魏永成, 張勇, 仲崇祿, 孟景祥, 陳珍

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不同抗性短枝木麻黃種源苗木接種青枯病菌后酚類物質(zhì)含量的變化

魏永成, 張勇, 仲崇祿*, 孟景祥, 陳珍

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所，廣州 510520)

為了解短枝木麻黃()抗青枯病的機(jī)理，對(duì)接種青枯病菌()后短枝木麻黃的單寧和黃酮含量變化進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，不同抗性短枝木麻黃種源小枝的總酚和單寧含量呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)，高抗、中抗種源均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，峰值均約為126 mg g–1，但中抗種源的峰值出現(xiàn)時(shí)間較晚，而易感種源則呈逐漸升高趨勢(shì)?？?、感種源木麻黃接種青枯菌后，小枝中縮合單寧含量均呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，但高抗種源的縮合單寧含量均顯著高于易感種源，增加70.33%。抗性種源黃酮含量呈S型上升趨勢(shì)，易感種源則持續(xù)緩慢升高。這表明接種青枯病菌后，抗、感短枝木麻黃種源表現(xiàn)出不同的防御特征，次生物質(zhì)含量增幅越大，抑菌抗氧化能力越強(qiáng)，短枝木麻黃表現(xiàn)出的抗性越強(qiáng)。

短枝木麻黃；青枯病菌；接種；單寧；黃酮

木麻黃抗風(fēng)、耐瘠薄，是我國(guó)華南地區(qū)營(yíng)建沿海防護(hù)林的先鋒樹種，在一些立地條件較差的前緣沙質(zhì)地帶，木麻黃甚至是唯一可造林的樹種[1]，具有顯著的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2–3]。青枯病()是一種危害嚴(yán)重、傳播廣泛的毀滅性土傳病害, 該病傳播速度快、發(fā)病死亡率高，可危害54科200余種植物，包括許多具有重要經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值的植物, 如煙草()、番茄()、馬鈴薯()、香蕉()和桉樹(sp.)等[4]，是世界范圍內(nèi)最難防治的細(xì)菌性重大病害之一[5]。青枯病是木麻黃的重要病害之一，嚴(yán)重影響我國(guó)華南沿海防護(hù)林的生態(tài)安全。青枯病菌作為一種土傳細(xì)菌，具有傳播速度快、變異大等特點(diǎn)，人們?cè)诨瘜W(xué)防治和生物防治方面做了大量工作，但依然無(wú)法改變青枯病不斷蔓延的趨勢(shì)，如何有效防治青枯病已成為影響木麻黃發(fā)展的重要因素。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的自身抗性是控制青枯病擴(kuò)散的重要策略[6]。在影響植物抗病性的因素中，次生代謝物質(zhì)是植物產(chǎn)生抗病性的重要生理生化基礎(chǔ)，能夠有效抑制病原菌在寄主體內(nèi)的擴(kuò)散與增殖，甚至直接殺滅病原菌[7]。

酚類物質(zhì)是植物重要的次生代謝物質(zhì)，參與許多生理生化過(guò)程，許多研究表明酚類物質(zhì)在植物抵御病原物侵襲過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[8]。受病原物侵襲后，可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生大量可溶性酚類物質(zhì)，抑制病原物的遷移和擴(kuò)增[9]。細(xì)胞壁上的大量酚類物質(zhì)也與植物的抗病性密切相關(guān)[10]。黃酮類化合物也可以抑制多酚氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶等的活性，進(jìn)而影響植物的抗病性[11–13]。綜上，植物酚類物質(zhì)和黃酮類化合物與植物抗性有密切關(guān)系，研究植物受到病原菌侵襲后酚類物質(zhì)、黃酮類化合物的含量變化規(guī)律，可以在一定程度上反映植株的抗病特征。

本研究以選育的抗青枯病短枝木麻黃()高抗(R)、中抗(M)和易感(S)為材料，探討感染青枯病后小枝中酚類物質(zhì)和黃酮含量的變化規(guī)律，揭示短枝木麻黃對(duì)青枯病的抗性生理機(jī)理, 明確短枝木麻黃抗病與感病種源間的差異特征，為短枝木麻黃抗青枯病品種選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

于2017年5月在廣東省徐聞縣的種源試驗(yàn)林(2014年造林)中收集短枝木麻黃()材料，包括3個(gè)抗性種源(R、M和S)，每種源選擇50株，每株取10支幼嫩小枝，水培生根后移至營(yíng)養(yǎng)杯培養(yǎng)。供試菌株為中國(guó)林科院熱帶林業(yè)研究所前期獲得的高致病力青枯病菌() GL-3菌株[14]。

1.2 接種和取樣

參考劉勇等[15]的方法，將GL-3菌株在TTC (2,2,3-三苯基四唑氯)培養(yǎng)基上活化48 h，選擇單菌落接種到普通營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，然后接種到液體培養(yǎng)基中30℃搖床24 h。培養(yǎng)液靜置30 min收集菌體，用蒸餾水將菌液稀釋成3×109cfu mL–1用于接種。

2018年3月，大部分幼苗高度在40 cm以上，對(duì)幼苗進(jìn)行接種處理。接種時(shí)將所有幼苗從土中取出,小心去掉土壤盡量避免幼苗根部損傷，用水洗凈根部。剪掉約1/3根系，一半植株浸入30℃細(xì)菌懸浮液中(I, inoculation) 30 min，另外一半植株浸入蒸餾水作為對(duì)照(W)。將接種后的植株移栽至裝有營(yíng)養(yǎng)土(黃土∶泥炭土∶沙子=1∶1∶1)的塑料盆(長(zhǎng)×寬×高= 40 cm×25 cm×8 cm)中，每盆20株。共6種組合(R-I、R-W、M-I、M-W、S-I、S-W)，采用隨機(jī)完全區(qū)組設(shè)計(jì)，每組合處理苗木4盆80株，重復(fù)3次，共12盆240株。接種后每天澆水，相對(duì)濕度控制在80%左右。

接種當(dāng)天取中上部的功能小枝，以后每天固定時(shí)間取樣1次，直至有植株完全枯萎死亡，共取樣8次。每次取樣時(shí)每組合隨機(jī)選5株，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 指標(biāo)測(cè)定

按王翠穎等[16–17]的方法提取和測(cè)定單寧和黃酮含量，總酚含量利用Folin-Ciocalteu試劑比色法測(cè)定[18]，縮合單寧用丁醇/鹽酸(95∶5)法測(cè)定[19]。3次重復(fù)，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 19.0和EXCEL 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用Duncan多重比較法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 總酚含量

接種青枯菌后，不同抗性短枝木麻黃種源苗木小枝中的總酚含量呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)(表1)。高抗、中抗種源均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，但中抗種源的峰值出現(xiàn)時(shí)間較晚；易感種源則呈逐漸升高趨勢(shì)，在感病末期雖略有下降，但整體水平較高。高抗短枝木麻黃接種青枯菌后，總酚含量迅速升高，在接種后2 d達(dá)最大值126.89 mg g–1，比對(duì)照高47.20%。隨后迅速降低，接種后7 d與對(duì)照的差異不顯著。中抗種源接種后，總酚含量也會(huì)迅速升高, 但直到接種后4 d才達(dá)最大值126.16 mg g–1, 比對(duì)照高39.22%，隨后迅速降低，接種后5~7 d與對(duì)照差異不顯著。易感種源受到青枯菌侵襲后，總酚含量持續(xù)上升，最大值(109.57 mg g–1)出現(xiàn)在第5天，接種后6 d時(shí)略微下降，在接種后7 d比對(duì)照高32.53%。

接種青枯菌后1 d，高抗、中抗、易感短枝木麻黃間的總酚含量差異不顯著。接種2 d后，總酚含量依次為高抗>中抗>易感，高抗與易感種源間的差異顯著。接種3~4 d后，中抗種源的總酚含量高于其余種源。接種后5~7 d，3種源間的差異不顯著，且易感種源的總酚含量維持在較高濃度。

2.2 單寧含量

不同抗性種源短枝木麻黃接種青枯菌后，小枝中單寧含量的變化趨勢(shì)與總酚含量的一致(表2)。高抗、中抗種源單寧含量呈現(xiàn)明顯的先升后降的變化趨勢(shì)，易感種源則持續(xù)升高，在接種后6~7 d略微下降。高抗種源接種青枯菌2 d后的單寧含量達(dá)最大(125.92 mg g–1)，比對(duì)照高47.05%。中抗種源在接種后4 d達(dá)最大(125.41 mg g–1)，比對(duì)照高39.58%。易感種源接種青枯菌5 d后達(dá)最大值，單寧含量比對(duì)照高19.56%。

表1 短枝木麻黃接種青枯菌后總酚含量(mg g–1)

R: 高抗種源; M: 中抗種源; S: 易感種源; I: 接種處理; W: 對(duì)照; 數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(<0.05)。下同。

R: High resistant provenance; M: Media resistant provenance; S: Susceptible provenance; I: Inoculation; W: Control; Data followed different letters indicate significant difference at 0.05 level. The same is following Tables.

接種青枯菌后1 d，高抗、中抗和易感短枝木麻黃間的單寧含量差異不顯著。接種2 d后的單寧含量依次為高抗>中抗>易感，且差異顯著。接種4 d后，中抗種源的單寧含量顯著高于高抗和易感。接種5~7 d后，3種源間的差異不顯著，易感種源的單寧含量維持在較高水平。這表明高抗短枝木麻黃受到青枯菌侵襲后，能迅速大量合成單寧并有效發(fā)揮抗菌作用，而易感種源的單寧合成反應(yīng)緩慢且效用不明顯。

2.3 縮合單寧含量

不同抗性種源短枝木麻黃接種青枯菌后，小枝的縮合單寧含量均呈逐漸升高的變化趨勢(shì)(表3)。接種青枯菌后7 d，高抗種源的縮合單寧含量達(dá)最大值13.03 mg g–1，比對(duì)照高70.33%，中抗和易感種源分別為10.36和10.2 mg g–1，分別比對(duì)照高19.35%和42.06%。高抗種源顯著高于易感種源，這表明高抗、易感短枝木麻黃受到青枯菌侵襲后，均會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生縮合單寧，但高抗種源的縮合單寧含量更高, 導(dǎo)致抵御青枯菌侵襲的效果不同。

2.4 黃酮含量的變化

不同抗性種源短枝木麻黃接種青枯菌后，小枝的黃酮含量呈逐漸升高的變化趨勢(shì)(表4)。其中，高抗、中抗種源的黃酮含量呈S型上升趨勢(shì)，易感種源則持續(xù)緩慢升高。高抗種源接種青枯菌后5 d的黃酮含量達(dá)最大值56.66 mg g–1，比對(duì)照高35.68%，中抗種源在接種后7 d達(dá)最大值54.08 mg g–1，比對(duì)照高27.49%，而易感種源接種青枯菌7 d后，黃酮含量比對(duì)照高14.54%。

表2 短枝木麻黃接種青枯菌后單寧含量(mg g–1)

表3 短枝木麻黃接種青枯菌后縮合單寧含量(mg g–1)

表4 短枝木麻黃接種青枯菌后黃酮含量(mg g–1)

接種青枯菌后1~2 d，高抗、中抗、易感種源間的黃酮含量差異不顯著。接種后3~7 d，高抗種源的黃酮含量為51~57 mg g–1，均顯著高于易感種源。這表明高抗短枝木麻黃受到青枯菌侵襲后，大量合成黃酮，起到抑制青枯菌的作用。

3 討論

木麻黃受到青枯病菌侵襲后，體內(nèi)生理生化物質(zhì)會(huì)發(fā)生系統(tǒng)性變化。已有研究主要集中在少數(shù)或者單一無(wú)性系，極大地限制了木麻黃抗病育種工作的進(jìn)展。同時(shí)由于病原菌不斷發(fā)生變異，抗病品種選育和應(yīng)用相對(duì)滯后，使得許多木麻黃林大面積染病死亡，急需新的抗病種質(zhì)材料充實(shí)到沿海防護(hù)林帶。本研究從種源層次解析短枝木麻黃抗性機(jī)制, 擴(kuò)大了遺傳資源篩選范圍，對(duì)短枝木麻黃抗病選育提供了良好的理論基礎(chǔ)。

林木抗病性是在長(zhǎng)期演化過(guò)程中所形成的生物特性，根據(jù)抗性產(chǎn)生機(jī)制可以分為組成型抗性和誘導(dǎo)型抗性[20]。組成型抗性是植物不論受侵襲與否均產(chǎn)生與抗性有關(guān)的物質(zhì)，誘導(dǎo)型抗性是植物所產(chǎn)生的一種更為主動(dòng)的抗性反應(yīng)方式，即在受到如病原菌等物的侵襲后，植物誘導(dǎo)產(chǎn)生一些物質(zhì)來(lái)發(fā)揮防御作用[21]。本研究中，受到青枯菌侵襲后，高抗和易感短枝木麻黃的單寧和黃酮含量均會(huì)升高，高抗種源的單寧含量呈先升后降的變化趨勢(shì)，黃酮含量呈S型增長(zhǎng)趨勢(shì)，而易感種源的單寧和黃酮含量均呈逐漸升高的變化趨勢(shì)，但高抗種源中單寧和黃酮含量增幅高于易感種源，這表明短枝木麻黃受青枯菌侵襲后表現(xiàn)出誘導(dǎo)型抗性。因此，誘導(dǎo)產(chǎn)生的單寧和黃酮含量可以作為評(píng)價(jià)短枝木麻黃抗青枯病的生理指標(biāo)。同時(shí)，不同種源單寧和黃酮含量峰值出現(xiàn)時(shí)間并不一致，為快速有效地鑒定短枝木麻黃抗病與否，需要進(jìn)一步明確各抗性種質(zhì)材料合成單寧和黃酮的閾值。

單寧和黃酮類化合物是多酚中的代表性成分,是短枝木麻黃受到病原菌侵襲后產(chǎn)生的兩類重要次生代謝物質(zhì)，來(lái)源于莽草酸途徑和苯丙氨酸代謝途徑，具有抑菌、抗氧化等多種功能，是植物體內(nèi)主要的防御措施[22]。王翠穎等[16]報(bào)道抗病木麻黃無(wú)性系在接種青枯病菌前后的單寧含量均高于感病無(wú)性系。林秀琴等[23]在篩選木麻黃抗星天牛品系時(shí)，認(rèn)為抗蟲等級(jí)越高，植物體內(nèi)的單寧和黃酮等次生代謝物含量越高。這與本研究結(jié)果基本一致, 但本研究中不同種源間短枝木麻黃的單寧和黃酮含量在接種當(dāng)天或未接種時(shí)的差異不顯著，這可能是由于不同種源短枝木麻黃遺傳特性造成的。而受侵襲后抗感種源的單寧含量變化趨勢(shì)不同則是因?yàn)槟承┗虿町惐磉_(dá)的結(jié)果。

由于短枝木麻黃受到青枯病菌侵襲后會(huì)出現(xiàn)較長(zhǎng)時(shí)間的潛伏期，因此本研究中采用高劑量菌液接種，以檢測(cè)短枝木麻黃感病后的生理生化變化。但在野外，由于降雨充沛、人工干擾等因素影響, 短枝木麻黃并不會(huì)表現(xiàn)出枯萎死亡的病癥，甚至出現(xiàn)部分枯萎植株逐漸恢復(fù)的情況。短枝木麻黃中的單寧和黃酮有組成型和誘導(dǎo)型兩類，其中誘導(dǎo)型的單寧和黃酮主要是受到病原菌侵襲后產(chǎn)生的，二者的變化規(guī)律能夠在一定程度上反映植物的抗性機(jī)理, 進(jìn)一步研究其他防御物質(zhì)的變化規(guī)律將有利于全面揭示抗性短枝木麻黃對(duì)青枯病的抗性機(jī)制。

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Changes in Phenols Contents inProvenances with Different Resistibility Infected by

WEI Yong-cheng, ZHANG Yong, ZHONG Chong-lu*, MENG Jing-xiang, CHEN Zhen

(Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520, China)

In order to understand the resistance mechanism of casuarinas () against, the changes in contents of tannin and phenols in casuarinas infected bywere analyzed. The results showed that the change trends of tannin and phenols contents in provenances with different resistibility were different. The contents of tannin and phenols in high- and media-resistant provenances increased at first and then decreased with the peak of 126 mg g–1, and the peak of media-resistant provenances came later. The susceptible provenances showed rising trend. After infected with, the condensed tannin content increased gradually in three provenances, and that in the high-resistant provenances were 70.33% higher than that in susceptible provenances. The content of flavone in resistant provenances showed S type rising trend, while that in susceptible provenances increased slowly. Therefore, it was demonstrated that there were different defense mechanisms between resistant and susceptible provenances. The greater the content of secondary compounds increase, the stronger bacteriostasis and antioxidant activities,would show higher resistance to bacterial wilt.

;; Inoculate; Tannin; Flavone

10.11926/jtsb.3983

2018-08-14

2018-09-21

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(CAFYBB2017QA007)；廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2014KJCX017)資助

This work was supported by the Special Project for Basic Scientific Research of Central Public Welfare Institution (Grant No. CAFYBB2017QA007), and the Project for Forestry Science and Technology Innovation of Guangdong Province of China (Grant No. 2014KJCX017).

魏永成(1988~ )，男，博士，助理研究員，主要從事林木遺傳改良研究。E-mail: yongcheng369@163.com

通信作者 Corresponding author.E-mail: zclritf@126.com