朱丹 詹淑華 馬世武

1957年，美國Popper等[1]較早報(bào)道了膽管反應(yīng)(DR)，其特征是肝臟損傷誘導(dǎo)的反應(yīng)性膽管增生。因膽管反應(yīng)性病變不僅可由先前存在的膽管細(xì)胞產(chǎn)生，也可來自于肝細(xì)胞的膽管化生或活化和分化的肝祖細(xì)胞(HPCs)，所以在疾病狀態(tài)下用“膽管增生”來表示膽管樹和肝細(xì)胞界面上擴(kuò)大的上皮細(xì)胞群是不正確的。根據(jù)病理特征，DR可以被描述為膽管細(xì)胞或HPC增殖，是一種對肝膽細(xì)胞的修復(fù)反應(yīng)。DR期間的信號通路在不同的肝損傷或動(dòng)物模型中可能是不同的。DR不僅常見于膽道疾病中，也可發(fā)生在酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、慢性病毒性肝炎、肝細(xì)胞癌等各類肝臟疾病中。

一、肝病中DR的來源細(xì)胞及其表型標(biāo)記

參與DR反應(yīng)的細(xì)胞可有不同來源，其表型標(biāo)記有助于鑒別肝損傷中的膽管細(xì)胞、HPC和肝細(xì)胞(表1)。細(xì)胞角蛋白(CK)7或CK19被用于識(shí)別膽管細(xì)胞，而上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)和性別決定區(qū)Y框蛋白 9(SOX9)被認(rèn)為是HPC的標(biāo)記物。然而，膽管細(xì)胞也表達(dá)EpCAM和SOX9，因此這些標(biāo)記無法完全確定HPC增殖?，F(xiàn)在已將Foxl1列為HPC標(biāo)記，并證明表達(dá)Foxl1的HPC亞群在正常肝臟中很少見，但在由3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氫可樂定(DDC)飲食引起的肝損傷中顯著增加。滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原2(TROP2)和含有G蛋白偶聯(lián)受體5(Lgr5)的富含亮氨酸的重復(fù)序列也被認(rèn)為是在DDC誘導(dǎo)的肝損傷中增殖的HPC的標(biāo)志物。其他的HPC標(biāo)志物還包括OV6、A6、CD24、CD133、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞抗原2(NGA2)和C-X-C族趨化因子受體4(CXCR4)。

通過對肝損傷組織進(jìn)行免疫組化染色，計(jì)算CK7陽性標(biāo)志物在DR中所占比例，可將DR分為5個(gè)等級[3]，即：0=無，1=<10%，2=10%～25%，3=26%～50%，4=>50%。根據(jù)DR分級，可以初步判斷患者病情嚴(yán)重程度，評分越高則損傷越嚴(yán)重。此外，從形態(tài)學(xué)上還可將DR分為I、II和III型，即I型指形成管腔規(guī)則的膽管結(jié)構(gòu)，常見于膽道阻塞；II型是形成結(jié)構(gòu)不完整的膽管樣結(jié)構(gòu)，見于慢性活動(dòng)性肝炎，可在匯管區(qū)看到小膽管結(jié)構(gòu)；III型為形成由膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞共同重組的小膽管，見于肝臟亞大塊壞死后[4]。因此，根據(jù)DR的分型可以了解患者膽管結(jié)構(gòu)狀態(tài)，從而判斷疾病的臨床類型。受疾病的病因及病情的演變等因素影響，病理觀察中的DR并非都能按上述分型標(biāo)準(zhǔn)一一對應(yīng)，尤其是在出現(xiàn)相應(yīng)并發(fā)癥的情況下。

表1 DR中膽管細(xì)胞、肝細(xì)胞和肝祖細(xì)胞的鑒別標(biāo)記物

二、DR的信號傳導(dǎo)通路

DR中膽管細(xì)胞、肝細(xì)胞和HPC的增殖與信號通路密切相關(guān)。其中，Hippo-YAP/Notch信號傳導(dǎo)通路和HGF/c-Met信號傳導(dǎo)通路與轉(zhuǎn)分化成膽管細(xì)胞有關(guān)；Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路與向肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化相關(guān)；TWEAK/Fn14信號傳導(dǎo)通路可誘導(dǎo)HPC和膽管細(xì)胞增殖，但仍不清楚肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞是直接還是間接通過HPC轉(zhuǎn)分化而來。下面將從5種信號通路來詳細(xì)闡述DR轉(zhuǎn)分化相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路。

(一)Notch信號傳導(dǎo)通路 誘騙寡核苷酸(Decoy-ODN) 是Notch受體的下游靶點(diǎn)，可通過抑制免疫球蛋白Kappa J區(qū)重組信號結(jié)合蛋白(RBP-jκ)減弱DDC誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化，提示Notch信號通路與肝纖維化有關(guān)。在分離的小鼠HPC中，RBP-Jκ的過表達(dá)誘導(dǎo)HPC增殖以及HPC中CK7和CK19的表達(dá)升高，并且Notch信號抑制劑DAPT對Notch信號通路的抑制在體外減弱了那些細(xì)胞角蛋白的表達(dá)。在大鼠膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的表達(dá)OV6或CK19的DR中，顯示出OV6/CK19和SOX9/CK19的共定位，以及膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的Notch受體及其配體的表達(dá)水平升高。DAPT治療可減輕膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的體內(nèi)肝纖維化，并且在WB-F344細(xì)胞系中DAPT還可以抑制丁酸鈉誘導(dǎo)的HPC向膽管表型的分化。AAV8-TBG-Cre介導(dǎo)Notch受體中的一個(gè)亞型Notch1在肝細(xì)胞中的過表達(dá)可提高體內(nèi)肝細(xì)胞中OPN和SOX9的表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)表明Notch信號通路與HPC和肝細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成膽道表型有關(guān)，從而導(dǎo)致DR后肝纖維化。

(二)Hippo-YAP信號傳導(dǎo)通路 與無膽道閉鎖的患者相比，患有膽道閉鎖的患者的膽管高表達(dá)Yes相關(guān)蛋白(YAP)，它是Hippo信號通路的效應(yīng)物。PSC和PBC患者膽管中YAP表達(dá)升高。YAP基因敲除小鼠在膽管結(jié)扎期間，顯示減弱的膽管增生，這表明DR與Hippo-YAP信號通路有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞特異性YAP表達(dá)可誘導(dǎo)HPC和膽管標(biāo)志物(包括CK19、SOX9和A6)的表達(dá)升高，并且還顯示Notch信號通路是體內(nèi)YAP的功能性靶點(diǎn)。這些結(jié)果表明通過激活Notch信號通路，Hippo-YAP信號通路能與DR和肝細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成膽管細(xì)胞產(chǎn)生聯(lián)系。

(三)Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路 DDC飲食可以增加小鼠肝臟中表達(dá)A6的細(xì)胞數(shù)量，并且β-連環(huán)蛋白(β-catenin)與A6出現(xiàn)共定位。研究已經(jīng)顯示在β-catenin基因敲除小鼠中，DDC飲食期間表達(dá)A6的細(xì)胞數(shù)量減少，這說明在膽道損傷期間β-catenin與DR有關(guān)。Wntless是Wnt蛋白的運(yùn)輸和分泌所需的蛋白質(zhì)，敲除Wntless導(dǎo)致Wnt蛋白的分泌不足和Wnt/β-catenin信號通路失活。研究表明，肝臟特異性Wnt-less敲除的小鼠在DDC飲食期間有低表達(dá)A6和CK19的DR和肝纖維化發(fā)生。在Lyz2-Cre介導(dǎo)的肝臟巨噬細(xì)胞中，Wntless的特異性缺失導(dǎo)致肝部分切除術(shù)后肝再生受損和細(xì)胞增殖減少。Wntless缺失的影響是有爭議的。然而，Irvine等已經(jīng)證實(shí)，Lyz2-Cre介導(dǎo)的肝臟巨噬細(xì)胞中的Wntless缺失加劇了小鼠由硫代乙酰胺引起的表達(dá)CK的DR和肝纖維化[5]。根據(jù)Notch或Wnt/β-catenin信號通路，對小鼠使用膽堿缺乏乙硫氨酸補(bǔ)充(CDE)的飲食作為肝細(xì)胞再生模型和DDC飲食作為膽管細(xì)胞再生模型，探討了HPC在肝損傷過程中的命運(yùn)。在該模型中，減少Notch信號傳導(dǎo)并維持Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致CDE飲食期間肝細(xì)胞再生，并且Notch信號傳導(dǎo)被上調(diào)和Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)被下調(diào)，導(dǎo)致DDC飲食期間的膽管細(xì)胞再生。尚不完全了解肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞再生兩者是否需要Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo),需要進(jìn)一步的研究來闡明Wnt/β-catenin信號在各種肝損傷中的功能作用。

(四)HGF/c-Met信號傳導(dǎo)通路 人重組肝細(xì)胞生長因子(HGF)誘導(dǎo)肝部分切除術(shù)后大鼠肝再生。肝臟中Mx1-Cre介導(dǎo)的HGF受體c-Met缺失減少DDC飲食期間肝臟中表達(dá)CK19的DR和細(xì)胞增殖。與對照相比，肝細(xì)胞中Alb-Cre介導(dǎo)的c-Met缺失也減少了肝臟中表達(dá)A6 的HPC數(shù)量。用HGF處理肝細(xì)胞可誘導(dǎo)肝細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為體外膽道表型。抑制 HGF/c-Met信號傳導(dǎo)的下游靶點(diǎn)磷脂酰肌醇3-激酶，可抑制肝細(xì)胞向膽管細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。這些結(jié)果表明，HGF/c-Met信號通路與肝細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為膽管細(xì)胞有關(guān)。

(五)TWEAK/Fn14信號傳導(dǎo)通路 一項(xiàng)研究表明，CDE飲食誘導(dǎo)肝臟中成纖維細(xì)胞因子誘導(dǎo)基因14(Fn14)表達(dá)升高，F(xiàn)n14與panCK發(fā)生共定位；該研究還表明，與野生型相比，F(xiàn)n14基因敲除小鼠在CDE飲食期間顯示低表達(dá)A6 或CK19的DR，且作為Fn14配體的腫瘤壞死因子相關(guān)的細(xì)胞凋亡弱誘導(dǎo)因子(TWEAK)處理可誘導(dǎo)HPC細(xì)胞系增殖，BMOL細(xì)胞表明TWEAK/Fn14通路與DR相關(guān)[6]。在小鼠中，施用重組TWEAK可誘導(dǎo)表達(dá)panCK的DR。由Ah-cremediated鼠雙微基因2(Mdm2)缺失引起的嚴(yán)重肝細(xì)胞損傷后，敲除小鼠Fn14導(dǎo)致表達(dá)panCK的DR減少。重組TWEAK在Mdm2缺失小鼠中可誘導(dǎo)表達(dá)panCK的細(xì)胞擴(kuò)增。盡管目前尚不清楚TWEAK/Fn14通路是否需要轉(zhuǎn)分化，但這些發(fā)現(xiàn)表明該通路與HPC和/或膽管細(xì)胞增殖相關(guān)，從而導(dǎo)致DR。

三、DR與臨床肝膽疾病

(一)膽汁淤積性肝病 膽汁淤積性肝病是指由肝內(nèi)外各種原因引起膽汁分泌和排泄障礙，使膽汁不經(jīng)膽小管排至腸腔而淤積于肝內(nèi)，并可反流入血所造成器質(zhì)性損傷、代謝失調(diào)和功能紊亂等一系列的肝膽疾病。DR常見于膽汁淤積性肝病患者，例如原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)，原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)和膽道閉鎖(BA)。與健康個(gè)體相比，來自PBC或PSC患者的肝標(biāo)本顯示出廣泛表達(dá)CK19、EpCAM和OV6的DR。從BA患者的肝切片中也鑒定出表達(dá)CK7的DR。

表2 各類肝臟病患者DR的鑒定

(二)酒精性肝病 大量飲酒會(huì)引起急性或慢性酒精性肝病，包括肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化。 酒精性肝炎是一種以嚴(yán)重的肝臟炎癥和纖維化為特征的嚴(yán)重酒精性肝病。酒精性肝炎患者DR中反應(yīng)細(xì)胞來源于膽管細(xì)胞或HPC而非肝細(xì)胞，且DR分級與死亡率相關(guān)。

(三)非酒精性脂肪性肝病 非酒精性脂肪性肝病表現(xiàn)為與非酒精性肝病相似的肝臟脂肪變性，可逐漸導(dǎo)致非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。此外，肝纖維化程度越高的NASH患者DR評分越高，表明DR與NASH病情進(jìn)展有關(guān)。

(四)慢性病毒性肝炎 在乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)陽性的肝硬化患者中觀察到表達(dá)CK19的DR增高，表明DR與病毒感染引起的肝硬化有關(guān)。此外，肝移植后HCV復(fù)發(fā)患者中也可觀察到表達(dá)CK7的DR。肝硬化或膽汁淤積性肝炎等較重的肝病患者DR高于HCV復(fù)發(fā)進(jìn)展緩慢的患者，且肝纖維化分期與DR分級呈正相關(guān)。

(五)肝細(xì)胞癌 HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌(HCC)患者腫瘤周圍區(qū)域表達(dá)CK19的DR分級越高的患者炎癥分級或肝纖維化分期越高。由于在非侵襲性HCC患者中可觀察到高等級的DR，但在高侵襲性HCC患者中可發(fā)現(xiàn)低DR或無DR，因此DR可作為區(qū)分侵襲性和非侵襲性HCC的方法。

(六)DR與肝纖維化和衰老的關(guān)系 雖然肝星狀細(xì)胞(HSC)和門靜脈成纖維細(xì)胞是在肝損傷時(shí)導(dǎo)致纖維發(fā)生的主要細(xì)胞，但通過阻斷信號通路如分泌素/分泌素受體軸可抑制膽管細(xì)胞增殖和活化，同時(shí)通過減少轉(zhuǎn)化生長因子β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可減弱HSC增殖和肝纖維化，表明膽管細(xì)胞活化與HSC纖維化之間存在密切關(guān)系。HSC的活化可通過產(chǎn)生HGF，從而與HPC增殖和肝再生有關(guān)。此外，IL-13可獨(dú)立誘導(dǎo)膽管細(xì)胞增殖以及成纖維細(xì)胞的活化和纖維化，抑制IL-13的作用可在體內(nèi)減輕肝纖維化。 這些研究結(jié)果表明由于HSC與膽道細(xì)胞的密切關(guān)系，而肝纖維化通常伴隨DR，DR不僅可以發(fā)生在膽道疾病中，還可發(fā)生在由細(xì)胞因子調(diào)節(jié)的各種肝損傷中。說明DR及其分級作為肝損傷過程中肝臟狀態(tài)和纖維化標(biāo)志的重要性，它可作為抑制肝纖維化和促進(jìn)肝臟再生的治療靶點(diǎn)。

盡管膽管細(xì)胞向肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化仍存在爭議，但由Mdm2缺失引起的肝細(xì)胞衰老可以誘導(dǎo)膽管細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞，表明細(xì)胞衰老與膽管分化有關(guān)。另外，飲酒會(huì)使肝細(xì)胞衰老，并且它與miR-34a表達(dá)的肝纖維化相關(guān)；HCV陽性患者肝細(xì)胞衰老和HPC增殖之間也存在相關(guān)性。這些結(jié)果表明肝細(xì)胞的衰老可能通過誘導(dǎo)膽道增殖或轉(zhuǎn)分化來驅(qū)動(dòng)DR和纖維化發(fā)生。

四、結(jié)論與展望

目前的研究表明DR可發(fā)生在各種肝臟疾病中，但由于DR的復(fù)雜性，其類型和機(jī)制可能因肝損傷或動(dòng)物模型而異。DR可在各種肝病的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，并且與肝纖維化分期和死亡率等疾病狀況相關(guān)。在肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞損傷期間，DR也是肝再生的重要因素，因此DR也可作為肝病治療的靶點(diǎn)。然而，目前尚不清楚DR是通過提高膽管質(zhì)量和激活膽管細(xì)胞促進(jìn)肝纖維化，還是在損傷期間通過促進(jìn)肝再生來保護(hù)肝臟。這些內(nèi)容對未來治療臨床肝膽疾病具有一定的價(jià)值。