上官亦卿 常帆 呂睿 齊凡 賈鳳安 王艷 丁浩

摘要：為開發(fā)高效微生物解磷肥，利用解磷菌選擇培養(yǎng)基（蒙吉娜卵磷脂培養(yǎng)基）從陜西省西安市周至縣獼猴桃園農田土壤中分離出11株解磷菌，通過純化培養(yǎng)，篩選出1株高效解磷菌JYP9。利用16S rDNA基因序列分析方法對該菌株的分類信息進行鑒定，鑒定結果表明該菌株為假單胞菌（Pseudomonas extremorientalis）。并用解磷圈法和液體搖瓶培養(yǎng)法，分別以卵磷脂為惟一磷源，確定了該菌株的最適培養(yǎng)溫度為26 ℃、最適轉速為200 r/min、最適起始pH為7和最適起始接種量為2%。

關鍵詞：解磷菌;篩選;鑒定;最適條件

中圖分類號：S154.39? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）01-0030-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.01.007? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Isolation，Screening，Identification and Phosphate Solubilizing Ability of Phosphate Solubilizing Bacteria

SHANGGUAN Yi-qing1，2，CHANG Fan2，LYU Rui2，QI Fan1，JIA Feng-an2，WANG Yan2，DING Hao2

（1.Shaanxi Academy of Sciences，Xian 710043，China;

2.Microbial Metabolism Research Center，Shaanxi Province Institute of Microbiology，Xian 710043，China）

Abstract： In order to develop an efficient microbial fertilizer solution， 11 strains from the farm-land soil of actinidia park in Zhouzhi county， Shaanxi prvince， were isolated， using phosphate volubility bacteria selective culture medium （Mongolia lecithin culture medium）. A strain of phosphate volubility bacteria JYP9 was screened through purification cultivar. And classification information of this strain was identified by using 16S rDNA gene sequence analysis， the results showed that the strain was a Pseudomonas extremorientalis. Then the phosphate solubilizing method and the liquid shake flask method were used in the experiment to confirm the optimum cultivation condition of JYP9 with lecithin as the only phosphorus source. The results showed that the optimal temperature was 26 ℃， optimal rotational was 200 r/min， optimal pH was 7， and optimum initial inoculation amount was 2%.

Key words： phosphate solubilizing bacteria; screen; identify; optimum condition

磷是植物生長所需的一種主要營養(yǎng)元素，但植物對土壤中的磷元素利用率很低，嚴重影響著植物的生長[1]。有機磷是土壤磷的重要組成部分，一般占土壤全磷的20%～50%，其中植酸磷占有機磷的10%～50%[2]，是土壤有機磷的主要存在形式。解磷菌能將植物難以吸收利用的難溶性或不溶性磷轉化為可利用的形態(tài)，提高土壤中磷素的利用效率，減少化學肥料的施用，降低農業(yè)投入成本。因此，對土壤環(huán)境進行微生物修復是提高作物產量、解決土壤速效磷缺乏的重要途徑之一[3，4]。

存在于土壤中的根際細菌、內部共生細菌被認為是最有效的解磷微生物，它們能夠利用自身的代謝物質[5]、通過NH4+同化作用[6]或釋放H2S[7]將被土壤固定的無效態(tài)磷釋放出來。這些細菌能夠將被土壤固定的礦物態(tài)磷釋放出來，但是其在植物根際的數量不足以與其他微生物競爭，難以揮發(fā)其活性，因此篩選出具有高效溶磷能力的菌株，并將其添加到生物有機肥中，以供給作物充足的磷素顯得尤為重要。中國對解磷細菌的研究起步于20世紀50年代，研究人員從東北黑土和灰化土中分離出具有解磷功能的巨大芽孢桿菌[8]?，F(xiàn)在對溶磷菌的研究主要集中于溶解無機磷菌株的篩選方面[9-11]，對于土壤難溶性有機磷解磷菌的研究卻鮮有報道[12]。本研究選擇一種有機磷培養(yǎng)基（蒙吉娜卵磷脂培養(yǎng)基），以卵磷脂作為惟一磷源，通過選擇性培養(yǎng)從獼猴桃大田土壤中分離出11株解磷細菌，并通過分離、純化、復篩，得到一株解磷能力較強的細菌 JYP9，研究該菌株的生理生化特征及對卵磷脂的降解特性，確定菌株的最適初始接種量、最適pH、最適生長溫度及最佳轉速對解磷能力的影響，旨在確定該菌株的生長情況及解磷能力，為開發(fā)新的成本低、效果好且不污染環(huán)境的解磷菌，充分利用土壤中的磷素資源提供科學依據，對發(fā)展綠色農業(yè)具有十分重要的意義。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 土樣? 土壤樣品采集自陜西省西安市周至縣獼猴桃園，釆集方法為五點采樣法，去除表層土壤，用土鉆取深度為0～20 cm的土壤，將5個不同點的土樣混合為1份，裝入無菌樣品采集袋，標簽注明采樣信息，放入4 ℃冰箱保存。

1.1.2? 樣品? 市購卵磷脂。

1.1.3? 培養(yǎng)基? ①分離培養(yǎng)基[13，14]。蔗糖5.0 g，KH₂PO₄

0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，CaCO₃5 g，瓊脂20 g，去離子水1.0 L，pH 7.2～7.5，121 ℃滅菌20 min。②蒙吉娜卵磷脂培養(yǎng)基[15]（有機磷細菌培養(yǎng)基）。蔗糖（葡萄糖）10.0 g，（NH₄）₂SO₄0.5 g，NaCl 0.3 g，MgSO₄·7H₂O 0.3 g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O（微量）0.03 g，NaCl 0.3 g，MnSO₄·7H₂O（微量）0.03 g，CaCO₃5.0 g，卵磷脂1.0 g（卵磷脂用時先溶于75%乙醇中），去離子水1 L，瓊脂18～20 g， pH 7.2～7.4。③牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，去離子水1 L，固體培養(yǎng)基加瓊脂 15～20 g。

所有培養(yǎng)基均置于0.05 MPa滅菌鍋中滅菌20 min后進行試驗。

1.1.4? 種子液? 從保存培養(yǎng)基上挑取菌種接種至150 mL有機磷液體培養(yǎng)基中的三角瓶中，放置于28 ℃、200 r/min的搖床上培養(yǎng)24 h。

1.1.5? 其他溶液

1）17.5 mol/L硫酸鉬銻儲存液。取去離子水400 mL，放入1 L燒杯中，將燒杯浸入冷水中，之后注入分析純濃硫酸208 mL，并不斷攪拌，冷卻至室溫。分析純鉬酸銨20 g溶于200 mL去離子水，將硫酸溶液緩慢倒入鉬酸銨溶液中，并不斷攪拌，再加入100 mL 5 g/L（0.5 g）酒石酸銻鉀溶液，去離子水定容至1 L，搖勻，保存。100 mL儲液加入1.5 g抗壞血酸（VC）組成鉬銻抗顯色劑（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

2）磷標準儲備液。準確稱取經105 ℃下烘干2 h的磷酸二氫鉀（GB1274，優(yōu)級純）0.439 0 g，用水溶解后，加入5 mL濃硫酸，加水定容至1 L，該溶液含磷100 mg/L，放于冰箱可供長期使用。

1.2? 方法

1.2.1? 解磷菌的富集? 取3只250 mL錐形瓶，各裝入含無機鹽液體培養(yǎng)基100 mL，向錐形瓶中分別加入1 g土壤樣品，搖床培養(yǎng)3 d（溫度28 ℃，轉速200 r/min），吸取錐形瓶底部菌液進行轉接，富集解磷菌，每次轉接前將菌液涂布到平板上計數。

1.2.2? 解磷菌的初篩? 將富集培養(yǎng)基中的菌種轉接到含卵磷脂培養(yǎng)基的平板上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，出現(xiàn)菌落后，挑取單菌落轉接至新的固體培養(yǎng)基上，重復上述操作3次，將單菌落放入冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3? 解磷菌的復篩? 將初篩出的菌株轉接到裝有100 mL卵磷脂液體培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)3 d，涂布，記錄菌數，同時測量溶磷圈的大小，選取溶磷圈大的菌株為目標菌。

1.2.4? 菌株形態(tài)學及生理生化特征? 將分離純化得到的菌株在固體平板上進行劃線培養(yǎng)，在溫度為30 ℃的條件下培養(yǎng)2 d，觀察菌株生長狀況及菌落特征。

1.2.5? 菌株16S rDNA序列分析及比對? 選用細菌16S rDNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGAC TT-3′）建立PCR擴增體系進行擴增。PCR 反應體系（50 μL）為5×One Taq Standard Reaction Buffer 10 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，10 μmol/L Forward Primer 1 μL，10 μmol/L Reverse Primer 1 μL，One Taq DNA Polymerase 1 μL，Template DNA 2.0 μL，Nuclease-Free Water 34 μL。擴增程序為94 ℃預變性10 min;94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán);72 ℃后延伸10 min。產物經純化后測定基因序列， 利用 BLAST將菌株的基因序列與 GenBank數據庫中的序列進行比較，選取相似性較高的模式菌株序列，用MEGA5.1中Neighbor-Joining法比較同源性，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6? 菌株解磷能力測定? 配制解磷培養(yǎng)基（無磷），按50 mL每瓶分裝于250 mL錐形瓶中，各加入0.1 g準確稱取的卵磷脂，在121 ℃條件下滅菌20 min，每個錐形瓶接入2%待測菌懸液，30 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)液倒入離心管配平，10 000 r/min離心5 min，取上清液10 mL，加入顯色劑5 mL，定容至50 mL，最后放置30 min，進行反應后（抗銻比色法[12]）測定上清液中速效磷含量。

1）標準曲線的測定。將配好的磷標準儲備液吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL到20 mL的玻璃管中，然后吸取5 mL顯色劑到玻璃管中，最后都定容到20 mL，反應30 min后，進行速效磷含量的測定。

2）最適生長溫度測定。按2%接種量將菌株接入培養(yǎng)液中，調節(jié)pH為7將菌種接于解磷液體培養(yǎng)基中，分別置于溫度為24、26、28、30、32 ℃的搖床中培養(yǎng)5 d后將菌液倒入離心管配平，然后以? 10 000 r/min離心5 min，取上清，定容至50 mL，以不接菌處理為對照，檢測速效磷含量。

3）最適生長轉速測定。按試驗得出的最適接種量將菌液接種到解磷液體培養(yǎng)基中，調節(jié)pH為7，溫度設置為30 ℃，調節(jié)搖床轉速分別為140、160、180、200、220 r/min，培養(yǎng)5 d后將菌液倒入離心管中配平，然后以10 000 r/min離心5 min，取上清，定容至50 mL，以不接菌處理為對照，檢測速效磷含量。

4）最適初始pH測定。配制解磷液體培養(yǎng)基，分組調節(jié)pH為5、6、7、8、9，按最適初始接種量和最適生長轉速將菌液接種到解磷菌篩選培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下?lián)u瓶培養(yǎng)5 d（溫度28 ℃，轉速200 r/min）后將菌液倒入離心管中配平，然后以10 000 r/min離心5 min，取上清，定容至50 mL，以不接菌處理為對照，檢測速效磷含量。

5）最適初始接種量測定。配制液體培養(yǎng)基，將菌液進行稀釋，按1%、2%、3%、4%和5% 5個接種量接入到解磷培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下?lián)u瓶培養(yǎng)5 d（溫度28 ℃，轉速200 r/min）后將菌液倒入離心管中配平，然后以10 000 r/min離心5 min，取上清，定容至50 mL，以不接菌處理為對照，檢測速效磷含量。

1.2.7? 數據處理? 數據采用Excel 2010和SPSS 19統(tǒng)計軟件進行方差分析和多重比較。

2? 結果與分析

2.1? 解磷菌的篩選

對土壤樣品進行涂布處理，初步得到菌株56株，經復篩，得到具有高效解磷能力的菌株11株，通過鉬藍比色法測定解磷量，計算時稀釋倍數為50倍，所有的數據均為3次測定的平均值。由表1可知，11株解磷菌的解磷能力均較強，比對照組都有明顯增加。其中，JYP6解磷效果最弱，菌液中速效磷含量最低，比空白對照增加了0.12%;而菌株JYP9培養(yǎng)液中速效磷含量最高，比空白對照增加了93.84%，其解磷能力最強，菌株JYP9的解磷率比其他菌株有顯著增加，因此，本試驗以JYP9菌株為研究對象，對其菌落特征和解磷特性做進一步研究。

2.2? 菌落形態(tài)

采用平板劃線法將JYP9菌株進行純化，并轉接至固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2 d后觀察菌株形態(tài)。如圖1所示，菌株單菌落呈水滴裝，菌落無色透明，邊緣光滑，表面濕潤且黏稠，菌落直徑約為0.5 mm。單菌落的溶解以及解磷圈形態(tài)見圖2，解磷圈的內外直徑比為0.913。

2.3? 16S rDNA測序分析

菌株JYP9經16S rDNA測序獲得1 418 bp的基因片段，將序列信息提交到GenBank數據庫中，利用BLAST將菌株的基因序列進行相似性比較，結果表明，菌株JYP9與假單胞菌屬同源性很高，從16S rDNA序列相似性比較結果看，菌株JYP9與Pseudomonas extremorientalis相似性達到100%;選取17株同源性較高的假單胞菌菌株序列與待測菌株序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示，從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，菌株JYP9與P. extremorientalis相似性達到100%且處于同一分支，距離最近，鑒定菌株JYP9為P. extremorientalis。

2.4? 菌株解磷能力測定結果

2.4.1? 標準曲線的測定? 用鉬銻抗分光光度法測定磷。在一定酸度和銻離子存在的情況下，磷酸根與鉬酸銨形成銻酸鉬混合雜多酸，它在常溫下可迅速被抗壞血酸還原為鉬藍，在660 nm波長下測定。試驗的適宜酸度為0.28～0.38 mol/L H2SO4，適宜時間為20～60 min，可穩(wěn)定24 h，磷含量為0.5～2.0 mg/L時符合線性關系。標準曲線結果見圖4。

2.4.2? 最適培養(yǎng)溫度? 由圖5可知，溫度的變化對菌株的生長有顯著影響，隨著溫度的升高，菌株解磷能力逐漸增強，當溫度達到26 ℃時，解磷量達到最高，菌液中的速效磷含量達到8.12 mg/L，比24 ℃時增加了4.94 mg/L，而溫度為32 ℃時，解磷量為2.23 mg/L，可能是溫度升高導致菌株生長受到抑制，使解磷能力降低，因此確定菌株JYP9的最適生長溫度為26 ℃。

2.4.3? 最適培養(yǎng)轉速? 由圖6可知，不同搖床轉速對解磷能力有明顯影響，當搖床轉速增加時，菌株解磷能力逐漸增加，當轉速達到200 r/min時，菌液中速效磷含量最高，菌液中的速效磷含量達到7.48 mg/L，當轉速達到220 r/min時，解磷能力降低，菌液中速效磷含量為7.10 mg/L，比200 r/min時減少了0.38 mg/L，二者有一定差異，其原因可能是轉速過高，產生的剪切力對菌體造成機械損傷，降低了菌株的解磷能力。由此可知，菌株JYP9的最適培養(yǎng)轉速為200 r/min。

2.4.4? 最適培養(yǎng)pH? 由圖7可以看出，不同pH對菌株生長及解磷能力有顯著影響，pH 7時解磷量達到最大，菌液中的速效磷含量達到7.53 mg/L，與其他pH有明顯差異。因此確定，菌株JYP9的最適生長pH為7，且菌株適合生長于中性環(huán)境中，這對于菌株的大規(guī)模生產有重要指導意義。

2.4.5? 最適初始接種量? 不同的初始接種量對解磷能力有一定的影響，由圖8可以看出，隨接種濃度的增加，速效磷含量呈先增加后減少的趨勢，當接種量為2%時，菌液中速效磷含量達到最大，為7.36 mg/L，比接種量為1.0%時高了4.75 mg/L，有顯著性差異，而當接種量為3%時，解磷量為6.41 mg/L，與2%時也有顯著性差異，從經濟角度考慮，選取2%為最適接種量。

3? 小結與討論

隨著種植業(yè)結構的調整，農作物產量和復種指數的不斷提高，土壤中耗磷量的不斷增加，全國耕地土壤速效磷含量逐年下降，南方各地土壤缺磷情況更為嚴重。土壤中的含磷硅酸鹽礦物只有在理化因素和微生物的作用下，通過分化和分解逐步釋放出磷供作物生長利用。本研究從陜西省周至縣獼猴桃園土壤中篩選到11株高效解磷菌，通過鑒定和解磷能力的測定，復篩出1株解磷能力最強的菌株，命名為JYP9，通過16S rDNA測序，并對序列進行比對，確定其為假單胞菌（Pseudomonas extremorientalis）。

解磷微生物的解磷機理非常復雜，有學者認為解磷微生物通過溶解或礦化作用能使土壤中難溶態(tài)磷或非溶性有機磷轉化為可供植物利用的速效磷形式[16]。一般認為無機解磷微生物能向外分泌酸性物質，如葡萄糖酸、酒石酸、檸檬酸等來降低土壤環(huán)境的pH，使難溶性的磷酸鹽溶解;而有機解磷微生物向外分泌酶類物質，如磷酸酶、核酸酶等將磷酸脂等有機磷鹽礦化。本試驗主要對有機解磷微生物JYP9進行了研究，結果表明，溫度為24 ℃和26 ℃的解磷量差異很大，26 ℃時解磷量達到最大，之后隨著溫度的升高，解磷量下降;在轉速為140～200 r/min時，隨著轉速增加，解磷量也增加，表明接觸面積越大，解磷量就越大，但是過快的轉速（220 r/min）會使解磷量下降，可能是因為速度過快而導致培養(yǎng)液中的營養(yǎng)沒有充分吸收;pH對解磷量有顯著影響，pH 7時解磷量最大，但是過酸或者過堿都會影響解磷量，而且影響顯著，顯然JYP9適宜在中性條件下生存;接種量對解磷量影響顯著，2%的接種量與1%的接種量相比，解磷量增加了很多，但是接種量過大反而會抑制生長，導致解磷量減少。由此可知，該菌株的最適培養(yǎng)條件為初始接種量2%、搖床轉速200 r/min、培養(yǎng)溫度26 ℃、初始pH 7。該結果為菌株的開發(fā)利用提供了數據支持和理論基礎。

參考文獻：

[1] AB-ALLA M H. Phosphates and the utilization of organic phosphorus by Rhizobium leguminosarum biovar viceae[J].Letters in Applied Microbiology，1994，18（5）：294-296.

[2] DALAL R C. Soil organic phosphorus[J].Advances in Agronomy，1977，29（1）：83-117.

[3] 張寶貴，李貴桐.土壤生物在土壤磷有效化中的作用[J].土壤學報，1977，35（1）：104-111.

[4] 馮月紅，姚? 拓，龍瑞軍.土壤解磷菌研究進展[J].草原與草坪，2003，15（1）：3-7.

[5] 鐘傳青，黃為一.磷細菌P17對不同來源磷礦粉的溶磷作用及機制[J].土壤學報，2004，41（6）：931-937.

[6] ILLMER P，BARBARA A，SCH-INNER F. Volubility of hardly-soluble AlPO4 with P-volubility microorganisms[J].Soil Biochemistry，1995，27（3）：265-270.

[7] SPERBER J I. Solution of mineral phosphates by soil bacteria[J].Nature，1957，180（1）：994-995.

[8] 張云翼，鄒碧瑩.土壤解磷細菌的研究進展[J].現(xiàn)代農業(yè)科技，2008（1）：182-184.

[9] 劉? 江，谷? 潔，高? 華，等.秦嶺山區(qū)無機磷細菌篩選及其Biolog和分子生物學鑒定[J].干旱地區(qū)農業(yè)研究，2012，30（1）：184-189.

[10] 段秀梅，高曉蓉，呂? 軍，等.兩株土壤分離菌的解磷能力及對玉米的促生作用[J].中國土壤與肥料，2010，29（2）：79-85.

[11] 虞偉斌，楊興明，沈其榮，等.K3解磷菌的解磷機理及其對緩沖容量的響應[J].植物營養(yǎng)與肥料學報，2010，16（2）：354-361.

[12] 胡秀芳，陳集雙，陳海敏.一株有機磷降解菌的篩選、鑒定及其解磷功效[J].中國環(huán)境科學，2005，25（3）：353-356.

[13] 魯如坤.土壤農業(yè)化學分析方法[M].北京：中國農業(yè)科學技術出版社，2000.60-71.

[14] 劉亞男，于水利，薛? 罡，等.聚磷菌PA01-1的篩選及除磷特性[J].中國給水排水，2005，21（10）：13-17.

[15] 楊艷華.土壤解磷微生物的分離鑒定[D].鄭州：河南農業(yè)大學，2014.

[16] 唐? 勇，陸? 玲，楊啟銀，等.解磷微生物及其應用的研究進展[J].天津農業(yè)科學，2001，7（2）：1-5.