冷星宇 俞勤斐 周凡 沈薇 孟曉靜 吳嫻波 覃旻 范宏英

1南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（廣州510515）；2畢節(jié)市第三人民醫(yī)院（貴州畢節(jié)551500）；3南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院新生兒科（廣州510515）

鉛是一種廣泛存在于生活環(huán)境和職業(yè)環(huán)境中的有毒重金屬［1］，可通過呼吸道、消化道和皮膚等途徑進(jìn)入機(jī)體內(nèi)，損傷神經(jīng)、造血、消化道和生殖等多個(gè)系統(tǒng)［2-6］。而長期暴露于高鉛環(huán)境，將嚴(yán)重影響人體健康，尤其對(duì)兒童的神經(jīng)系統(tǒng)的影響更為顯著［7］。發(fā)育期鉛神經(jīng)毒性的突出特點(diǎn)是鉛暴露可通過胎盤和血腦屏障，影響海馬突觸功能，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能下降［8］。目前，對(duì)于鉛中毒的治療多采用金屬絡(luò)合劑，如依地酸二鈉鈣、2，3-二巰基丁二酸，研究證明，金屬絡(luò)合劑會(huì)產(chǎn)生持續(xù)的胃腸道不良反應(yīng)、“過絡(luò)合綜合征”、肝腎毒性等毒副作用，并且不適用于孕婦、哺乳期婦女及兒童［9-11］。因此，需要尋找新的方法或制劑防治這類人群的鉛中毒。

近年來，利用微生物吸附環(huán)境中有毒、有害物質(zhì)被廣泛關(guān)注并初具成效［12-13］。受此啟發(fā)，國內(nèi)外專家著力開發(fā)腸道益生菌吸附重金屬的潛能。人體腸道益生菌主要包括乳桿菌、雙歧桿菌與部分革蘭陽性球菌等，具有維持腸道穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)免疫功能、抗氧化、抗腫瘤等多種生理功能［14-15］。GIRI等［16］報(bào)道對(duì)鉛暴露的鯉魚給予來源人腸道的羅伊氏乳桿菌P16（Lactobacillus reuteri P16）干預(yù)，可以減少鉛在魚體內(nèi)的蓄積，同時(shí)可改善鉛所致的造血功能紊亂。此外，一項(xiàng)對(duì)坦桑尼亞地區(qū)的孕婦和兒童的干預(yù)研究表明，食用益生菌L.rhamnosus GR-1 發(fā)酵的酸奶可降低孕婦體內(nèi)的汞和砷等有毒重金屬的水平，首次證明乳酸菌能降低人血液中重金屬濃度［17］。

鼠李糖乳桿菌GG株（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）是一株從人類腸道分離的乳桿菌，具有腸道黏附率高，定植力強(qiáng)，能降低體內(nèi)膽固醇水平、調(diào)節(jié)免疫功能等益生功能［18］。但目前還沒有發(fā)現(xiàn)LGG 能否在防治鉛中毒中發(fā)揮作用，為此，本研究通過建立孕期及哺乳期鉛暴露模型，研究LGG 對(duì)仔鼠血液、大腦、骨骼及腎臟中的鉛蓄積的影響，并觀察LGG 對(duì)鉛導(dǎo)致的肝臟氧化、腦部和腸道病理損傷的保護(hù)作用，對(duì)防治發(fā)育期幼兒鉛中毒，促進(jìn)我國兒童健康具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基LGG（ATCC53103）由美國南加州大學(xué)黃勝和教授饋贈(zèng)。37 ℃培養(yǎng)于MRS 培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。

1.2 主要試劑醋酸鉛為分析純，購于生工生物工程（上海）股份有限公司；谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）等檢測(cè)試劑盒，購于南京建成生物工程研究所。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)6 周齡SPF 級(jí)C57BL/6 鼠24 只，其中雄鼠、雌鼠各12 只，購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-0002）。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周（室溫維持在22～25 ℃，晝夜循環(huán)為12 h，普通喂養(yǎng)，飲用無菌水），按雌雄比1∶1 將小鼠隨機(jī)分為4 組，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及處理方法見表1。

表1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及處理Tab.1 Animal experimental protocol

待雌鼠懷孕后，分籠喂養(yǎng)，各組處理方法不變，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。記錄各仔鼠出生時(shí)間，21日齡時(shí)，0.5%戊巴比妥鈉50 mg/100 g 體質(zhì)量麻醉處死，收集全血、胸骨、左股骨、腎、肝、腸和腦，所有樣本保存于固定液或-20 ℃冰箱。本研究獲得南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及監(jiān)督，整個(gè)研究過程符合動(dòng)物倫理學(xué)要求（倫理批準(zhǔn)文號(hào)：L2015029）。

1.4 體質(zhì)量及臟器系數(shù)測(cè)量仔鼠處死前，稱量并記錄各仔鼠體質(zhì)量。腦、肝、腎等臟器取樣后，吸水紙吸干臟器表面水分，稱重，計(jì)算臟器系數(shù)：臟器指數(shù)=器官濕重（mg）/體質(zhì)量（g）。

1.5 組織鉛含量測(cè)定血鉛測(cè)定：10 μL 全血稀釋于990 μL 血液稀釋液（0.1%Triton-×100、1%濃硝酸用去離子水稀釋），震蕩30 s，電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP_MS）法檢測(cè)鉛濃度。檢測(cè)分析條件為：等離子體流15 L/min，霧化氣流速0.8 L/min，輔助氣流速0.2 L/min，RF 功率1 100 W，等離子體觀測(cè)方向?yàn)檩S向，進(jìn)樣流速1.5 mL/min。

組織鉛測(cè)定：骨、腦、腎組織80 ℃烘烤4 h，精確稱取0.05 g；加3 mL 濃硝酸，2 mL 過氧化氫微波消解，設(shè)置消解程序（升溫1∶1 200 W，5 min，120 ℃維持3 min；升溫2∶1 200 W，5 min，150 ℃維持5 min；消化：1 200 W，3 min，180 ℃維持10 min；降溫：15 min）［22］。消解后，去離子水定容至50 mL，同上ICP_MS 法測(cè)鉛濃度：組織鉛濃度（μg/g）=樣本鉛液濃度×50/組織重量。

1.6 氧化應(yīng)激因子檢測(cè)稱取肝臟1.0 g，加入生理鹽水9.0 mL，冰上研磨制成10%的組織勻漿，3 000 r/min 離心10 min，收集上清液。BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各樣本蛋白濃度，按GSH-Px、SOD、NO等試劑盒說明書檢測(cè)各氧化應(yīng)激因子活力。

1.7 小腸、腦組織病理切片取小腸及腦組織于10%多聚甲醛固定2 d，脫水、石蠟包埋后切制成5 μm的切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察小腸及腦的病理變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析法對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理，方差齊時(shí)，采用LSD法進(jìn)行兩兩比較；方差不齊時(shí)，采用SNK 法進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子代鼠體質(zhì)量、臟器系數(shù)測(cè)定子代鼠體質(zhì)量及臟器系數(shù)，結(jié)果顯示（圖1），Pb 組子代鼠體質(zhì)量與肝、腦的臟器系數(shù)均低于NC 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），腎的臟器系數(shù)高于NC 組（P＜0.05）；與Pb 組相比，LGG.Pb 組的體質(zhì)量、肝、腦的臟器系數(shù)升高（P＜0.05），說明LGG 干預(yù)鉛暴露母鼠可改善子代鼠體質(zhì)量減輕及鉛對(duì)肝、腦等重要器官的綜合損傷作用。

2.2 子代鼠各組織鉛濃度檢測(cè)子代鼠血鉛、腦鉛、骨鉛和腎鉛濃度，結(jié)果顯示（圖2），與NC 組相比，Pb 組子代鼠的血鉛、腦鉛、骨鉛、腎鉛濃度均顯著升高（P＜0.05）；LGG.Pb 組子代鼠的血鉛、腦鉛、骨鉛、腎鉛濃度降低（P＜0.05），說明LGG 干預(yù)鉛暴露母鼠可減少鉛在子代鼠血、腦、骨和腎等組織器官的蓄積。

圖1 各組子代鼠體質(zhì)量與重要臟器系數(shù)Fig.1 The weight and the organ coefficient of offspring

圖2 各組子代鼠組織器官鉛濃度Fig.2 The concentration of Pb in offspring′s tissues or organs

2.3 肝臟氧化應(yīng)激相關(guān)因子活性檢測(cè)子代鼠肝臟氧化應(yīng)激水平，結(jié)果顯示（圖3），與NC 組相比，Pb 組子代鼠肝臟中GSH、GSH-Px、SOD等活性降低、NO 水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與Pb 組相比，LGG.Pb 組子代鼠GSH、GSH-Px 及SOD 活性升高（P＜0.05），而NO 水平降低（P＜0.05）。說明LGG 干預(yù)鉛暴露母鼠可增強(qiáng)子代鼠肝臟的抗氧化酶活性，降低鉛所致的氧化應(yīng)激分子水平，以減輕鉛中毒所致的氧化應(yīng)激損傷。

2.4 腸組織病理結(jié)果對(duì)子代鼠小腸進(jìn)行HE 染色，結(jié)果顯示（圖4），Pb 組子代鼠小腸病理損傷嚴(yán)重，腸上皮細(xì)胞的標(biāo)志性空泡消失、排列疏松，胞核移動(dòng)至胞質(zhì)中間，無極性；杯狀細(xì)胞體積變小、數(shù)量減少；小腸腺萎縮；中央乳糜管變窄甚至消失。LGG.Pb 組小腸的病理損傷減輕，腸上皮細(xì)胞排列緊密，胞核極性正常；杯狀細(xì)胞及中央乳糜管形態(tài)恢復(fù)正常。提示LGG 干預(yù)后，母鼠鉛暴露致鉛中毒子代鼠的小腸病理損傷得到有效改善。

圖3 各組子代鼠肝臟氧化應(yīng)激相關(guān)因子活性Fig.3 The activities of oxidative stress related factors in offspring′s liver

圖4 各組子代鼠小腸的HE 染色（×200）Fig.4 The HE staining of offspring′s small intestine（×200）

2.5 腦組織病理結(jié)果對(duì)子代鼠腦組織進(jìn)行HE染色，結(jié)果顯示（圖5），Pb 組子代鼠大腦皮層有明顯的病理損傷：出現(xiàn)彌漫性神經(jīng)元固縮、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生水腫等病理損傷，并有不同程度的神經(jīng)元壞死現(xiàn)象。LGG.Pb 組的病理損傷有所恢復(fù)，大腦皮層細(xì)胞排列緊密，小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、水腫情況明顯減少，少有神經(jīng)元細(xì)胞壞死。說明，LGG 干預(yù)鉛暴露母鼠可緩解子代鼠大腦皮層的病理損傷。

圖5 各組子代鼠大腦的HE 染色（×100，×400）Fig.5 The HE staining of offspring′s brain（×100，×400）

3 討論

鉛是一種穩(wěn)定的重金屬，由于其特殊的理化性質(zhì)，廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代工業(yè)，同時(shí)也是大部分化妝品、日用品不可缺少的成分［2，4］。人們通過各種途徑接觸鉛，經(jīng)口攝入并由胃腸道暴露鉛是目前生活環(huán)境中慢性鉛中毒的主要途徑之一［23］。大量研究表明，鉛可引起人體多個(gè)系統(tǒng)損傷并造成遠(yuǎn)期影響，但孕期至哺乳期婦女暴露鉛會(huì)引起嬰兒何種變化至今鮮有報(bào)道［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，母鼠經(jīng)飲水進(jìn)行鉛暴露，子代鼠的大腦、骨骼和腎臟等重要組織的鉛水平均升高，且血鉛水平達(dá)到600 μg/L以上（圖1），說明孕期及哺乳期母鼠鉛暴露可導(dǎo)致子代小鼠發(fā)生鉛中毒。

益生菌能定植于人體腸道并產(chǎn)生確切的健康效益，借鑒利用微生物吸附環(huán)境有害物質(zhì)的經(jīng)驗(yàn)［12-13］，國內(nèi)外研究人員廣泛關(guān)注其吸附重金屬的潛能，TEEMU等［21］發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌GG 具有吸附污水中鉛、鎘、汞等有毒重金屬的能力。本研究在上述動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，使用109CFU的LGG 對(duì)母鼠進(jìn)行灌胃干預(yù)，探討LGG 對(duì)母鼠暴露鉛致子代鼠鉛中毒的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，經(jīng)LGG 干預(yù)鉛暴露母鼠后，鉛中毒子代鼠體質(zhì)量及肝、腦的臟器指數(shù)升高（圖1），血鉛、腦鉛、骨鉛和腎鉛等組織鉛濃度降低（圖2），表明LGG 干預(yù)鉛暴露母鼠能通過降低鉛在子代鼠體內(nèi)的蓄積量來減輕鉛對(duì)子代鼠的綜合毒性。

研究報(bào)道，鉛進(jìn)入機(jī)體后通過與GSH、GSHPx、SOD等酶分子中-SH 及其活性中心金屬離子作用，使這些抗氧化酶的活力下降［19］。與既往研究相同，本研究結(jié)果顯示鉛中毒子代鼠肝臟內(nèi)抗氧化酶GSH、GSH-Px、SOD的活性降低，NO的水平升高（圖3）。但經(jīng)LGG 干預(yù)鉛暴露母鼠后，鉛中毒子代鼠肝臟抗氧化酶的活性恢復(fù)甚至有所提高，同時(shí)NO 活性降低，提示LGG 對(duì)鉛致子代鼠肝臟的氧化損傷有抑制作用，從而保護(hù)子代鼠肝臟的健康。MAJLESI等［25］將L.plantarum CNR273和B.coagulans 用于汞中毒小鼠模型，也得到相同結(jié)果，即小鼠血液及肝、腎等靶器官的汞蓄積量減少，且汞導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷減輕。此外，經(jīng)口攝入是鉛主要的暴露途徑，胃腸道是鉛進(jìn)入機(jī)體的第一道防線［1］。本研究病理結(jié)果顯示，母鼠鉛暴露致鉛中毒子代鼠的小腸出現(xiàn)絨毛空泡消失、小腸腺萎縮等病理損傷（圖4）。有研究指出，經(jīng)消化道暴露鉛會(huì)使腸屏障受到破壞，同時(shí)血腦屏障也會(huì)被損傷，進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)性相關(guān)疾?。?6］。大腦是鉛的重要的靶器官，血鉛水平與鉛在腦的蓄積量緊密相關(guān)，而鉛在腦的蓄積量決定了腦損傷的嚴(yán)重程度［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，母鼠鉛暴露致鉛中毒子代鼠大腦發(fā)生以神經(jīng)元萎縮、死亡為主的病理變化。經(jīng)LGG 干預(yù)鉛暴露母鼠后，鉛中毒子代鼠小腸和大腦皮層的病理損傷得到有效的改善，表明LGG 干預(yù)母鼠能保護(hù)子代鼠小腸和大腦正常的生理結(jié)構(gòu)免受鉛的破壞。

綜上，孕期及哺乳期母鼠鉛暴露后可引起子代鼠鉛中毒，使用LGG 干預(yù)鉛暴露母鼠可減少鉛在子代小鼠血液、骨骼、腦及腎臟中的蓄積，同時(shí)增強(qiáng)肝臟的抗氧化酶活力，并改善鉛致小腸及腦的病理損傷，本研究為防治孕期及哺乳期鉛暴露引起的子代鉛中毒提供了一個(gè)新思路。LGG 防治母鼠暴露鉛致子代鼠鉛中毒的機(jī)制需進(jìn)一步研究。