黃烈城 陳紅燕 龐鳳舜 秦有

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（廣州510000）；2廣東省中醫(yī)院芳村醫(yī)院外科（廣州510000）

術(shù)后疲勞是指手術(shù)后出現(xiàn)的以乏力、失眠、注意力不集中、抑郁、焦慮等癥狀為主要表現(xiàn)的一組癥候群，是術(shù)后常見(jiàn)并發(fā)癥，也稱為術(shù)后疲勞綜合征，嚴(yán)重影響著患者術(shù)后康復(fù)和長(zhǎng)遠(yuǎn)的生存質(zhì)量。目前對(duì)術(shù)后疲勞的發(fā)生機(jī)制尚未有完全統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)，一般認(rèn)為與手術(shù)后炎癥應(yīng)激、營(yíng)養(yǎng)障礙、免疫功能低下、神經(jīng)遞質(zhì)含量變化、機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)、心理狀態(tài)等相關(guān)［1-6］，對(duì)于反映術(shù)后疲勞大鼠整體狀態(tài)的具體代謝途徑未作進(jìn)一步研究。代謝組學(xué)作為一種系統(tǒng)的生物學(xué)方法可通過(guò)測(cè)定代謝調(diào)控的小分子代謝變化從而描述機(jī)體的整體狀態(tài)，本文采用代謝組學(xué)方法研究中段小腸切除大鼠模型發(fā)生術(shù)后疲勞的機(jī)制，可以補(bǔ)充現(xiàn)有研究中對(duì)術(shù)后疲勞具體代謝途徑的空白，更加全面地認(rèn)識(shí)術(shù)后疲勞，為進(jìn)一步促進(jìn)術(shù)后疲勞恢復(fù)的藥物和臨床實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑超高效液相色譜（UPLC）系統(tǒng)（SCIEX，UK），高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜儀Triple TOF 5600 plus（SCIEX，UK），高速離心機(jī)，動(dòng)物解剖臺(tái)，甲醇，甲酸，乙酸銨等。

1.2 大鼠模型構(gòu)造和血漿樣品采集體質(zhì)量200～240 g 健康SPF 級(jí)SD 雄性大鼠20 只，隨機(jī)分為模型組和正常組各10 只，廣東省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供的大鼠標(biāo)準(zhǔn)伺料，大鼠自由飲水?dāng)z食，動(dòng)物房?jī)?nèi)溫度20～24 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，光線由實(shí)驗(yàn)室管理員控制明暗各12 h。

模型組采用中段小腸切除方法構(gòu)造術(shù)后疲勞模型［7］，正常組僅予等量水合氯醛麻醉，具體造模方法如下：大鼠禁食12 h 后稱重，10%水合氯醛麻醉后背位固定（0.35 mL/100 g 體質(zhì)量腹腔注射），備皮消毒鋪巾，取腹白線上長(zhǎng)約1.5 cm 切口入腹，順系膜將腸管輕提出體外，從空腸起始附著點(diǎn)約10 cm 處開始標(biāo)記70%中段小腸，絲線結(jié)扎腸系膜動(dòng)脈截?cái)嘌┖笄谐?-0 可吸收線均勻間斷縫合腸管行端端吻合。確認(rèn)吻合口血運(yùn)情況良好，無(wú)梗阻及腸瘺情況，順腸系膜方向?qū)⒛c管送回腹腔，術(shù)畢關(guān)腹。

術(shù)后第1 天大鼠恢復(fù)進(jìn)食及飲水，術(shù)后第8 天行腹主動(dòng)脈采血。麻醉后沿腹白線開腹，暴露腹主動(dòng)脈，一次性采血針插入動(dòng)脈下段，連接含30 μL 10% EDTA-二鈉的真空采血管采集血液，混勻，4 ℃條件下3 000 r/min 離心10 min，取上層血漿樣品。最終采集的血漿樣品，模型組n=7，正常組n=10，保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.3 血漿樣品預(yù)處理及LC-MS分析血漿樣品于冰上解凍，用120 μL 預(yù)冷的50%甲醇提取20 μL樣品，渦旋1 分鐘，并在室溫下孵育10 min；然后將萃取混合物在-20℃下儲(chǔ)存過(guò)夜，4 000 r/min 離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的96 孔板中進(jìn)行LC-MS 分析。此外，還通過(guò)組合10 μL 每種提取混合物來(lái)制備樣品QC 樣品用以判斷儀器狀態(tài)。

液相色譜條件：使用ACQUITY UPLC BEH 酰胺柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters，UK）進(jìn)行反相分離。柱溫箱保持在35 ℃，流速為0.4 mL/min，流動(dòng)相由溶劑A（25 mmol/L 乙酸銨+ 25 mmol/L NH4H2O）和溶劑B（IPA∶ACN=9∶1 + 0.1%甲酸）組成。梯度洗脫條件如下：0～0.5 min，線性變化至95%B；0.5～9.5 min，線性變化至95%～65%B；9.5～10.5 min，線性變化至65%～40%B；10.5～12 min，線性變化至40%B；12～12.2 min，線性變化至40%～95%B；12.2～15 min，線性變化至95%B；進(jìn)樣體積為4 μL。

質(zhì)譜條件：Q-TOF 在正離子和負(fù)離子模式下操作，幕簾氣體設(shè)定為30 PSI，離子源氣體設(shè)定為60 PSI，界面加熱器溫度設(shè)定為650 ℃。對(duì)于正離子模式，離子噴涂電壓浮動(dòng)設(shè)定為5 000 V，對(duì)于負(fù)離子模式，離子的Ionspray 電壓分別設(shè)置為-4 500 V。質(zhì)譜數(shù)據(jù)以IDA 模式獲得，TOF 質(zhì)量范圍為60～1 200 Da，總循環(huán)時(shí)間固定為0.56 s，動(dòng)態(tài)排除設(shè)定為4 s，采集期間每20個(gè)樣品校準(zhǔn)質(zhì)量準(zhǔn)確度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法LC-MS 原始數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)換為mzXML 格式，利用XCMS 軟件做峰提取質(zhì)控，進(jìn)行峰提取。對(duì)提取到的物質(zhì)利用CAMERA 進(jìn)行加和離子注釋，然后利用metaX 軟件進(jìn)行一級(jí)鑒定，分別使用質(zhì)譜一級(jí)信息進(jìn)行鑒定和質(zhì)譜二級(jí)信息與in-house 標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配。候選鑒定物質(zhì)分別利用HMDB、KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行代謝物注釋，解釋代謝物的物理化學(xué)性質(zhì)、生物功能。使用PCA、PLS-DA等方法篩選出重要差異性代謝產(chǎn)物，進(jìn)行相關(guān)代謝途徑分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血漿代謝譜分析采用正負(fù)離子切換模式采集大鼠血漿樣品代謝譜信息，LC-MS 數(shù)據(jù)使用XCMS 軟件進(jìn)行峰提取，獲得代謝物離子峰的質(zhì)荷比、保留時(shí)間和離子面積等信息，共識(shí)別出正離子模式下6 828個(gè)離子信息，所得數(shù)據(jù)經(jīng)預(yù)處理進(jìn)入下一步分析，圖1 為模型組（A）、正常組（C）大鼠血漿樣品離子色譜圖，圖2 為大鼠血漿樣品的典型總離子流色譜圖（TIC）。

圖1 正常組（A）、模型組（C）離子色譜圖Fig.1 A model group and a normal group ion chromotogram

2.2 差異代謝物統(tǒng)計(jì)采用單變量分析差異倍數(shù)（fold-change）和T 統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)得到的p-value 值，結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析PLS-DA 得到的VIP 值（variable important for the projection），來(lái)篩選差異表達(dá)的代謝物。差異離子同時(shí)滿足條件：（1）ratio ≥2 或者ratio ≤1/2；（2）P value ≤0.05：（3）VIP ≥1。最終得到5 680個(gè)差異離子，術(shù)后疲勞大鼠較正常大鼠上調(diào)的差異離子數(shù)目322個(gè)，下調(diào)的差異離子數(shù)目580個(gè)。

圖2 總離子流色譜圖（TIC）Fig.2 Total ion chromotogram

2.3 多變量統(tǒng)計(jì)PCA、PLS-DA 分析主成分分析（principal component analysis，PCA）是一種降維方法，能將多個(gè)變量形成一組新的綜合變量，再?gòu)闹羞x取幾個(gè)（通常是2～3個(gè)），從而盡可能多地反映原有變量信息。PCA 主要用于觀察模型中組間分離趨勢(shì)，以及是否出現(xiàn)異常點(diǎn)，同時(shí)從原始數(shù)據(jù)上反映組間和組內(nèi)的變異度。對(duì)于檢測(cè)到的物質(zhì)和鑒定到的代謝物進(jìn)行PCA 分析，PCA 得分圖主要表示數(shù)據(jù)點(diǎn)的分布趨勢(shì)，圖中的每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本，所有樣本之間的異同體現(xiàn)于得分圖中樣品的分離趨勢(shì)或聚集度。模型組術(shù)后疲勞大鼠（A表示）與正常組大鼠（C 表示）在PCA 得分圖上呈現(xiàn)分離趨勢(shì)，說(shuō)明術(shù)后疲勞大鼠與正常組代謝物存在差異（圖3）。PCA 散點(diǎn)負(fù)載圖反映導(dǎo)致樣本區(qū)別的變量，其中變量離原點(diǎn)的空間距離越遠(yuǎn)，且與得分圖樣本分離軸趨勢(shì)一致，則代表變量對(duì)模型的影響越大。圖4 為模型組術(shù)后疲勞大鼠與正常大鼠的PCA 散點(diǎn)負(fù)載圖。

圖3 術(shù)后疲勞模型大鼠與正常大鼠PCA 得分圖Fig.3 The rat of model group and a normal group scord were obtain Principal Component Analysis

PLS-DA 與主成分分析方法不同，它運(yùn)用偏最小二乘回歸方法建立關(guān)系模型實(shí)現(xiàn)代謝物表達(dá)量和樣品類別之間的預(yù)測(cè)，最大程度地反映分類組別之間的差異，同時(shí)通過(guò)計(jì)算VIP 值（變量投影重要度）來(lái)衡量各代謝物表達(dá)模式對(duì)各組樣本分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力，從而輔助代謝標(biāo)志物的篩選（一般以VIP≥1.0 為篩選條件）。本研究所建立模型參數(shù)R2=0.992（表示模型解釋能力），參數(shù)Q2=0.879（表示模型預(yù)測(cè)能力），說(shuō)明模型可靠。如圖5 所示：得分圖上兩組大鼠呈明顯分離趨勢(shì)，表明血漿代謝譜存在明顯差異，根據(jù)VIP值，并結(jié)合PLS-DA 散點(diǎn)負(fù)載圖（圖6）篩選出差異代謝物。

2.4 差異性代謝通路對(duì)定量的代謝物和差異的代謝物進(jìn)行一二級(jí)鑒定結(jié)果注釋，并對(duì)差異的物質(zhì)一級(jí)分子量匹配到的KEGG 編號(hào)進(jìn)行簡(jiǎn)單的差異通路分析。結(jié)果顯示術(shù)后疲勞模型大鼠與正常大鼠相比在色氨酸代謝，戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化，精氨酸和脯氨酸代謝，細(xì)胞色素P450 對(duì)外源化合物代謝的影響，卟啉和葉綠素、葉酸合成、維生素B6、亞油酸代謝等代謝通路存在明顯差異（P＜0.05，表1）。

圖4 術(shù)后疲勞模型大鼠與正常大鼠PCA 散點(diǎn)負(fù)載圖Fig.4 The rat of model group and a normal group PCA scord Scatter load diagram

圖5 術(shù)后疲勞大鼠與正常大鼠PLS-DA 得分圖Fig.5 The rat of model group and a normal group scord were obtain Partial least squares discriminant analysis

圖6 術(shù)后疲勞大鼠與正常大鼠PLS-DA 散點(diǎn)負(fù)載圖Fig.6 The rat of model group and a normal group PLS-DA Scatter load diagram

3 討論

代謝組學(xué)概念首先由NICHOLSON等［8］提出，其核心在于測(cè)定機(jī)體不同狀態(tài)下參與代謝調(diào)控的小分子代謝變化，從而描述生物體對(duì)內(nèi)外各種刺激做出的應(yīng)答規(guī)律，揭示整體生命的動(dòng)態(tài)過(guò)程和調(diào)控規(guī)律。作為一種系統(tǒng)的生物學(xué)研究方法，在疾病診斷、藥理毒理、新藥安全性評(píng)價(jià)、中藥現(xiàn)代化機(jī)理等研究領(lǐng)域得到廣泛運(yùn)用。

本次實(shí)驗(yàn)中，術(shù)后疲勞大鼠與正常大鼠代謝途徑存在明顯差異，色氨酸是一種必需氨基酸，與人體內(nèi)5-HT（5-羥色胺）的代謝密切相關(guān)。腦內(nèi)5-HT 可能是中樞疲勞的調(diào)節(jié)物質(zhì)，其增多可導(dǎo)致中樞疲勞；同時(shí)腦內(nèi)5-HT 水平的升高與長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)性疲勞相關(guān)，在對(duì)運(yùn)動(dòng)性中樞疲勞的研究中使用5-HT 激動(dòng)劑，結(jié)果顯示服用激動(dòng)劑的試驗(yàn)組平均力竭時(shí)間較對(duì)照組短，表明5-HT 對(duì)中樞疲勞具有促進(jìn)作用。血漿中的5-HT 不能通過(guò)血腦屏障，因此必須在腦內(nèi)合成，需要游離色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)至腦內(nèi)，游離色氨酸的增加促進(jìn)5-HT的生成，進(jìn)而引起運(yùn)動(dòng)疲勞［9-10］。精氨酸是一種α-氨基酸，通過(guò)生物酶催化分解生成人體內(nèi)源性一氧化氮（NO），NO 具有舒張血管、改善血液循環(huán)等生物學(xué)功能，研究［11］顯示L-精氨酸體內(nèi)代謝增加NO 水平，通過(guò)降低乳酸積累而產(chǎn)生抗疲勞效果。糖類物質(zhì)作為最基本的供能物質(zhì)，戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化過(guò)程形成的各種中間產(chǎn)物，以及能量供應(yīng)方面的障礙也可能引起疲勞。

表1 術(shù)后疲勞大鼠與正常大鼠差異性代謝通路Tab.7 The rat of model group and a normal group differential metabolic pathways

綜上，中段小腸切除大鼠發(fā)生術(shù)后疲勞的機(jī)制可能與色氨酸、精氨酸、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化等代謝途徑變化引起的腦內(nèi)5-HT 合成增多、血液循環(huán)功能減弱、能量供給障礙相關(guān)。本次實(shí)驗(yàn)使用代謝組學(xué)方法探討中段小腸切除模型大鼠發(fā)生術(shù)后疲勞機(jī)制，補(bǔ)充了現(xiàn)有研究中對(duì)術(shù)后疲勞具體代謝途徑的空白，對(duì)使用該模型進(jìn)行更多的藥物及臨床研究具有理論和實(shí)用意義。由于目前非靶向代謝物的鑒定基于一級(jí)分子量誤差，物質(zhì)的鑒定仍需標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)做靶向代謝物的驗(yàn)證，各代謝物的定性及定量仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究，而各種藥物及促進(jìn)術(shù)后疲勞康復(fù)的干預(yù)措施如何通過(guò)影響代謝途徑取得治療效果是進(jìn)一步研究的方向。