黃 丹，劉東超，王曉梁，林 挺，黃曉健，歐陽(yáng)兆攀

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不同溫度下長(zhǎng)莖葡萄蕨藻無(wú)機(jī)碳利用

黃 丹1,2，劉東超1,2，王曉梁1,2，林 挺1，黃曉健1，歐陽(yáng)兆攀1

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 / 2. 廣東省藻類(lèi)養(yǎng)殖與應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088）

【】闡明長(zhǎng)莖葡萄蕨藻對(duì)無(wú)機(jī)碳的利用方式。運(yùn)用pH漂移技術(shù)，探索藻體質(zhì)量、藻體部位、照度和海水體積對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻（）的pH補(bǔ)償點(diǎn)的影響，并研究在3種不同溫度（20、25、30 ℃）下，乙酰唑胺（AZ）、乙氧苯丙噻唑磺胺（EZ）、4,4′-二異硫氰基芪2,2′-二磺酸（DIDS）、釩酸鹽（Van）4種抑制劑對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻無(wú)機(jī)碳的利用影響。藻體質(zhì)量、藻體部位、照度和海水體積對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的pH補(bǔ)償點(diǎn)均無(wú)顯著性影響（> 0.05），在一定范圍內(nèi)藻體質(zhì)量或照度越大，達(dá)到pH補(bǔ)償點(diǎn)時(shí)間越短，且pH補(bǔ)償點(diǎn)均大于9。20 ℃下各抑制劑的抑制作用最大，其次為30 ℃，25 ℃最小，但3種溫度下各抑制劑的抑制率無(wú)顯著差別（> 0.05）。4種抑制劑中DIDS對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻pH補(bǔ)償點(diǎn)和無(wú)機(jī)碳利用均無(wú)顯著影響（> 0.05），剩余3種抑制劑的抑制作用依次為EZ> AZ >Van。藻體質(zhì)量、藻體部位、照度和海水體積對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻pH補(bǔ)償點(diǎn)無(wú)影響。溫度對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻吸收利用無(wú)機(jī)碳沒(méi)有明顯影響。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻能利用HCO3-作為無(wú)機(jī)碳源進(jìn)行光合作用。

長(zhǎng)莖葡萄蕨藻；pH補(bǔ)償點(diǎn)；無(wú)機(jī)碳利用；溫度；抑制劑

長(zhǎng)莖葡萄蕨藻（），隸屬蕨藻科（Caulerpaceae），蕨藻屬（），又名“海葡萄”“綠色魚(yú)子醬”[1]，是一種高蛋白、高纖維、低脂肪，且富含礦物質(zhì)的食用綠藻[2-5]。其藻體內(nèi)含有具較強(qiáng)抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗癌和治療痛風(fēng)、糖尿病、肥胖癥作用的多糖、蕨藻倍半萜、蕨藻紅素等活性物質(zhì)[6-8]，其干藻粉有吸附銅、鎘、鉛等重金屬和廢水中堿性染料的作用[9-10]，其在生態(tài)混合養(yǎng)殖中還可有效去除養(yǎng)殖水體中的氨氮起到凈化水質(zhì)的作用[11-13]。因此，對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的研究主要集中在營(yíng)養(yǎng)成分[2-5]、養(yǎng)殖技術(shù)[14-17]、凈化水質(zhì)[11-13]等方面，但有關(guān)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻無(wú)機(jī)碳的利用途徑的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

開(kāi)展長(zhǎng)莖葡萄蕨藻對(duì)無(wú)機(jī)碳的利用研究是深入認(rèn)識(shí)其光合生理機(jī)制和提高養(yǎng)殖產(chǎn)量的基礎(chǔ)。在較高pH（約8.0~8.2）和高鹽度（約35）的天然海水中，溶解的無(wú)機(jī)碳（DIC）主要以HCO3-為主，約占90%，游離的CO2極少，而CO32-不能直接被利用[18-20]。為了克服低CO2環(huán)境的限制，許多大型海藻逐漸形成了利用HCO3-以提高細(xì)胞內(nèi)的CO2濃度的碳濃縮機(jī)制（CCM）[19, 21-23]。研究表明，大多數(shù)大型海藻能通過(guò)以下3種途徑利用HCO3-作為無(wú)機(jī)碳源進(jìn)行光合作用：胞外碳酸酐酶（CA）催化的HCO3-利用（此過(guò)程可被胞外碳酸酐酶抑制劑AZ所抑制）[24]；通過(guò)陰離子交換蛋白直接轉(zhuǎn)運(yùn)HCO3-（此過(guò)程可被陰離子交換蛋白抑制劑DIDS所抑制）[20, 25]；依賴(lài)于質(zhì)膜P型H+- ATP酶的HCO3-主動(dòng)運(yùn)輸（此過(guò)程可被膜ATP酶抑制劑Van所抑制）[26-27]。進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的HCO3-必須在胞質(zhì)CA或葉綠體CA的作用下轉(zhuǎn)化成CO2才能參與核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶（Rubisco）所催化的光合作用的碳固定反應(yīng)（此過(guò)程可被抑制劑EZ所抑制）[26]。由于HCO3-的利用能被不同的抑制劑所抑制，因此添加抑制劑被廣泛的應(yīng)用于海藻無(wú)機(jī)碳利用途徑的研究中。

在封閉系統(tǒng)中測(cè)量pH補(bǔ)償點(diǎn)在一定程度上能反映藻類(lèi)對(duì)無(wú)機(jī)碳的利用。目前眾多學(xué)者運(yùn)用pH漂移技術(shù)測(cè)定pH補(bǔ)償點(diǎn)的方法來(lái)研究藻類(lèi)對(duì)無(wú)機(jī)碳的利用，但其所用到的藻體質(zhì)量、海水體積以及照度不一致[19, 24-26, 28-33]，而上述因素是否會(huì)影響pH補(bǔ)償點(diǎn)的測(cè)定，目前相關(guān)報(bào)道較少，僅岳國(guó)峰等[34]研究了材料用量和照度對(duì)煙雜一號(hào)海帶（×）幼孢子體pH補(bǔ)償點(diǎn)的影響。同時(shí)，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻藻體由直立枝、匍匐莖以及假根3部分組成，不同的藻體部位是否會(huì)影響補(bǔ)償點(diǎn)的測(cè)定，尚不清楚。研究表明，不同的藻類(lèi)對(duì)無(wú)機(jī)碳的利用途徑不同，同一種藻在不同溫度條件下其無(wú)機(jī)碳利用方式亦不同，且溫度對(duì)大型海藻無(wú)機(jī)碳利用途徑的影響具有較大的種間差異性[19]。

本研究通過(guò)分析藻體質(zhì)量、藻體部位以及照度和海水體積對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的pH補(bǔ)償點(diǎn)的影響，研究在不同溫度下利用4種抑制劑對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻光合作用中無(wú)機(jī)碳的利用，旨在闡明長(zhǎng)莖葡萄蕨藻對(duì)無(wú)機(jī)碳的利用能力及可能的利用方式，以期為長(zhǎng)莖葡萄蕨藻養(yǎng)殖過(guò)程中外源無(wú)機(jī)碳的添加提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用長(zhǎng)莖葡萄蕨藻購(gòu)自深圳市藍(lán)汀鼎執(zhí)生物科技有限公司，培養(yǎng)于廣東海洋大學(xué)藻類(lèi)實(shí)驗(yàn)室。培養(yǎng)條件：溫度為（26 ± 1）℃，照度為2 000~5 000 lx，光暗周期為12∶12，連續(xù)充氣培養(yǎng)；培養(yǎng)液為添加NaNO30.5 mmol?L-1、KH2PO40.1 mmol?L-1，鹽度為（32 ± 1），pH為7.8~8.2的消毒海水；實(shí)驗(yàn)前挑選健康的、表面無(wú)雜藻的藻體，用消毒海水沖洗3遍，再用滅菌的解剖剪剪下一定數(shù)量的直立枝和匍匐莖暫養(yǎng)恢復(fù)一天，選擇暫養(yǎng)后情況較好的藻體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藻體質(zhì)量、藻體部位、照度以及海水體積對(duì)pH補(bǔ)償點(diǎn)的影響

利用pH漂移技術(shù)測(cè)定pH補(bǔ)償點(diǎn)，按照表1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將不同質(zhì)量、部位的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻藻體置于50 mL透明玻璃小瓶中，用瓶蓋密封，放于25 ℃光照培養(yǎng)箱連續(xù)光照培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。每隔2 h采用pH計(jì)測(cè)定pH，pH計(jì)使用前用pH校正液校準(zhǔn)，pH增加不超過(guò)0.01時(shí)停止測(cè)定，此時(shí)的pH值為藻體在該條件下的pH補(bǔ)償點(diǎn)，這段時(shí)間內(nèi)pH的變化曲線稱(chēng)為pH漂移曲線[35]。B組為對(duì)照組，A、C、D、E組分別研究海水體積、藻體部位、藻體質(zhì)量、照度對(duì)pH補(bǔ)償點(diǎn)的影響。

表1 藻體質(zhì)量、藻體部位、照度以及海水體積對(duì)pH補(bǔ)償點(diǎn)影響實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 不同溫度下抑制劑對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻無(wú)機(jī)碳利用的影響

稱(chēng)取長(zhǎng)莖葡萄蕨藻直立枝約1.0 g（鮮重FW）置于含200 mL消毒海水的250 mL錐形瓶中，分別加入胞外碳酸酐酶抑制劑——乙酰唑胺（AZ）、胞外和胞內(nèi)碳酸酐酶抑制劑——乙氧苯丙噻唑磺胺（EZ）（AZ、EZ均用 0.05 mol?L-1NaOH溶液配制成 20 mmol?L-1的原液）、陰離子交換蛋白抑制劑——4,4′-二異硫氰基芪2,2′-二磺酸（DIDS）、ATP酶抑制劑——釩酸鹽（原釩酸鈉，Van），參照王吉等[26]研究確定AZ、EZ、Van 3種抑制劑的最終濃度分別為100、100、500 μmol?L-1，參照程苗等[25]研究確定抑制劑DIDS的最終濃度為300 μmol?L-1。最后用0.1 mol?L-1NaOH溶液或0.1 mol?L-1HCl溶液將各組溶液pH調(diào)成與未加抑制劑的對(duì)照組一致，封口膜密封。每組設(shè)置3個(gè)平行，分別置于溫度為20、25、30 ℃，照度為2 000 lx的光照培養(yǎng)箱中持續(xù)光照培養(yǎng)。抑制劑AZ、EZ、DIDS均購(gòu)自Sigma公司，抑制劑Van購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 總堿度測(cè)定及無(wú)機(jī)碳濃度、無(wú)機(jī)碳利用量抑制率的計(jì)算

每隔3 h測(cè)定pH，pH增加不超過(guò)0.01時(shí)停止測(cè)定，并在測(cè)定pH后取20 mL培養(yǎng)液測(cè)定總堿度，總堿度測(cè)定5次。采用 pH 法（GB/T 12763.4— 2007）測(cè)定總堿度（TA）。根據(jù)pH、溫度、鹽度和總堿度值，使用由MILLERO等[36]確定的碳酸解離常數(shù)和DICKSON[37]發(fā)表的HSO4-解離常數(shù)，運(yùn)用CO2SYS 軟件[38]計(jì)算無(wú)機(jī)碳（DIC）濃度。并計(jì)算12 h內(nèi)無(wú)機(jī)碳利用量以及抑制劑對(duì)無(wú)機(jī)碳利用量的抑制率[39]。

抑制率=（對(duì)照組DIC的利用量-抑制劑組DIC的利用量）/ 對(duì)照組DIC的利用量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

所得測(cè)定結(jié)果均表示為平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差（≥ 3）。用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著者利用Tukey進(jìn)行多重比較，以< 0.05作為差異的顯著性水平。用GraphPad Prism 7.00軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 藻體質(zhì)量、藻體部位、照度以及海水體積對(duì)pH補(bǔ)償點(diǎn)的影響

由表1、2可知5個(gè)處理組最終在不同的時(shí)間內(nèi)均達(dá)到了基本相同的pH補(bǔ)償點(diǎn)，且均大于9。A、C、D、E組分別與B組比較得到海水體積、藻體部位、藻體質(zhì)量、照度均對(duì)pH補(bǔ)償點(diǎn)無(wú)顯著性影響（> 0.05）。D組藻質(zhì)量0.8 g，達(dá)到pH補(bǔ)償點(diǎn)的時(shí)間為26 h，E組照度為4 000 lx達(dá)到pH補(bǔ)償點(diǎn)的時(shí)間為28 h，而B(niǎo)組藻質(zhì)量0.4 g、照度2 000 lx則需要30 h，表明在一定范圍內(nèi)藻體質(zhì)量越大或照度越強(qiáng)，達(dá)到pH補(bǔ)償點(diǎn)時(shí)間越短。A、C兩組與B組達(dá)到pH補(bǔ)償點(diǎn)的時(shí)間一致，表明海水體積與藻體部位對(duì)達(dá)到pH補(bǔ)償點(diǎn)的時(shí)間無(wú)影響。

表2 藻體質(zhì)量、藻體部位、照度以及海水體積對(duì)pH補(bǔ)償點(diǎn)的影響

注：同一列中字母不同表示差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）

Note：The difference of letters in the same column was statistically significant （< 0.05）

圖1 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻不同處理組的pH漂移曲線

2.2 不同溫度下抑制劑對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻無(wú)機(jī)碳利用的影響

2.2.1 不同溫度下抑制劑對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻培養(yǎng)體系pH的影響 從圖2 a-c可見(jiàn)，除了30 ℃添加Van組在30 h后pH降低，其余處理組在20、25、30 ℃持續(xù)光照的密閉條件下pH變化趨勢(shì)大體一致，30 h基本達(dá)到平緩，直至達(dá)到pH補(bǔ)償點(diǎn)。較其它組而言，對(duì)照組pH值上升速度最快，pH補(bǔ)償點(diǎn)最高，在20、25、30 ℃的pH補(bǔ)償點(diǎn)分別為9.02、9.27、9.06。DIDS處理組的pH補(bǔ)償點(diǎn)在20、25、30 ℃下分別為8.99、9.26、9.02，比對(duì)照組低（> 0.05）。其次為添加Van組，在20、25、30 ℃下pH補(bǔ)償點(diǎn)分別為8.66、8.86、8.52，顯著低于對(duì)照組和DIDS處理組（< 0.05）。由于30 ℃添加Van組30 h后有部分藻體腐爛，因此出現(xiàn)pH下降趨勢(shì)。除了30 ℃下Van處理組與AZ處理組的pH補(bǔ)償點(diǎn)無(wú)顯著差異（> 0.05），其余溫度下Van處理組的pH補(bǔ)償點(diǎn)明顯高于AZ和EZ處理組（< 0.05）。其中EZ處理組的pH值上升最少，pH補(bǔ)償點(diǎn)最低，分別為8.26（20 ℃）、8.46（25 ℃）、8.37（30 ℃），并明顯低于AZ處理組的pH補(bǔ)償點(diǎn)8.54（20、30 ℃）、8.78（25 ℃）（< 0.05）?？梢?jiàn)，DIDS基本無(wú)抑制作用，AZ、EZ、Van分別有不同程度的抑制作用，其中EZ抑制效果最明顯，AZ次之，Van最差。

3個(gè)溫度中25 ℃培養(yǎng)條件下各組的pH補(bǔ)償點(diǎn)最高，并顯著高于20 ℃和30 ℃的pH補(bǔ)償點(diǎn)（< 0.05）。除了20 ℃Van處理組的pH補(bǔ)償點(diǎn)顯著高于30 ℃外（< 0.05），其余各組均低于30 ℃，除了EZ處理組有顯著差異外（< 0.05），剩下的3組均無(wú)顯著差異（> 0.05）（圖2-d）。

2.2.2 不同溫度下抑制劑對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻培養(yǎng)體系無(wú)機(jī)碳DIC的影響 連續(xù)光照培養(yǎng)下，隨著長(zhǎng)莖葡萄蕨藻光合作用的進(jìn)行，密閉系統(tǒng)中無(wú)機(jī)碳濃度逐漸降低。不同溫度和不同抑制劑處理對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻DIC吸收的影響不同，但在不同溫度下大體變化趨勢(shì)一致（圖3 a-c），并且在前6 h無(wú)機(jī)碳吸收利用的較多。未添加抑制劑的對(duì)照組DIC降低最快，吸收利用無(wú)機(jī)碳的能力最強(qiáng)。其次為添加DIDS組，添加AZ組雖較添加Van組的DIC濃度高，但二者均比EZ組低，EZ 是4種抑制劑中對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻無(wú)機(jī)碳吸收抑制效果最強(qiáng)的。5組利用無(wú)機(jī)碳的能力從大到小依次為對(duì)照組> DIDS > Van > AZ > EZ。

從圖3-d可見(jiàn)，培養(yǎng)6 h后長(zhǎng)莖葡萄蕨藻在25 ℃對(duì)DIC的吸收利用量最大，對(duì)照組、AZ、EZ、Van、DIDS處理組的無(wú)機(jī)碳利用量分別為370.93、180.07、126.74、245.07、362.74 μmol?kg-1。降低（20 ℃）或升高溫度（30 ℃）條件下，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的DIC利用量均有所下降，且30 ℃下DIC利用量下降更多，但20、30與25 ℃的DIC利用量無(wú)顯著差異（> 0.05）。

a、b、c表示20、25、30 ℃；d：pH補(bǔ)償點(diǎn)；不同的大寫(xiě)字母表示相同溫度下不同處理間具有顯著性差異（P < 0.05）；不同的小寫(xiě)字母表示不同溫度下相同處理之間具有顯著性差異（P < 0.05）

a、b、c表示20、25、30 ℃；d：長(zhǎng)莖葡萄蕨藻培養(yǎng)6 h后DIC的利用量；不同的大寫(xiě)字母表示相同溫度下不同處理間具有顯著性差異（P < 0.05）；不同的小寫(xiě)字母表示不同溫度下相同處理之間具有顯著性差異（P < 0.05）

2.2.3 不同溫度下抑制劑對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻無(wú)機(jī)碳利用抑制率的影響 在3種溫度條件下培養(yǎng)6 h后，DIDS的抑制率分別為0.51%（20 ℃）、2.21%（25 ℃）、0.72% （30 ℃），基本上認(rèn)為無(wú)抑制作用，說(shuō)明長(zhǎng)莖葡萄蕨藻不能通過(guò)陰離子交換蛋白機(jī)制直接吸收海水中的HCO3-。由圖4可知，胞外碳酸酐酶抑制劑AZ、胞內(nèi)胞外碳酸酐酶抑制劑EZ和ATP酶抑制劑Van對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻無(wú)機(jī)碳的利用具有不同程度的抑制作用，抑制率分別為62.13%、 72.85%和41.19% （20 ℃），51.45%、65.83%和33.93% （25 ℃），55.95%、68.92%和49.81% （30 ℃），抑制作用從大到小依次為：EZ>AZ >Van。但3種溫度下，AZ和EZ的抑制作用無(wú)顯著差異（> 0.05），除30 ℃外均與Van有顯著性差異（< 0.05）。

不同的大寫(xiě)表示相同溫度下不同處理之間具有顯著性差異（P < 0.05）；小寫(xiě)字母表示不同溫度下相同處理之間具有顯著性差異（P < 0.05）

在3種實(shí)驗(yàn)溫度下，20 ℃時(shí)各抑制劑的抑制作用最大，其次為30 ℃，25 ℃最小，但此3種溫度下各抑制劑的抑制率均無(wú)顯著差別（> 0.05），說(shuō)明3種溫度對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻吸收利用無(wú)機(jī)碳沒(méi)有明顯影響，但20 ℃和30 ℃抑制作用都比25 ℃大，說(shuō)明25 ℃是較適宜長(zhǎng)莖葡萄蕨藻生長(zhǎng)和進(jìn)行光合作用的溫度，且溫度變化并不改變長(zhǎng)莖葡萄蕨藻利用HCO3-的方式。

3 討論

3.1 藻體質(zhì)量、藻體部位、照度以及海水體積對(duì)pH補(bǔ)償點(diǎn)的影響

海水體積、藻體部位、藻體質(zhì)量、照度均對(duì)pH補(bǔ)償點(diǎn)無(wú)顯著性影響（> 0.05），但藻體質(zhì)量和照度會(huì)影響達(dá)到pH補(bǔ)償點(diǎn)的時(shí)間，在一定范圍內(nèi)藻體質(zhì)量越大或照度越強(qiáng)，達(dá)到pH補(bǔ)償點(diǎn)時(shí)間越短。所以，可以通過(guò)適當(dāng)增加藻體質(zhì)量或提高照度來(lái)縮短達(dá)到pH補(bǔ)償點(diǎn)的時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與岳國(guó)峰等[34]的研究結(jié)論一致。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的直立枝與匍匐莖作為實(shí)驗(yàn)材料均對(duì)pH補(bǔ)償點(diǎn)的測(cè)定無(wú)影響，因此可考慮將生長(zhǎng)較快的匍匐莖作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)材料。

3.2 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻無(wú)機(jī)碳的利用

在封閉系統(tǒng)中，海藻消耗溶解的DIC導(dǎo)致水體pH上升，測(cè)量pH補(bǔ)償點(diǎn)在一定程度上能反映藻類(lèi)對(duì)無(wú)機(jī)碳的利用。研究表明，可利用HCO3-進(jìn)行光合作用的藻類(lèi)pH補(bǔ)償點(diǎn)一般都大于9.0[19, 30, 35]。在pH為9左右時(shí)，只以CO2為碳源的藻類(lèi)無(wú)法通過(guò)利用 HCO3-來(lái)進(jìn)一步提高pH值，相反如果藻類(lèi)能夠利用HCO3-，pH補(bǔ)償點(diǎn)可以達(dá)到相當(dāng)高的值[40]。在實(shí)驗(yàn)的3種溫度下（20、25、30 ℃），未添加抑制劑的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻pH補(bǔ)償點(diǎn)均大于9，表明長(zhǎng)莖葡萄蕨藻能利用HCO3-進(jìn)行光合作用。

在實(shí)驗(yàn)3種溫度條件下，DIDS對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻pH補(bǔ)償點(diǎn)和無(wú)機(jī)碳利用均無(wú)顯著影響（> 0.05），表明長(zhǎng)莖葡萄蕨藻不能通過(guò)陰離子交換蛋白直接吸收海水中的HCO3-。CARLBERG等[41]研究發(fā)現(xiàn)刺松藻（）也不能通過(guò)陰離子交換蛋白機(jī)制直接吸收海水中的HCO3-。這可能與長(zhǎng)莖葡萄蕨藻和刺松藻在細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的類(lèi)似有關(guān)，二者均沒(méi)有形成這種HCO3-的利用機(jī)制，而腸滸苔 () 等多數(shù)綠藻一般具有能被DIDS抑制的高pH誘導(dǎo)的直接吸收海水中的HCO3-的光合作用的特征[42-43]。大型綠藻HCO3-直接吸收機(jī)制與環(huán)境條件有關(guān)，在高光強(qiáng)、高pH及富營(yíng)養(yǎng)的海水條件下或在AZ存在下生長(zhǎng)的藻類(lèi)可誘導(dǎo)出陰離子交換蛋白協(xié)助的HCO3-直接吸收（即DIDS敏感機(jī)制的HCO3-吸收）[27, 42]。因此，對(duì)于長(zhǎng)莖葡萄蕨藻在其它條件下是否存在陰離子交換蛋白協(xié)助的HCO3-直接吸收途徑有待進(jìn)一步研究。

在不同溫度條件下，3種抑制劑的抑制效果強(qiáng)弱為EZ＞AZ＞Van，說(shuō)明長(zhǎng)莖葡萄蕨藻可以通過(guò)胞外CA間接利用HCO3-。此途徑也是絕大多數(shù)大型海藻如綠藻中的石莼（）[44]、緣管滸苔（）[19]和滸苔（）[28]以及腸滸苔（）[42]，紅藻中的壇紫菜（）[24]、菊花心江蘺（)[45]、龍須菜（）[46]、舌狀蜈蚣藻（）[32]及褐藻裙帶菜（）[31]、宣藻（）[26]、海黍子（Yendo）[25]、羊棲菜（）[47]等利用無(wú)機(jī)碳的最普遍和最基本的方式。此外，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻還存在依賴(lài)ATP酶主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)HCO3-的利用途徑。綠藻中的剛毛藻（）[48]、褐藻中的萱藻絲狀體[26]以及掌狀海帶（）和糖海帶（）[27]也發(fā)現(xiàn)此HCO3-利用途徑，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。EZ和AZ的抑制作用統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著差異（> 0.05），此研究結(jié)果與程苗等[25]對(duì)海黍子的研究結(jié)果一致。造成這一結(jié)果的原因可能是EZ抑制胞外CA活性導(dǎo)致進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的無(wú)機(jī)碳減少，使得EZ對(duì)胞外CA的抑制效果遮蓋了其對(duì)胞內(nèi)CA的抑制效果[25]。綜上，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻能利用HCO3-作為無(wú)機(jī)碳源進(jìn)行光合作用，且對(duì)HCO3-的利用方式有兩種：1）通過(guò)胞外碳酸酐酶（CA）催化HCO3-水解為CO2，CO2擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞的間接吸收利用方式；2）依賴(lài)細(xì)胞膜上ATP酶主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)HCO3-，再由胞內(nèi)CA水解為CO2的直接利用途徑。由于Van的抑制效果最差，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻主要以方式1）利用HCO3-。

在3種實(shí)驗(yàn)溫度條件下，20 ℃下各抑制劑的抑制作用最大，其次為30 ℃，25 ℃最小，但3者抑制率無(wú)顯著差別（> 0.05），這表明溫度對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻吸收利用無(wú)機(jī)碳沒(méi)有明顯影響，但低溫或高溫均會(huì)降低長(zhǎng)莖葡萄蕨藻對(duì)無(wú)機(jī)碳的吸收利用。25 ℃是較適宜長(zhǎng)莖葡萄蕨藻生長(zhǎng)和進(jìn)行光合作用的溫度，溫度變化并沒(méi)有改變長(zhǎng)莖葡萄蕨藻利用HCO3-的方式。徐軍田等[19]研究溫度（5、10、15、20、25 和 30℃）對(duì)兩種滸苔無(wú)機(jī)碳利用機(jī)制的影響，得出兩種滸苔在不同溫度下無(wú)機(jī)碳的轉(zhuǎn)運(yùn)方式不同，且存在著明顯的種間差異，但滸苔在溫度為10~30 ℃時(shí)無(wú)機(jī)碳利用方式相同。本研究結(jié)果與其相似，這可能是因?yàn)闇囟茸兓瘜?duì)參與長(zhǎng)莖葡萄蕨藻光合作用過(guò)程的各種酶活性影響不大，因此在20~30 ℃長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的無(wú)機(jī)碳利用方式相同。

4 結(jié)論

海水體積、藻體部位、藻體質(zhì)量和照度均對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的pH補(bǔ)償點(diǎn)無(wú)影響，但藻體質(zhì)量和照度會(huì)影響達(dá)到pH補(bǔ)償點(diǎn)的時(shí)間，在一定范圍內(nèi)藻體質(zhì)量越大或照度越強(qiáng)，達(dá)到pH補(bǔ)償點(diǎn)時(shí)間越短。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻除了可以利用海水中的游離CO2外，還能利用HCO3-作為無(wú)機(jī)碳源進(jìn)行光合作用。溫度（20~30 ℃）對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻吸收利用無(wú)機(jī)碳沒(méi)有明顯影響，且3種溫度下長(zhǎng)莖葡萄蕨藻無(wú)機(jī)碳的利用方式相同。

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Utilization of Inorganic Carbon ofunder Different Temperature

HUANG Dan1,2, LIU Dong-chao1,2, WANG Xiao-liang1,2, LIN Ting1, HUANG Xiao-jian1, OUYANG Zhao-pan1

（1./ 2.,524088,）

【】To evaluate the utilization of inorganic carbon by.【】The effects of algal weight, algal body parts, irradiance and seawater volume on pH compensation point were explored by using the pH drift technology, and the effects of four inhibitors acetazolamide（AZ）, 6-ethoxyzolamide（EZ）, 4,4'-diisothiocyano- stilbene-2,2'-disulfonate（DIDS）, vanadate（Van）on the utilization of inorganic carbon inunder three different temperatures （20 , 25, 30 ℃）were analyzed.【】The results showed that algae weight, algal body parts, irradiance, and seawater volume had no significant effect on the pH compensation points（> 0.05）. The greater the weight of the algae or the greater the irradiance within a certain range, the shorter the time required to reach the pH compensation point which is greater than the pH compensation point 9. The inhibitory effect of each inhibitor was highest at 20 ℃, followed by 30 ℃ and 25 ℃, but there was no significant difference between the inhibitors at different temperatures（> 0.05）. Among the four inhibitors, DIDS had no significant effect on the pH compensation point and inorganic carbon utilization of（> 0.05）, and the inhibition effects of the remaining three inhibitors were as follows: EZ>AZ>Van.【】The algae weight, algal body parts, irradiance, and seawater volume had no effect on the pH compensation point of.The temperature had no significant effect on the utilization of inorganic carbon by, and HCO3-can be used as an inorganic carbon source for photosynthesis by.

; pH compensation point; inorganic carbon utilization; temperature; inhibitors

S968.4

A

1673-9159（2019）03-0061-09

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.03.009

2019-2-12

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015A020209167）

黃丹（1991—），女，碩士研究生，主要從事藻類(lèi)生理生態(tài)學(xué)研究。E-mail: gdouhd@163.com

劉東超（1963—），男，副教授，主要從事藻類(lèi)生理生態(tài)學(xué)研究。E-mail: liudc@gdou.edu.cn

黃丹，劉東超，王曉梁，等. 不同溫度下長(zhǎng)莖葡萄蕨藻無(wú)機(jī)碳利用[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，39（3）：61-69.

（責(zé)任編輯：劉朏）