趙常紅，李世昌 ，孫 朋

兒童青少年是人體骨骼發(fā)育的關(guān)鍵時期，運動作為一項有效的手段能夠促進骨骼的健康生長。Wnt/β-catenin信號通路作為骨代謝重要的信號通路，調(diào)控著骨的生長與代謝。研究發(fā)現(xiàn)，兒童和青少年女性一次增強運動Wnt信號DKK-1總體顯著下降[1]。優(yōu)秀舞者中，BMD與Wnt/β-連環(huán)蛋白和ER通路的遺傳變異有關(guān)[2]。這些結(jié)果表明，Wnt在人體骨骼對機械負荷的適應(yīng)中起重要作用[3]。運動過程中，壓力過大能異常激活軟骨細胞Wnt/β-catenin途徑[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，運動激活Wnt信號成骨作用，與運動強度和持續(xù)時間相關(guān)[5]。經(jīng)典的Wnt/β-catenin與軟骨細胞肥大密切相關(guān)，許多研究揭示了Wnt信號通路在維持軟骨內(nèi)成骨穩(wěn)態(tài)中的核心作用，促進Runx2在軟骨細胞肥大時高表達[6-7]。通過運動影響Wnt/β-catenin信號通路，影響生長板軟骨內(nèi)成骨影響骨形成的表型及分子機制研究未見報道，本研究通過不同方式的運動，調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，探究運動對生長板軟骨軟骨內(nèi)成骨的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組

本研究采用4周48只清潔級SD大鼠（雄性）作為實驗動物，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，合格證號：2015000526261，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2012-0002。隨機分成4組，每組12只，有對照組（control group，C組），游泳組（swimming group，S組），跑臺組（running group，R組）和下跳組（down jump group，D組）。各組分籠飼養(yǎng)，定期更換墊料、鼠籠，相對濕度50%～55%，溫度（24±3）℃。

1.2 運動方案

（1）C組：正常飼養(yǎng)，但不進行任何運動干預(yù)。

（2）S組：游泳訓(xùn)練池大小為50×60×50 cm（長×寬×高），水深4 0cm，水溫（20±2）℃。前3天游泳運動18 min/d，以后第1周游泳運動30 min/d，第2周開始每天游泳運動50 min，第3周開始每天游泳運動60 min，每周訓(xùn)練6天。

（3）R組：前3天跑臺運動18 min/d，以后第1周跑臺運動30 min/d，第2周開始每天跑臺運動50 min，第3周開始每天跑臺運動60 min，每周訓(xùn)練6天，跑速為1.2 km/h，跑臺坡度為0°。

（4）D組：前3天跳躍運動18 min/d，以后第1周天跳躍運動30 min/d，第2周開始每天跳躍運動50 min，第3周開始每天跳躍運動60 min，每周訓(xùn)練6天，下跳高度為20 cm，頻率為7～8次/min訓(xùn)練。訓(xùn)練6周后，進行實驗。

1.3 實驗動物取材，測量各組脛骨和股骨的圍度

取后肢脛骨和股骨，并左右分開，將肌肉和其他韌帶組織剝離干凈，并用電子秤進行稱重，用游標卡尺測量脛骨和股骨最細部位矢狀面的厚度并計算出圍度，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.4 不同方式運動各組脛骨骨強度指標測試

脛骨放置在YLS-16A小動物骨骼強度測定儀馬鞍形支架上，調(diào)好馬鞍形支架和壓頭連接傳感器，然后的中間壓頭緩慢施加壓力三點彎曲試驗，試驗以脛骨斷裂施壓停止，壓頭回位，顯示力學(xué)數(shù)值。注意壓頭壓力盡量和脛骨受力點和受力方位一致，并固定防止?jié)L動，保證實驗數(shù)據(jù)的準確性。得到最大荷載（maximum load，N）力學(xué)參數(shù)指標的實驗數(shù)據(jù)，然后進行統(tǒng)計分析。

1.5 Micro-CT相關(guān)指標檢測

取后左肢骨股（去軟組織），用4%多聚甲醛固定，立即送往上海澎贊生物科技有限公司進行Micro-CT（機子型號：Bruker Sksycan 1176）9 μm/每幀檢測，然后得到各組股骨骨組織形態(tài)學(xué)相關(guān)指標，再對得到松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨的相關(guān)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.6 生長板軟骨細胞中相關(guān)細胞因子mRNA和蛋白檢測

取生長板軟骨放入液氮預(yù)冷過的研缽研磨，提取RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用SYBR熒光定量對Wnt/β-catenin信號及下游基因進行檢測，引物（見表1）由Primer Premier 5軟件設(shè)計，由博尚生物科技有限公司合成。加裂解液研磨，然后移入1.5EP管中冰上放15 min；4℃離心10 min，取上清，加入等體積loading buffer100℃解構(gòu)，跑膠轉(zhuǎn)膜，用麗春紅染帶，剪膜標記目的蛋白，放入暗盒用5%的脫脂奶粉封閉1 h，然后加入目的蛋白一抗4℃過夜，用PBST洗5 min/3遍，加入相應(yīng)的二抗2 h，再用PBST洗15 min/3遍，最后掃膜，用ImageJ軟件進行灰度值分析?？贵w分別購于abcam和CST公司。

表1 引物序列一覽表Table1 List of Primer Sequences

1.7 實驗數(shù)據(jù)的處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 19.0進行統(tǒng)計和分析，用Mean±SD（平均數(shù)±標準差）表示，統(tǒng)計分析均采用單因素ANOVA方差分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 重量、圍度

實驗發(fā)現(xiàn)，與C組相比，S組和R組的脛骨濕重?zé)o顯著性差異（P＞0.05），D組的有非常顯著性增加（P＜0.01），與S組相比，R組和D組有非常顯著性增加（P＜0.01）；股骨濕重只有D組與C組和S組相比，有非常顯著性增加（P＜0.01）（見表2）。

表2 運動后各組大鼠脛骨、股骨重量，圍度比較（n=12，Mean±SD）Table2 Tibial and Femur Weight，Dimension of Rats in Different Ways Before and After Exercise

脛骨圍度（測得的直徑換算成周長）（見圖1），與C組相比，S組和R組無顯著性差異（P＞0.05），D組有非常顯著性增加（P＜0.01），與S組相比，R組和D組都有非常顯著性增加（P＜0.01），且D組較R組有顯著性增加（P＜0.05）；股骨圍度，只有D組與C組和S組相比有非常顯著性增加（P＜0.01）（見表2）。

圖1 不同方式運動后各組大鼠脛骨、股骨維度指標示意圖Figure1 A Sketch Map of the Dimension of Tibia and Femur of Rats After Different Ways of Exercise

2.2 不同方式運動后生長期SD大鼠骨強度影響比較

骨強度儀測試后現(xiàn)，只有D組力學(xué)指標，與C組和S組相比有非常顯著性增加（P＜0.01）（見表3）。骨強度力學(xué)測試產(chǎn)生顯著性差異，可能骨的微結(jié)構(gòu)骨密度產(chǎn)生變化導(dǎo)致的，進而做了精準的Micro-CT進一步研究。

表3 不同方式運動后各組大鼠脛骨骨強度比較（n=12）Table3 Comparison of Tibial Bone Strength in Rats After Different Ways of Exercise

2.3 不同方式的運動對生長期大鼠股骨Micro-CT相關(guān)指標的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，不同方式運動后，各組間大鼠股骨松質(zhì)骨BMD無顯著性差異（P＞0.05）；TV、BV各組間無統(tǒng)計學(xué)意義；BV/TV只有R組與S組相比有顯著性差異（P＜0.05）；TS只有D組與S組相比，有顯著性差異（P＜0.05）；BS各組間無統(tǒng)計學(xué)意義；D組BS/BV與C組和S組相比，有顯著性差異（P＜0.05）；BS/TV只有R組與S組相比，有顯著性差異（P＜0.05）；Tb.Th只有D組與和S組相比，有顯著性差異（P＜0.05）；Tb.N只有R組與S組相比，有顯著性差異（P＜0.05）；Tb.sp只有R組與S組相比，有顯著性差異（P＜0.05）。在這些指標當(dāng)中，只有BMD有差異才具有參考價值（見圖2，表4）。

圖2 不同方式運動后大鼠股骨組織形態(tài)學(xué)相關(guān)指標比較Figure2 Comparison of Histomorphological Indexes of Rat Femur After Different Ways of Exercise

對大鼠股骨皮質(zhì)骨BMD研究發(fā)現(xiàn)，只有D組與C組和S組相比有顯著性增加（P＜0.05）；R組TV與C組相比有顯著性增加（P＜0.05），D組的有非常顯著性增加（P＜0.01）；與C組相比，S組BV有顯著性增加（P＜0.05），R組和D組有非常顯著性增加（P＜0.01），與S組相比，R組和D組有非常顯著性增加（P＜0.01），與R組相比，D組也有非常顯著性增加（P＜0.01）；BV/TV比較發(fā)現(xiàn)，各組間無統(tǒng)計學(xué)意義；與C組相比，R組的TS有顯著性增加（P＜0.05），D組的有非常顯著性增加（P＜0.01），與S組相比，R組和D組有非常顯著性增加（P＜0.01），與R組相比，D組的也有顯著性增加（P＜0.05）；BS只有D組有非常顯著性增加（P＜0.01），和R組相比有顯著性增加（P＜0.05）；與S組相比，R組和D組BS/BV有顯著性差異（P＜0.05），但與C組相比只有R組只有顯著性差異（P＜0.05）；BS/TV組間無顯著性差異（P＞0.05）；與C組比較，R組和D組Tb.Th都有非常顯著性差異（P＜0.01）；Tb.N、Tb.sp各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（見表5）。

表4 不同方式運動后大鼠股骨松質(zhì)骨形態(tài)學(xué)相關(guān)指標比較（n=3）Table4 Comparison of Morphologic Indexes of Femur Cancellous Bone in Rats After Different Ways of Exercise

表5 不同方式運動后大鼠股骨皮質(zhì)骨形態(tài)學(xué)相關(guān)指標比較（n=3）Table5 Comparison of Morphologic Indexes of Cortical Bone in Rats After Different Ways of Exercise

2.4 不同方式運動后Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)mRNA表達比較

本研究發(fā)現(xiàn)，Wnt4mRNA的表達水平與C組相比，S組無顯著性差異（P＞0.05），R組有顯著性上調(diào)（P＜0.05），D組有非常顯著性上調(diào)（P＜0.01）；Wnt8mRNA的表達水平與C組相比，R組和D組都有非常顯著性上調(diào)（P＜0.01）；Wnt9mRNA的表達水平與C組相比，R組和D組有非常顯著性上調(diào)（P＜0.01），與S組相比，R組有顯著性上調(diào)（P＜0.05），D組有非常顯著性上調(diào)（P＜0.01）；GSK3βmRNA的表達水平，只有D組與C組和S組相比有顯著性上調(diào)（P＜0.05）；β-cateninmRNA的表達水平與C組相比，R組和D組都有非常顯著性上調(diào)（P＜0.01），與R組相比，D組也有顯著性上調(diào)（P＜0.05）；Runx2mRNA的表達水平與對照組C組相比，S組無顯著性差異（P＞0.05），R組有顯著性上調(diào)（P＜0.05），D組也有非常顯著性上調(diào)（P＜0.01）（見表6）。

表6 Wnt/β-catenin信號通路mRNA表達比較（Mean±SD）Table6 Comparison of Expression of mRNA in Wnt/β-catenin Signaling Pathway

Wnt8蛋白表達水平與C組相比，S組無顯著性差異（P＞0.05），R組和D組都有非常顯著性增加（P＜0.01），D組與R組相比也有非常顯著性增加（P＜0.01）；β-catenin蛋白表達水平與C組相比，R組有顯著性增加（P＜0.05），D組有非常顯著性增加（P＜0.01）；Runx2蛋白表達水平與C組相比，S組無顯著性差異（P＞0.05），R組有顯著性增加（P＜0.05），D組有非常顯著性增加（P＜0.01），D組與R組相比也有顯著性增加（P＜0.05）（見表7，圖3）。

表7 Wnt/β-catenin蛋白表達比較（Mean±SD）Table7 Comparison of Expression of Wnt/β-catenin Protein

圖3 運動后各組Wnt/β-catenin蛋白表達比較Figure3 Comparison of Expression of Wnt/β-catenin Protein After Different Ways of Exercise

3 分析與討論

3.1 不同方式的運動對大鼠后肢骨圍度指標的影響

研究發(fā)現(xiàn)，生長期的運動可以通過骨膜擴張來增加皮質(zhì)骨的大小[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，跑臺和下跳方式的運動對大鼠后肢脛骨和股骨維度的影響，S組和C組之間無顯著性差異，說明游泳運動對大鼠脛骨圍度的影響意義不大；R組和C組之間無統(tǒng)計學(xué)意義，而與S組有非常顯著性差異，說明跑臺運動能增強大鼠脛骨圍度；下跳運動相比C組和S組都有非常顯著的差異性，說明下跳相對2組脛骨圍度的作用顯著，相對于R組也有顯著性差異，股骨圍度只有D組與C組、S組有顯著性差異，R組沒有。這說明，下跳運動相對于跑臺運動對大鼠脛骨圍度的效果更為顯著，下跳運動利于后肢骨圍度的增加，對生長期大鼠骨的健康生長更為有利。B.M.LAPAUW[9]的研究也發(fā)現(xiàn)，機械力學(xué)刺激是決定骨骼大小的重要因素。

3.2 不同方式的運動對大鼠骨強度的影響

BMD雖然是預(yù)測骨強度的生物指標，但不能準確客觀地反映實際骨強度的變化，只能作為預(yù)測骨強度指標之一[10]。骨強度是骨質(zhì)和量的綜合反映，最直接和客觀反映實際骨強度的骨力學(xué)測試實驗。最近的研究發(fā)現(xiàn)，骨作為運動的受力器官，主要對抗重力產(chǎn)生適應(yīng)性變化，游泳運動雖有肌肉收縮力，但在低重力環(huán)境中對骨的作用影響很小，骨量并不增加。研究發(fā)現(xiàn)，克服重力的運動有助于皮質(zhì)骨面積和厚度的增加，且骨膜的擴張是不可逆的，這對于骨的力學(xué)性能的增加是非常有利的[11]。

既然本實驗發(fā)現(xiàn)，不同方式運動對后肢骨脛骨和股骨的圍度產(chǎn)生差異變化，那么生物力學(xué)也就是骨強度力學(xué)方面是否也存在變化呢？于是，進行了脛骨三點彎曲力學(xué)實驗。本實驗結(jié)果顯示，通過6周的不同方式的運動，D組的脛骨強度顯著性增加，R組雖有上升趨勢，但沒有顯著性差異，說明下跳運動對大鼠的脛骨強度有非常顯著的增強作用，跑臺運動在提高骨的骨強度方面沒有下跳運動效果好，游泳運動效果更不理想。D組皮質(zhì)骨BMD顯著增加，力學(xué)測試也是D組顯著增加，印證下跳組對骨的圍度和力學(xué)指標的提高是有效的。這可能預(yù)示著，在實際的運動鍛煉中跳躍運動既能促進骨的縱向生長，更有利于促進骨圍度和力學(xué)性能的提高。

3.3 不同方式的運動對生長期大鼠骨Micro-CT相關(guān)指標的影響

作為兒童青少年，沒有骨質(zhì)疏松這一說法，隨著營養(yǎng)、遺傳的個體差異和環(huán)境的影響后，會出現(xiàn)生長發(fā)育的快慢和好壞之分。骨組織計量學(xué)也是一項重要的評價指標，其對于成年后的最低骨峰值、骨強度都有重要的意義。研究生長期大鼠的骨組織計量學(xué)指標，對預(yù)測和提高成年后骨質(zhì)和量有重要意義。主要有以下指標：骨密度（BMD）、總體積（TV）、組織體積（BV）、骨體積分數(shù)（BV/TV）、骨表面積（BS）、骨表面積/骨體積（BS/BV）、骨表面積/組織體積（BS/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數(shù)（Tb.N）和骨小梁分離度（Tb.Sp）等。D組力學(xué)指標顯著增加，是否表明在骨的形態(tài)計量學(xué)方面存在差異呢？出于前面這一結(jié)果預(yù)示，本研究進行了骨的Micro-CT掃描實驗。統(tǒng)計結(jié)果顯示，在松質(zhì)骨BMD統(tǒng)計結(jié)果顯示無差異性，說明不同方式的運動確實對單位松質(zhì)骨方面無顯著性差異，但皮質(zhì)骨在骨密度方面下跳組較對照組、游泳組出現(xiàn)了顯著性差異，與我們的力學(xué)測試結(jié)果高度一致，跑臺組也有上升趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。J.IWAMOTO等[12]研究也發(fā)現(xiàn)，8周的運動是皮質(zhì)骨面積和礦物沉積率顯著增加。這就讓我們更有理由相信，下跳運動對骨強度相關(guān)的皮質(zhì)骨厚度的增加有顯著相關(guān)性。產(chǎn)生不同結(jié)果的原因，可能與運動方式的力學(xué)刺激性質(zhì)有關(guān)[13]。

3.4 不同方式的運動對生長期大鼠Wnt/β-catenin信號通路的影響

經(jīng)典的Wnt/β-catenin，是Wnt信號通路里目前研究最清楚的信號通路，在細胞核內(nèi)積聚，與軟骨細胞肥大密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，中等活性的Wnt信號促進軟骨細胞增殖，但隨著活性進一步增大會增加軟骨細胞肥大表達Col10、Runx2、MMP13和VEGF[14]。Wnt/β-catenin在調(diào)控發(fā)育軟骨內(nèi)骨化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。通常Runx2在軟骨細胞肥大Wnt升高時高表達[16]。前期的研究已經(jīng)報道，下坡跑能促進骨組織中Wnt/βcatenin的升高，而這種升高在骨的重塑中發(fā)揮重要作用，可以顯著提高骨量，而這種效果在生長板軟骨細胞中的表達還很少有研究報道[17]。許多證據(jù)表明，軟骨細胞的肥大化Runx2表達是開關(guān)，若能調(diào)節(jié)Runx2表達進而調(diào)節(jié)此開關(guān)。Wnt信號和配體有多種類型，在軟骨細胞分化中起著不同的作用，不同的Wnt蛋白在軟骨細胞肥大分化中起不同的作用，Wnt3a、Wnt5b促進軟骨細胞分化延遲性肥大[18-19]。Wnt4和Wnt8能促進Runx2表達增高，從而促進軟骨細胞肥大化，wnt9a促進軟骨細胞增殖和肥大分化[20]。在MSCs期間，Wnt11表達促進軟骨細胞Runx2和Ihh表達[21]。Wnt5a骨髓間充質(zhì)干細胞在軟骨分化過程中具有雙重功能。早期，Wnt5a誘導(dǎo)軟骨形成和肥大通過細胞內(nèi)鈣釋放通過G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）激活[22]。后期，它可以通過激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制軟骨細胞肥大和B細胞（NF-κBκ）蛋白活化，抑制Runx2[23]。骨骼的軟骨細胞需要Wnt極化并適當(dāng)定位以啟動軟骨內(nèi)骨化程序[24]。阻礙軟骨細胞和軟骨膜中的Wnt分泌，延遲生長板中的軟骨細胞肥大，并損害軟骨膜成骨。研究表明，Wnt蛋白不僅調(diào)節(jié)軟骨細胞群體內(nèi)的分化和細胞通訊，而且調(diào)節(jié)生長板中軟骨細胞和成骨細胞之間的交叉調(diào)節(jié)[25]。Wnt/β-catenin還會協(xié)同其他信號通路，如Ihh、BMP、IGF和FGF通路激活轉(zhuǎn)錄因子Runx2，調(diào)控整個軟骨成骨過程[26]。

本研究結(jié)果顯示，R組除Wnt4mRNA出現(xiàn)顯著性差異外，其余的R組和D組mRNA和蛋白都出現(xiàn)非常顯著性升高，而且在Wnt4mRNA出現(xiàn)D組較R組出現(xiàn)顯著性升高，Wnt8蛋白表達上D組較R組出現(xiàn)非常顯著性升高，β-catenin R組和D組mRNA和蛋白都出現(xiàn)非常顯著性升高，D組上升更為顯著，說明Wnt/β-catenin通路可能被激活，下跳運動更為有利；Runx2在D組和R組之間也有統(tǒng)計學(xué)差異，說明R組和D組這2種運動方式促進了軟骨細胞肥大，進而促進生長板軟骨細胞Runx2的產(chǎn)生，Runx2不僅有利于促進軟骨細胞的肥大，而且有利于軟骨細胞的礦化。由此可以推斷，下跳運動更有利于Wnt/β-catenin信號通路激活，進而激活了Runx2的產(chǎn)生，進一步促進了生長板軟骨細胞肥大分化、礦化和軟骨內(nèi)成骨生成。

4 結(jié) 論

本研究證實，6周的下跳運動能增加生長期大鼠脛骨和股骨濕重，提高脛骨強度，增加股骨皮質(zhì)骨密度和骨組織體積，改善骨的健康參數(shù)，且效果優(yōu)于跑臺和游泳運動。其機制可能與下跳運動的力學(xué)刺激更有利于生長期大鼠生長板軟骨細胞Wnt/β-catenin信號通路的激活，與促進Runx2的表達有關(guān)，最終導(dǎo)致生長板軟骨細胞肥大分化和礦化的軟骨內(nèi)成骨增加。