楊倩 趙偉剛 王曉琴

摘要[目的]建立小秦艽花中總環(huán)烯醚萜和總酚酸含量測定的方法，并測定10個(gè)藥材樣品中的含量。[方法]分別以龍膽苦苷和沒食子酸為對照品，建立紫外分光光度法測定總環(huán)烯醚萜和總酚酸含量的方法。[結(jié)果]10批小秦艽花樣品中環(huán)烯醚萜含量為67.95～155.16 mg/g;總酚酸含量為9.54～17.04 mg/g。[結(jié)論]2種含量測定方法操作簡便，精密度、重現(xiàn)性良好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于評價(jià)小秦艽花的質(zhì)量以及資源利用價(jià)值。

關(guān)鍵詞小秦艽花;總烯醚萜;總酚酸;含量測定

中圖分類號R282.71文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2019）03-0183-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.057

小秦艽花，為龍膽科龍膽屬植物達(dá)烏里龍膽（小秦艽）Gentiana dahurica Fisch.的干燥花[1]。2015版《中國藥典》中將小秦艽與大葉秦艽（G.macrophylla Pall.）、粗莖秦艽（G.crassicaulis Duthie）、麻花秦艽（G.straminea Maxim）作為中藥秦艽的基源植物，以干燥根入藥[2]。秦艽始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，性味苦、平，微寒，歸胃、肝、膽經(jīng)，具有祛風(fēng)濕、清濕熱、止痹痛、退虛熱的功效。而在藏藥志和蒙藥志中，秦艽組植物多以干燥花入藥，具有清熱解毒、止咳祛痰的功效。秦艽花在藏藥中應(yīng)用普遍，有時(shí)會和小秦艽花混用。小秦艽花，蒙藥名呼和-朱立根-其木格，是蒙醫(yī)專屬用藥，用于肺熱咳嗽、咽喉腫痛、毒熱、瘟熱等癥[3]。

國內(nèi)外學(xué)者的研究表明，秦艽基源植物的化學(xué)成分主要以環(huán)烯醚萜苷、三萜類和黃酮類為主。中藥秦艽（達(dá)烏里龍膽的根）和全草的成分主要為環(huán)烯醚萜、三萜類、黃酮類和苯甲酸衍生物等[4-6]。在前期的研究中[7]，首次從小秦艽花中分離鑒定出40多個(gè)五環(huán)三萜類成分、環(huán)烯醚萜類、黃酮類和以沒食子酸為代表的酚酸類成分，已經(jīng)基本明確其主要次生代謝產(chǎn)物類型。另據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[8]，以龍膽苦苷為代表的環(huán)烯醚萜類化合物具有一定的抗炎作用，可視為秦艽類藥材抗炎的主要有效成分。目前以龍膽苦苷和沒食子酸為對照品分別測定小秦艽花總環(huán)烯醚萜和總酚酸含量的方法均鮮見報(bào)道。筆者建立小秦艽花中總環(huán)烯醚萜和總酚酸的含量測定方法，為蒙藥小秦艽花進(jìn)一步的品質(zhì)評價(jià)研究、規(guī)范化種植、臨床應(yīng)用和復(fù)方藥物研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象。10批小秦艽花藥材分別購買于河北安國藥材公司、內(nèi)蒙古蒙藥材公司，或采集于內(nèi)蒙古自治區(qū)，由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)渠弼教授鑒定為達(dá)烏里龍膽（Gentiana dahurica Fisch.）的干燥花;該研究中含量測定方法學(xué)考察所用藥材為1號樣品（購買于內(nèi)蒙古蒙藥材公司）。

1.1.2主要儀器。 UVmini-1280型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津）;AL-204型分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）;超聲波提取器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.1.3主要試劑。龍膽苦苷對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號K16D7B26927，供含量測定用）;沒食子酸對照品（中國藥品生物制品鑒定所，批號110831-200302，供含量測定用）。十二烷基硫酸鈉、三氯化鐵、鐵氰化鉀、鹽酸和其他試劑均為分析純;試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2方法

1.2.1總環(huán)烯醚萜含量的測定方法。

1.2.1.1對照品溶液的制備。精密稱取龍膽苦苷對照品5.20 mg置于25 mL容量瓶中，甲醇定容，配制成208 μg/mL的對照品溶液，貯藏于4 ℃冰箱備用。

1.2.1.2供試品溶液的制備。取小秦艽花藥材粉末（3號篩）約0.1 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，稱重，超聲提取30 min，冷卻至室溫，補(bǔ)足失重，過濾，取續(xù)濾液0.15 mL于10 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得供試品溶液。

1.2.1.3吸收波長的確定。分別精密量取供試品溶液0.3 mL，對照品溶液2 mL置于10 mL容量瓶中，甲醇溶液定容，搖勻。以甲醇溶液作為空白對照，于200～400 nm波長進(jìn)行掃描[9]。

1.2.1.4線性關(guān)系的考察。精密吸取“1.2.1.1”項(xiàng)下龍膽苦苷對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置于10 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，以甲醇作為空白對照，于271 nm處測定吸光度。以吸光度差值為縱坐標(biāo)、濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

1.2.1.5精密度試驗(yàn)。 按“1.2.1.2”方法制備供試品溶液，并于271 nm處測定吸光度A，重復(fù)6次，計(jì)算峰面積的RSD。

1.2.1.6穩(wěn)定性試驗(yàn)。 按“1.2.1.2”方法制備供試品溶液，分別于溶液制備后0、10、20、30、40、50、60 min測定吸光度，計(jì)算總環(huán)烯醚萜含量和RSD。

1.2.1.7重復(fù)性試驗(yàn)。 按“1.2.1.2”方法平行制備供試品溶液6份，于271 nm處測定吸光度，計(jì)算總環(huán)烯醚萜含量和RSD。

1.2.1.8加樣回收率試驗(yàn)。取藥材粉末9份，每份約0.05 g，精密稱定，分別精密加入適量的龍膽苦苷對照品，按“1.2.1.2”方法制備供試品溶液，于271 nm處測定吸光度，計(jì)算平均回收率和RSD。

1.2.1.9樣品總環(huán)烯醚萜的含量測定。10個(gè)批次小秦艽花按“1.2.1.2”方法制備供試品溶液，于271 nm處測定吸光度，平行測定3次，計(jì)算含量。

1.2.2總酚酸的含量測定方法。

1.2.2.1對照品溶液的制備。精密稱取沒食子酸對照品5.80 mg置于25 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻后從中精密吸取1.0 mL溶液置于10 mL容量瓶中，甲醇定容，配制成23.2 μg/mL的沒食子酸對照品溶液，貯藏于4 ℃冰箱備用。

1.2.2.2供試品溶液的制備。取小秦艽花藥材（3號篩）粉末約0.1 g，精密稱定，置于100 mL圓底燒瓶中，加入95%甲醇25 mL，加熱回流2 h，冷卻至室溫，用95%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻并過濾。

1.2.2.3顯色方法。精密吸取待測液適量于10 mL容量瓶中，加無水乙醇至2 mL，精密加0.3%十二烷基硫酸鈉0.8 mL、0.6% FeCl3-0.9%K3[Fe（CN）3]（1.0∶0.9）混合溶液0.4 mL，搖勻，在暗處放置5 min后用0.1 mol/L HCl定容，搖勻，暗處放置20 min[10]。

1.2.2.4吸收波長的確定。分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各0.3 mL，顯色后，以顯色劑為空白，在200～800 nm波長進(jìn)行掃描。

1.2.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密吸取沒食子酸對照品溶液0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mL，顯色后，于743 nm處分別測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

1.2.2.6精密度試驗(yàn)。按“1.2.2.2”“1.2.2.3”方法制備供試品溶液并顯色，于743 nm處分別測定吸光度A，重復(fù)測定6次，計(jì)算峰面積的RSD。

1.2.2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“1.2.2.2”“1.2.2.3”方法制備供試品溶液并顯色，分別于顯色后0、15、20、25、30、35、40、45、50、55 min 測定吸光度，計(jì)算總酚酸含量和RSD。

1.2.2.8重復(fù)性試驗(yàn)。取小秦艽花粉末6份，每份約0.1 g，精密稱定，按“1.2.2.2”“1.2.2.3”方法制備供試品溶液并顯色，于743 nm處測定吸光度，計(jì)算總酚酸含量和RSD。

1.2.2.9加樣回收率試驗(yàn)。取藥材粉末9份，每份約0.05 g，精密稱定，分別精密加入適量的沒食子酸對照品，按照“1.2.2.2”“1.2.2.3”方法制備供試品溶液并顯色，于743 nm處測定吸光度，計(jì)算平均回收率和RSD。

1.2.2.10樣品總酚酸的含量測定。10個(gè)批次小秦艽花按“1.2.2.2”“1.2.2.3”方法制備供試品溶液并顯色，于743 nm處測定吸光度，平行測定3次，計(jì)算含量。

2結(jié)果與分析

2.1總環(huán)烯醚萜含量的測定

2.1.1吸收波長的確定。按“1.2.1.3”方法操作，結(jié)果顯示，對照品溶液與供試品溶液均在271 nm處有最大吸收，且無干擾，故選擇271 nm作為測定波長。

2.1.2線性關(guān)系考察。按“1.2.1.4”方法操作，得到回歸方程Y=0.018 2X-0.000 4（r= 0.999 0），表明龍膽苦苷在10.4～52.0 μg/mL與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3精密度試驗(yàn)。按“1.2.1.5”方法操作， 計(jì)算得峰面積的RSD為0.08%，表明儀器精密度良好。

2.1.4穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“1.2.1.6”方法操作，計(jì)算得總環(huán)烯醚萜含量的RSD為0.40%，說明供試品溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5重復(fù)性試驗(yàn)。按“1.2.1.7”方法操作，計(jì)算得總環(huán)烯醚萜含量的RSD為0.60%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn)。按“1.2.1.8”方法操作，計(jì)算平均回收率為96.42%，RSD為1.88%，表明該含量測定方法準(zhǔn)確可靠。

2.1.7樣品總環(huán)烯醚萜的含量測定。由表1可知，10批小秦艽花樣品中總環(huán)烯醚萜含量為67.95～155.16 mg/g。

2.2總酚酸含量的測定

2.2.1吸收波長的確定。按“1.2.2.4”方法操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試品溶液與對照品溶液的吸收曲線基本一致，在743 nm處均有最大吸收波長，且無干擾，故選擇743 nm作為測定波長。

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。按“1.2.2.5”方法操作，計(jì)算得到回歸方程Y=0.493 9 X+0.001 7（r=0.999 6），表明沒食子酸在0.354～0.944 μg/mL與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3精密度試驗(yàn)。按“1.2.2.6”方法操作，計(jì)算得峰面積的RSD為0.04%，表明儀器精密度良好。

2.2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“1.2.2.7”方法操作，計(jì)算得總酚酸含量在15～45 min的RSD為0.70%，說明供試品溶液在15～45 min穩(wěn)定性良好。

2.2.5重復(fù)性試驗(yàn)。按“1.2.2.8”方法操作，計(jì)算得總酚酸含量的RSD為0.20%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.2.6加樣回收率試驗(yàn)。按“1.2.2.9”方法操作，計(jì)算得出平均回收率為98.19%，RSD為0.75%，表明該含量測定方法準(zhǔn)確可靠。

2.2.7樣品總酚酸的含量測定。由表1可知，10批小秦艽花樣品中總酚酸含量為9.54～17.04 mg/g。

3結(jié)論與討論

紫外分光光度法（比色法）是測定中藥和天然藥物中大類成分總含量的常見方法。張秀艷等[7]研究發(fā)現(xiàn)小秦艽花成分復(fù)雜多樣，大類成分主要為環(huán)烯醚萜類、五環(huán)三萜類、黃酮類和酚酸類成分。該研究分別建立了紫外分光光度法測定小秦艽花中總環(huán)烯醚萜和總酚酸含量的方法，并對野外采集實(shí)驗(yàn)室陰干的藥材樣品以及購買于藥材市場的10批樣品進(jìn)行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該研究建立的方法快捷、準(zhǔn)確，以期為小秦艽花藥材的質(zhì)量評價(jià)和資源利用提供科學(xué)依據(jù)。

該試驗(yàn)對小秦艽花總環(huán)烯醚萜的提取條件進(jìn)行了考察，對不同提取溶劑（先考察水、30%、50%、70%、100%甲醇;后考察40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%甲醇）、提取方法（超聲提取和回流提取）、提取時(shí)間（20、30、40、50、60 min）和取樣量（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g）等單因素進(jìn)行考察，最終確定取樣量為0.1 g，加60%甲醇25 mL，超聲提取30 min為總環(huán)烯醚萜的最佳提取條件。

對小秦艽花總酚酸的提取條件進(jìn)行了考察，對提取溶劑（先考察水、30%、50%、70%、100%甲醇;后考察80%、85%、90%、95%甲醇）、提取方法（超聲提取和回流提取）、提取時(shí)間（30、60、90、120 min）、回流次數(shù)（1、2、3次）和取樣量（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g）等單因素進(jìn)行考察，確定0.1 g取樣量，加95%甲醇25 mL，回流2 h、回流1次為總酚酸的最佳提取條件。

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