主要化合物的相對含量。A: 己醇; B: 月桂烯; C: 順式乙酸-3-己烯酯; D:乙酸己酯; E: 檸檬烯; F: 十一烷; G: 未知化合物(c); H: β-蓽澄茄油烯; I: 環(huán)蒜頭烯; J: α-可巴烯; K: β-波旁烯; L: β-欖香烯; M: 反式石竹烯; N: γ-欖香烯; O: 反式-α-香柑油烯; P: α-蛇麻烯; Q: γ-依蘭油烯; R: 大葉香根烯D; S: β-芹子烯; T: α-依蘭油烯。

2.5 傳粉榕小蜂對對葉榕3個時期花序的選擇行為

當(dāng)對葉榕傳粉榕小蜂在雌前期、雌花期、間花期花序與空氣對照之間做選擇時，傳粉榕小蜂傾向于選擇雌前期(χ2=4.829,=35,=0.028<0.05)、雌花期(χ2=10.125,=32,=0.001)花序，而避開間花期(χ2=3.864,=26,=0.05)花序。當(dāng)對雌前期和雌花期花序選擇時，傳粉榕小蜂的選擇趨向相同，并未有明顯傾向性(χ2=0.533,=30,=0.465)。對葉榕傳粉榕小蜂在間花期和雌前期、間花期和雌花期之間選擇時，明顯避開了間花期花序，而傾向于選擇雌前期(χ2=4.000,=36,=0.046<0.05)和雌花期(χ2=4.829,=35,=0.028<0.05)(圖3)。

3 討論

3.1 對葉榕3個時期花序揮發(fā)物的組成特征

對葉榕3個時期花序的揮發(fā)物均由多種化合物組成，這些化合物的相對含量在3個花序時期呈現(xiàn)動態(tài)變化。Song等[24]分析了對葉榕雌株和雄株花序在雌花期和間花期的化合物，由于采用溶劑提取法，提取的成分不僅包括榕果的揮發(fā)性成分，還包括在榕果組織內(nèi)不具揮發(fā)性的代謝產(chǎn)物，所得到的物質(zhì)種類與本研究結(jié)果相差較大。本研究利用動態(tài)頂空吸附法，直接采集對葉榕花序的揮發(fā)物，可以更好地反映對葉榕對傳粉者起作用的化學(xué)信號。在對葉榕雌花期花序氣味中，并未檢測到在此期中占絕對優(yōu)勢，且在傳粉后完全消失的某單一化合物, 這意味著對葉榕可能通過“泛化”策略吸引其傳粉者，即對葉榕專性吸引傳粉者的化學(xué)信號是由多種化學(xué)成分通過不同的比例實現(xiàn)的[13]。在雌花期相對含量較高且穩(wěn)定存在，在產(chǎn)卵或者授粉后含量下降或者消失的化合物，可能是發(fā)揮特異性吸引作用的物質(zhì)，如十一烷、-欖香烯、-芹子烯、-依蘭油烯，可能是對葉榕雌花期花序?qū)Ｐ晕齻鞣壅叩哪繕?biāo)化合物。Magali[20]對西雙版納對葉榕花氣味的研究，雄株雌花期花序揮發(fā)物中相對含量較高的有芳樟醇、反式--石竹烯、吲哚和反式--羅勒烯。這與本研究結(jié)果有較大差異，這可能反映了不同地理分布的榕樹，花序氣味會受到所處環(huán)境的生物和非生物因素影響，而出現(xiàn)相應(yīng)的變化。進(jìn)一步利用氣相色譜-昆蟲觸角電位聯(lián)用儀，測試傳粉榕小蜂觸角對不同組成成分的電生理反應(yīng)，可以真正定位于特異性的化合物，將有助于更好的理解對葉榕雌花期花序?qū)Ｒ恍晕齻鞣壅叩幕瘜W(xué)機制。

在榕果的發(fā)育過程中，一般認(rèn)為只有雌花期花序釋放出特異性的成分，傳粉者只能在雌花期進(jìn)入果內(nèi)產(chǎn)卵或者授粉，而產(chǎn)卵后或者授粉后，氣味揮發(fā)物的釋放量會顯著降低，表現(xiàn)為揮發(fā)物的濃度會下降，一些組成成分會消失[14,20]。對葉榕花序氣味的化合物種類在雌花期最多，而在雌株雌花期花完成授粉后的第2天和雄株雌前期花序產(chǎn)卵后12 d迅速降低，在小蜂產(chǎn)卵后16 d，雄花序檢測到氣味化合物僅32種[20]。Barker[25]對的研究表明，9 mm的榕果對應(yīng)有更多的傳粉小蜂進(jìn)入果內(nèi)，且9 mm的榕果也具有較多種類的揮發(fā)性化合物。而本研究結(jié)果表明，對葉榕間花期花序的揮發(fā)性化合物種類較雌前期和雌花期顯著增加。值得注意的是，對傳粉者起作用的專性化學(xué)信號，可能是由少數(shù)幾種化學(xué)物質(zhì)通過一定的配比決定的[26]，因此,氣味組成成分的數(shù)量多少并不對應(yīng)氣味對傳粉者專性吸引能力的強弱[25]。對葉榕間花期揮發(fā)物的變化，可能是雌花期產(chǎn)生的物質(zhì)在傳粉后通過異構(gòu)化(isomerization)而轉(zhuǎn)化成其他種物質(zhì)，或者暗示揮發(fā)物質(zhì)在生物體內(nèi)衰退的過程，也有可能是非傳粉者寄主定位的化學(xué)信號[27]。

圖3 對葉榕傳粉榕小蜂對不同時期花序的Y形管試驗。*: P<0.05; **: P<0.01; NC: 無明顯選擇傾向。

3.2 對葉榕吸引傳粉榕小蜂特異性機制

從氣味組成成分及其相對含量來看，對葉榕花序從雌前期到雌花期的發(fā)育過程中，氣味并不具有太大差異。多個尺度的NMDS分析結(jié)果一致表明，雌前期花序氣味與雌花期并不具有顯著差異。對于榕果發(fā)育時期(雌前期和雌花期)的劃分，并無絕對的界限，差別在于果內(nèi)的小花是否發(fā)育到可以接受花粉或者被產(chǎn)卵的狀態(tài)以及孔口處的苞片是否松動。因此，對葉榕花序從雌前期到雌花期的發(fā)育是一個連續(xù)的過程，氣味釋放也是一個連續(xù)的過程[19]。在榕果逐漸發(fā)育至雌花期的過程中，揮發(fā)性物質(zhì)持續(xù)釋放，有一定比例構(gòu)成的特異性化合物也持續(xù)釋放。行為試驗的結(jié)果也表明，榕小蜂對雌前期花序和雌花期花序氣味的選擇傾向相同，雌前期花序氣味對傳粉榕小蜂具有明顯的吸引作用。然而，在自然狀態(tài)下，雌前期花序并不會有小蜂進(jìn)入并成功產(chǎn)卵或者授粉。一些學(xué)者的觀點是，雌前期釋放的揮發(fā)物濃度較低，小蜂并不能感受到如此低濃度的化合物[19]。結(jié)合對葉榕的開花物候可知, 對葉榕常年結(jié)果，且同一批次的果量大，揮發(fā)物的濃度可能不是決定小蜂能否進(jìn)入雌前期榕果的主導(dǎo)因素。另一種觀點認(rèn)為小蜂的形態(tài)與榕果孔口的形態(tài)并不匹配[28–29]，傳粉榕小蜂并不能順利通過雌前期孔口處緊密層疊的苞片進(jìn)入花序果。盡管如此，雌前期榕果揮發(fā)物與雌花期相似，可能具有生態(tài)適應(yīng)性。雌前期釋放的氣味增強了氣味的吸引能力，尤其是在僅有部分榕果進(jìn)入雌花期的階段，此時雌花期榕果釋放的氣味濃度低，由于雌前期榕果釋放出與雌花期相似的氣味信號，小蜂仍可以利用化學(xué)信號進(jìn)行遠(yuǎn)距離定位，快速找到寄主榕樹，為少量的雌花期花序授粉或者產(chǎn)卵。

傳粉榕小蜂接收雌花期釋放的特異性氣味信號，進(jìn)入隱頭花序內(nèi)產(chǎn)卵或者授粉，一旦小蜂成功產(chǎn)卵或者授粉，隱頭花序即進(jìn)入下一個發(fā)育時期, 揮發(fā)物的組成以及物質(zhì)的釋放量均發(fā)生改變[30]。傳粉后花氣味的變化可以阻止傳粉者無效的拜訪[23],提高傳粉昆蟲的傳粉效率和對花的認(rèn)知能力[31]。榕小蜂行為試驗結(jié)果表明，間花期花序釋放的揮發(fā)性物質(zhì)對傳粉榕小蜂有趨避作用，在給予傳粉榕小蜂間花期花序和空氣對照的選擇下，榕小蜂明顯傾向于選擇空氣對照，避開間花期氣味。對葉榕雌花期釋放出專性吸引傳粉者的化學(xué)物質(zhì)，而在花序產(chǎn)卵后氣味物質(zhì)發(fā)生改變，對傳粉者起到趨避作用，對葉榕-傳粉榕小蜂之間存在著“推拉”作用模式[32]，這在其他榕樹，如鈍葉榕()[32]、細(xì)葉榕()[19]中均有報道。

對葉榕雌花期花序通過釋放有一定配比的多種化學(xué)成分，吸引傳粉者，即氣味揮發(fā)物的“質(zhì)”和“量”均對傳粉者專性識別寄主起著重要作用。此外，其他兩個時期(尤其是雌前期花序，與雌花期相似性很大)，不管是氣味物質(zhì)的組成上，還是氣味物質(zhì)相對含量上，都有一定的相似性，但在自然狀態(tài)下,雌前期和間花期花序果內(nèi)都沒有出現(xiàn)傳粉榕小蜂,說明對葉榕-傳粉榕小蜂之間專性關(guān)系的維持，應(yīng)該還涉及孔口苞片、榕果大小等形態(tài)特征在近距離定位中的作用[33]。

同一花序時期內(nèi)，不同個體的氣味成分特征具有異質(zhì)性，尤其是間花期的個體間差異顯著。不同個體之間的氣味差異來源反映了植株所處的微環(huán)境對植物氣味的調(diào)節(jié)作用[34]。另一方面，不同時期榕果扮演不同的角色，對葉榕花序氣味特征在間花期樣本之間出現(xiàn)較大變異，由于間花期花序不需要吸引傳粉者，一些特異性成分在間花期可能逐漸消失，反映了傳粉者對間花期的氣味選擇弱于雌花期和雌花期。

本研究利用GC-MS聯(lián)用儀分析了對葉榕3個花序時期氣味的變化，結(jié)果表明，氣味揮發(fā)物由多種成分組成，且十一烷、-欖香烯、-芹子烯、-依蘭油烯這4種化合物可能是組成特異吸引信號的目標(biāo)化合物。昆蟲行為試驗的結(jié)果支持了對葉榕雌花期花序氣味可以極顯著地吸引其傳粉榕小蜂，且雌前期花序?qū)﹂判》湟簿哂泻軓姷奈芰?，相反，間花期的氣味對傳粉榕小蜂具有趨避作用。后期的研究工作，應(yīng)進(jìn)一步增加上述目標(biāo)化合物不同配比下的Y形嗅覺儀試驗、昆蟲觸角電位試驗等, 可以更全面理解維持榕樹-傳粉榕小蜂體系專一性的化學(xué)機制。

[1] BERG C C. Classification and distribution of[J]. Experientia, 1989, 45(7): 605–611. doi:10.1007/BF01975677.

[2] JANZEN D H. How to be a fig [J]. Annu Rev Ecol Syst, 1979, 10: 13–51. doi: 10.1146/annurev.es.10.110179.000305.

[3] COOK J M, RASPLUS J Y. Mutualists with attitude: Coevolving fig wasps and figs [J]. Trends Ecol Evol, 2003, 18(5): 241–248. doi: 10. 1016/S0169-5347(03)00062-4.

[4] WEIBLEN G D. Phylogenetic relationships of functionally dioecious(Moraceae) based on ribosomal DNA sequences and morphology [J]. Amer J Bot, 2000, 87(9): 1342–1357. doi: 10.2307/2656726.

[5] PROFFIT M, JOHNSON S D. Specificity of the signal emitted by figs to attract their pollinating wasps: Comparison of volatile organic compounds emitted by receptive syconia ofand.in southern Africa [J]. S Afr J Bot, 2009, 75(4): 771–777. doi: 10.1016/j.sajb.2009.08.006.

[6] HOSSAERT-MCKEY M, GIBERNAU M, FREY J E. Chemosensory attraction of fig wasps to substances produced by receptive figs [J]. Entomol Exp Appl, 1994, 70(2): 185–191. doi: 10.1111/j.1570-7458. 1994.tb00746.x.

[7] HOSSAERT-MCKEY M, SOLER C, SCHATZ B, et al. Floral scents: Their roles in nursery pollination mutualisms [J]. Chemoecology, 2010, 20(2): 75–88. doi: 10.1007/s00049-010-0043-5.

[8] DUDAREVA N, NEGRE F. Practical applications of research into the regulation of plant volatile emission [J]. Curr Opin Plant Biol, 2005, 8(1): 113–118. doi:10.1016/j.pbi.2004.11.007.

[9] KNUDSEN J T, ERIKSSON R, GERSHENZON J, et al. Diversity and distribution of floral scent [J]. Bot Rev, 2006, 72(1): 1–120. doi:10. 1663/0006-8101(2006)72[1:DADOFS]2.0.CO;2.

[10] F?GRI K, van DER P L. The Principles of Pollination Ecology [M]. 3rd ed. Oxford, New York: Pergamon Press, 1979: 1.

[11] PICHERSKY E, GERSHENZON J. The formation and function of plant volatiles: Perfumes for pollinator attraction and defense [J]. Curr Opin Plant Biol, 2002, 5(3): 237–243. doi:10.1016/S1369-5266(02)00251-0.

[12] WEIBLEN G D. How to be a fig waps [J]. Annu Rev Entomol, 2002, 47: 299–330.

[13] SAKAI S.spp. (Aristolochiaceae) pollinated by flies breeding on decomposing flowers in Panama [J]. Amer J Bot, 2002, 89 (3): 527–534. doi: 10.3732/ajb.89.3.527.

[14] GRISON-PIGé L, BESSIèRE J M, HOSSAERT-MCKEY M. Specific attraction of fig-pollinating wasps: Role of volatile compounds released by tropical figs [J]. J Chem Ecol, 2002, 28(2): 283–295. doi:10.1023/ A:1017930023741.

[15] CHEN C, SONG Q S, PROFFIT M, et al. Private channel: A single unusual compound assures specific pollinator attraction in[J]. Funct Ecol, 2009, 23(5): 941–950. doi: 10.1111/j.1365- 2435.2009.01622.x.

[16] GALIL J, EISIKOWITCH D. On the pollination ecology ofin East Africa [J]. Ecology, 1968, 49(2): 259–269. doi: 10. 2307/1934454.

[17] CORNER E J H. Check-list ofin Asia and Australasia with keys to identification [J]. Gard Bull Singap, 1965, 21: 1–186.

[18] Soler C, Hossaert-McKey M, Buatois B, et al. Geographic variation of floral scent in a highly specialized pollination mutualism [J]. Phytochemistry, 2011, 72: 74–81.

[19] ZHANG T, WANG B, MIAO B G, et al. Chemical composition of volatiles from the syconia ofand host recognition behavior of pollinating fig wasps [J]. Chin J Plant Ecol, 2017,41(5): 549–558. doi: 10.17521/cjpe.2016.0250.張亭, 王波, 苗白鴿, 等. 榕樹隱頭花序揮發(fā)物組成及其傳粉榕小蜂寄主識別行為[J]. 植物生態(tài)學(xué)報, 2017, 41(5): 549–558. doi: 10. 17521/cjpe.2016.0250.

[20] PROFFIT M, SCHATZ B, BESSIERE J M, et al. Signalling receptivity: Comparison of the emission of volatile compounds by figs ofbefore, during and after the phase of receptivity to pollinators [J]. Symbiosis, 2008, 45(1/2/3): 15–24.

[21] MAYR G L. Neue feigen-insekten [J]. Wien Entomol Ztg, 1906, 25: 153–187.

[22] YAN X, PENG Y Q, YANG D R. Spatial distribution patterns of three fig wasps on: How non-pollinators affect pollinator’s sex ratio [J]. Acta Ecol Sin, 2012, 32(2): 99–103. doi: 10.1016/j. chnaes.2012.02.003.

[23] BIANCHI F, CARERI M, MANGIA A, et al. Retention indices in the analysis of food aroma volatile compounds in temperature-programmed gas chromatography: Database creation and evaluation of precision and robustness [J]. J Sep Sci, 2007, 30(4): 563–572. doi: 10.1002/jssc.20 0600393.

[24] SONG Q S, YANG D R, ZHANG G M, et al. Volatiles fromand their attractiveness to fig wasps [J]. J Chem Ecol, 2001, 27(10): 1929–1942. doi: 10.1023/A:1012226400586.

[25] BARKER N P. Evidence of a volatile attractant in(Moraceae) [J]. Bothalia, 1985, 15(3/4): 607–611. doi: 10.4102/abc.v15i3/4.1854.

[26] SOLER C, HOSSAERT-MCKEY M, BUATOIS B, et al. Geographic variation of floral scent in a highly specialized pollination mutualism [J]. Phytochemistry,2011, 72(1): 74–81. doi: 10.1016/j.phytochem. 2010.10.012.

[27] PROFFIT M, SCHATZ B, BORGES R M, et al. Chemical mediation and niche partitioning in non-pollinating fig-wasp communities [J]. J Anim Ecol, 2007, 76(2): 296–303. doi:10.1111/j.1365-2656.2007.01213.x.

[28] WILLIAM R B. Coevolution ofand Agaonidae [J]. Ann Miss Bot Gard, 1974, 61(3): 770–780. doi: 10.2307/2395028.

[29] LIU C, YANG D R, COMPTON S G, et al. Larger fig wasps are more careful about which figs to enter-with good reason [J]. PLoS One, 2013, 8(9): e74117. doi:10.1371/journal.pone.0074117.

[30] SCHIESTL F P, AYASSE M. Post-pollination emission of a repellent compound in a sexually deceptive orchid: A new mechanism for maxi- mising reproductive success? [J]. Oecologia, 2001, 126(4): 531–534. doi: 10.1007/s004420000552.

[31] TOLLSTEN L. A multivariate approach to post-pollination changes in the floral scent of(Orchidaceae) [J]. Nord J Bot, 1993, 13(5): 495–499.

[32] GU D, COMPTON S G, PENG Y Q, et al. ‘Push’ and ‘pull’ responses by fig wasps to volatiles released by their host figs [J]. Chemoecology, 2012, 22(4): 217–227. doi: 10.1007/s00049-012-0108-8.

[33] WANG G, COMPTON S G, CHEN J. The mechanism of pollinator specificity between two sympatric fig varieties: A combination of olfactory signals and contact cues [J]. Ann Bot, 2013, 111(2): 173–181. doi: 10.1093/aob/mcs250.

[34] MAJETIC C J, RAGUSO R A, ASHMAN T L. Sources of floral scent variation [J]. Plant Sign Behav, 2009, 4(2): 129–131. doi:10.4161/psb. 4.2.7628.

Odour Composition Variation at Different Stages ofInflorescence and the Attraction to Pollinators

CHENG Yu-fen1,2,3, ZHANG Zhi-wei4, JIA Yong-xia3, CHEN Lian-fu1,3, YU Hui1,3*

(1. Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Sustainable Utilization, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510650, China; 4. School of Life Sciences, Qufu Normal University, Qufu 273165, Shandong, China)

In order to understand the changes in volatile organic compounds (VOCs) of figs and its regulation to pollinators, the compositions of VOCs at three floral phases were determined in, and the behavioral responses of pollinatorsto different developmental syconia were observed by using Y-tube olfactometer. The results showed that there were 64 compounds were detected in syconia at three phases. Among them, four compounds, such as undecane,-elemene,-selinene, and-muurolene, might be the active substances attractive to pollinators. So the specific chemical signal ofto attract its pollinator was achieved by “generalization” strategy. The NMDS results showed that the VOCs of syconia at prefemale phase were similar to those at female phase, but those at interfloral phase were significantly different from those at the other two phases. There was a clear tendency for pollinators to select the syconia at prefemale and female phases, but avoid the ones at interfloral phase, indicating that there was a “push-pull” interaction mode between the figs and their pollinators. The VOCs released by syconia at pre-female phase could strengthen pollinator attraction. In addition, the VOCs vary among individuals at the same developmental phase showed VOCs emission was affected by the environment, especially at interfloral phase. These would help for understand the composition characteristics of VOCs inand the chemical signal function in maintaining fig-fig wasp mutualisms.

; Inflorescence; Volatile organic compound; Chemical signal

10.11926/jtsb.4016

2018–11–12

2019–01–07

國家自然科學(xué)基金面上項目(31670395); 廣州市科技計劃項目(201707010351)；中國科學(xué)院植物資源保護(hù)與可持續(xù)利用重點實驗室開放基金項目資助

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31670395), and the Project for Science and Technology Planning in Guangzhou (Grant No. 201707010351), and the Open Fund of Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Sustainable Utilization of China Academy of Science.

程玉芬(1991~ ), 女, 在讀碩士生, 研究方向為進(jìn)化生物學(xué)。E-mail: Chengyufen@scbg.ac.cn.

通信作者 Corresponding author.E-mail:yuhui@scib.ac.cn