蔣佳志 晏鑫 李潔莉 周強(qiáng) 劉同族 李世安 李勝

膀胱癌(bladder cancer,BCa)作為泌尿生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一[1-2]，近年來其發(fā)病率也逐漸增高[3]。對(duì)于BCa，TNM分期是判斷侵襲程度和患者臨床預(yù)后的重要標(biāo)志[4]。因此，尋找與BCa患者TNM分期相關(guān)的基因作為判斷其侵襲及預(yù)后的標(biāo)志物具有重大意義。有研究表明，CDC25B基因與BCa患者的TNM分期密切相關(guān)[5]。且其編碼基因是一種新的癌基因，已有研究證明了CDC25B在人類多種腫瘤中均有過度表達(dá)，這其中包括食管癌[6]、腎細(xì)胞癌[7]、胃癌[8]、結(jié)腸癌[9]、卵巢癌[10]、非小細(xì)胞肺癌[11]等，然而其在BCa中的研究相對(duì)較少。

美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)基因表達(dá)匯編計(jì)劃致力于開發(fā)新的信息技術(shù)，以幫助理解調(diào)控健康和疾病的基本分子和遺傳過程，目前是一個(gè)支持公共使用的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫[12-13]。本研究首先收集基因表達(dá)匯編(gene expression omnibus,GEO)公共數(shù)據(jù)集GSE13507并對(duì)其進(jìn)行分析，探究CDC25B表達(dá)對(duì)BCa患者臨床特征及術(shù)后生存期的影響，并利用基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)預(yù)測(cè)CDC25B推動(dòng)BCa發(fā)展的機(jī)制，為深入研究其作用機(jī)制在BCa發(fā)生、發(fā)展中的臨床意義提供了一種途徑。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中下載BCa基因的表達(dá)譜公共數(shù)據(jù)集，其中對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)集為GSE13507(BCa腫瘤組織樣本n=165)。

二、方法

1.篩選數(shù)據(jù)集及分析臨床相關(guān)性：GSE13507基因樣本量大并且包含臨床信息，可進(jìn)行回顧性分析研究。排除臨床資料缺失的樣本，對(duì)BCa組織中CDC25B的表達(dá)水平進(jìn)行排序，表達(dá)高于中位數(shù)的表達(dá)水平為高表達(dá)組(n=83)，低于中位數(shù)的為低表達(dá)組(n=82)。然后比較兩組患者的臨床病理特征的差異。其中CDC25B在GSE13507中的探針編號(hào)為ILMN_1651942。

2.GSEA分析：利用GSEA 3.0版本進(jìn)行分析。在BCa樣本數(shù)據(jù)集GSE13507(腫瘤組織樣本n=165)中，基于CDC25B的表達(dá)水平將BCa組織樣本分為高、低表達(dá)兩組，再通過GSEA分析CDC25B表達(dá)水平對(duì)機(jī)體生物通路基因集的影響。使用從GSEA網(wǎng)站MSigDB中獲得的hallmark標(biāo)志基因集作為參照基因集，每次隨機(jī)重復(fù)1 000次進(jìn)行分析。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：回顧性研究中，組間比較采用聯(lián)列表法，使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，分析BCa患者中CDC25B高表達(dá)組及CDC25B低表達(dá)組的臨床病理特征的差異性；在預(yù)后分析中，使用GraphPad Prism 6軟件的Log-rank(Mantel-Cox)法進(jìn)行生存分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在GSEA中，將錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.25、P<0.05的基因集作為顯著富集基因集。

結(jié) 果

一、CDC25B表達(dá)水平與BCa病理特征的關(guān)系

本研究首先利用GSE13507中BCa患者的臨床資料與CDC25B對(duì)應(yīng)的表達(dá)量進(jìn)行了回顧性分析。結(jié)果如表1所示，CDC25B表達(dá)水平與BCa患者的疾病進(jìn)展(P<0.000 1)、分級(jí)(P<0.000 1)、T分期(P<0.000 1)相關(guān)，相較于CDC25B低表達(dá)組，CDC25B高表達(dá)患者的分級(jí)高，T分期更趨向于晚期，疾病進(jìn)展更快。

表1 CDC25B表達(dá)水平和BCa患者臨床病理特征的相關(guān)性

注：*CDC25B高表達(dá)組有1例缺失數(shù)據(jù)

二、CDC25B表達(dá)水平與BCa預(yù)后的關(guān)系

如圖1所示，在BCa樣本數(shù)據(jù)集GSE13507中，CDC25B高表達(dá)組和低表達(dá)組的平均腫瘤特異性生存期分別為(72.44±1.42)和(95.29±0.12)個(gè)月(Log-rank=24.46，P<0.000 1，HR=0.170 5，95%CI為0.084 6～0.343 7)。高表達(dá)組與低表達(dá)組的總生存期分別為(61.19±2.21)和(76.31±1.69)個(gè)月(Log-rank=19.32，P<0.000 1，HR=0.333 3，95%CI為0.204 2～0.544 0)；中位生存期分別為31.53 和135.00個(gè)月。以上結(jié)果證明，CDC25B基因高表達(dá)組BCa患者的總生存期和腫瘤特異性生存期明顯低于CDC25B基因低表達(dá)組的BCa患者，CDC25B高表達(dá)組BCa患者的預(yù)后更差，因此我們可初步將CDC25B作為BCa預(yù)后的評(píng)價(jià)分子。

A：腫瘤特異性生存曲線；B：總生存曲線圖1 CDC25B 表達(dá)水平與BCa患者預(yù)后的關(guān)系

三、CDC25B高表達(dá)的GSEA分析

為探究CDC25B推動(dòng)BCa發(fā)生的可能機(jī)制，使用GSEA方法分析在BCa組織中可能受CDC25B調(diào)控的基因集。使用“hallmark基因集”作為參照基因集，結(jié)果顯示CDC25B高表達(dá)的樣本富集了與精子形成、有絲分裂紡錘體形成、紫外線響應(yīng)、E2F信號(hào)通路、G2M檢查點(diǎn)、KRAS信號(hào)通路、肌形成相關(guān)的基因集，見表2。結(jié)果提示CDC25B可能通過影響癌細(xì)胞周期(有絲分裂紡錘體形成、G2M檢查點(diǎn))、細(xì)胞增殖(E2F信號(hào)通路)和其他過程從而影響B(tài)Ca的發(fā)生與發(fā)展。

表2 CDC25B高表達(dá)BCa樣本富集的基因集

討 論

1986年Russell等[14]證實(shí)CDC25是裂殖酵母有絲分裂的啟動(dòng)因子，它在真核生物細(xì)胞中起激活作用而誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂M期[15]。其中CDC25B是CDC25激酶家族中最重要的成員，是關(guān)鍵的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，在各個(gè)階段的細(xì)胞周期中都有表達(dá)，并在各個(gè)階段的轉(zhuǎn)換過程中起關(guān)鍵作用[16-18]。CDC25B的編碼基因位于20p13，是一種新的癌基因[19]。CDC25B已被證明在多種腫瘤中高表達(dá)，其中包括食管癌[6]、腎細(xì)胞癌[7]、胃癌[8]、結(jié)腸癌[9]、卵巢癌[10]、非小細(xì)胞肺癌[11]等多種腫瘤。CDC25B的過表達(dá)可導(dǎo)致處于G2期及S期的細(xì)胞迅速進(jìn)入有絲分裂，從而加快腫瘤的生長，促進(jìn)其惡性轉(zhuǎn)化[20]。除了與腫瘤的發(fā)生有關(guān)外，CDC25B的表達(dá)水平還與一系列腫瘤患者的臨床病理特征及預(yù)后有密切相關(guān)性。Takemasa等[9]發(fā)現(xiàn)，CDC25B可作為結(jié)直腸癌患者的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物。此外，卵巢癌的TNM分期、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與CDC25B的表達(dá)水平有關(guān)[21]。還有研究支持，腎細(xì)胞癌中CDC25B的敲低與腫瘤惡性特征的降低有關(guān)[7,22]。這些結(jié)論證明CDC25B與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。

對(duì)于BCa，TNM分期是判斷侵襲程度和患者臨床預(yù)后的重要標(biāo)志[4]。Li等[5]發(fā)現(xiàn)CDC25B基因與BCa患者的TNM分期密切相關(guān)。Zhang等[23]發(fā)現(xiàn)CDC25B表達(dá)的上調(diào)可能促進(jìn)BCa的發(fā)展，預(yù)示著預(yù)后不良。本研究利用GEO數(shù)據(jù)集，結(jié)合生物信息學(xué)，我們發(fā)現(xiàn)CDC25B高表達(dá)的BCa患者疾病進(jìn)展更快、病理分級(jí)高，提示CDC25B的表達(dá)與BCa的侵襲轉(zhuǎn)移程度相關(guān)；另外高表達(dá)組的T分期更傾向于晚期，表明CDC25B也與BCa的預(yù)后相關(guān)。此外，生存分析結(jié)果顯示CDC25B高表達(dá)的BCa患者復(fù)發(fā)更快、生存時(shí)間更短。因此，可初步猜測(cè)CDC25B可作為判斷BCa的侵襲程度和預(yù)后的指標(biāo)。探究其影響機(jī)制，GSEA分析提示CDC25B高表達(dá)腫瘤細(xì)胞有更高的增殖潛力，還可能促進(jìn)E2F和G2M等癌相關(guān)信號(hào)通路的激活，影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。以上結(jié)果表明CDC25B基因可能是BCa預(yù)后的標(biāo)志物和潛在治療靶標(biāo)。

本研究利用NCBI的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，探討了CDC25B高、低表達(dá)與BCa病理變化和預(yù)后的關(guān)系，但BCa患者的臨床病理變化和預(yù)后往往都是多基因表達(dá)調(diào)控的結(jié)果，故只關(guān)注CDC25B基因的表達(dá)難免會(huì)有一定的局限性。因此接下來的研究可尋找多個(gè)與CDC25B類似的基因進(jìn)行多基因分析，探討多基因的表達(dá)對(duì)BCa發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的影響。

總之，CDC25B與BCa的侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)。此外，我們的研究表明，CDC25B可能影響到了BCa的增殖、E2F信號(hào)通路、G2M信號(hào)通路等，然而，CDC25B是如何調(diào)控這些信號(hào)通路的，其在調(diào)控過程中起到了怎樣的作用，這還需要大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來證明，以明確CDC25B能否作為新型的潛在治療靶點(diǎn)。