曹 宇，刁雪梅2，李澤惠，李 琨3，劉美霞，裴 卉，李 浩

血管性癡呆(vascular dementia，VaD)是指由腦血管病變引起的或與腦血管病變有關(guān)的一種獲得性慢性進行性智力損害綜合征，臨床表現(xiàn)為智能障礙，包括認知能力、記憶力、判斷和思維能力、計算能力和社會生活能力的減退[1-2]。VaD是僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)的第二大導(dǎo)致癡呆的疾病[3]，給社會帶來巨大經(jīng)濟負擔。VaD發(fā)病機制尚不明確，目前關(guān)于VaD發(fā)病機制的假說包括腦能量代謝障礙、氧化應(yīng)激損傷、炎性反應(yīng)、膽堿能系統(tǒng)失衡等[4-5]。海馬星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞增殖、激活引起炎性反應(yīng)是VaD的重要病理特征[6-7]。參麻益智方是臨床治療VaD的常用方，取得較好療效，該方由人參、天麻、鬼箭羽、川芎組成，具有補虛增智、活血平肝之功效。臨床研究表明，參麻益智方能改善VaD病人的認知功能障礙[8-9]。本研究旨在探討參麻益智方對雙側(cè)頸動脈結(jié)扎大鼠海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細胞及小膠質(zhì)細胞活化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 參麻益智方由人參、天麻、鬼箭羽、川芎組成(3∶3∶3∶2)，均購自中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院。按照人與大鼠用藥劑量換算方法取各藥共5 200 g，純凈水浸泡30 min，入砂鍋文火煎煮30 min，倒出藥汁，加純凈水兩次煎煮20 min。合并兩次藥汁，過濾后置于100 ℃恒溫水浴箱濃縮至100%，即含生藥1 g，4 ℃避光保存。

1.2 實驗動物及分組 選用雄性SPF級10周齡Wistar大鼠80只，體重(300±20)g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK(京)2016-0002。大鼠飼養(yǎng)于人工光照明暗各12 h飼養(yǎng)室內(nèi)，溫度(23±2)℃，濕度(50±10)%，標準飼料和自來水自行取用。經(jīng)1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后進行實驗。中藥低劑量參麻益智方組(SMYZ-L)、中劑量組(SMYZ-M)、高劑量組(SMYZ-H)，每組10只，分別予3.3 mg/kg、6.6 mg/kg、16.5 mg/kg灌胃；鹽酸多奈哌齊組(Donepezil組，10只)給予0.5 mg/kg藥物灌胃，假手術(shù)組(Sham組，10只)及雙側(cè)頸動脈結(jié)扎組(2-VO組，10只)給予等量蒸餾水灌胃。各組大鼠連續(xù)灌胃4周，大鼠喂養(yǎng)嚴格遵照動物保護協(xié)會相關(guān)規(guī)定。本研究獲得中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院倫理委員會批準，批準編號2018XLC008-1。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠一般情況 給藥結(jié)束后，觀察大鼠精神狀態(tài)、毛色、活動度及體質(zhì)量。

1.3.2 大鼠2-VO模型 大鼠術(shù)前禁食，行無菌手術(shù)操作。以2%戊巴比妥鈉(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，仰臥固定，刮除頸部被毛，碘消毒頸部，縱行剪開頸部皮膚1.5～2.0 cm，鈍性分離皮下組織及肌肉，暴露雙側(cè)頸總動脈，使用手術(shù)線于雙側(cè)頸總動脈近心端和遠心端分別結(jié)扎，之后將兩結(jié)扎處之間剪斷?？p合皮膚，保溫回籠飼養(yǎng)。模型組及藥物治療組結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動脈。術(shù)后肌肉注射青霉素預(yù)防感染。手術(shù)時室溫控制在28 ℃，術(shù)后24 h內(nèi)控制在25 ℃時大鼠狀態(tài)穩(wěn)定。各組大鼠清醒后參照Longa等[10]5級評分法進行神經(jīng)功能評分：0分，無神經(jīng)功能缺損體征；1分，對側(cè)前肢屈曲、不能伸直、同側(cè)霍納征，表現(xiàn)為提頸時左上肢向下、不能上抬；2分，向外側(cè)轉(zhuǎn)圈(大部分向左，小部分向右)；3分，行走時向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走、意識喪失。評分1～3分視為大鼠造模成功，造模失敗大鼠剔除并在后續(xù)實驗不足保證每組10只。

1.3.3 Morris水迷宮評價空間記憶能力 給藥結(jié)束后次日進行Morris水迷宮實驗(ZS-001型Morris水迷宮系統(tǒng)，北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司)。前5 d為定位航行實驗：將大鼠頭朝池壁放入水中，放入位置隨機取東、西、南、北4個起始位置之一。記錄動物找到水下平臺時間(s)，若探索時間超過90 s，引導(dǎo)動物到平臺并讓其在平臺上停留10 s。將動物移開、擦干。每只動物每日訓(xùn)練4次，兩次訓(xùn)練間隔15～20 min。最后一次定位航行實驗結(jié)束后次日將平臺撤除，開始90 s探查訓(xùn)練。入水點為原先平臺象限的對側(cè)，記錄大鼠在原先放置平臺象限花費時間，以此作為空間記憶的檢測指標。

1.3.4 免疫組化檢測小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞 Morris水迷宮實驗后，以2%戊巴比妥鈉(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，大鼠經(jīng)主動脈灌流后固定，斷頭取腦。各組取5只進行全腦固定、石蠟包埋、切片，冠狀位切片，厚度10 μm。分別滴加抗GFAP(protein tech公司，1∶300)和抗Iba-1抗體(proteintech公司，1∶300)行免疫組織化學(xué)染色。每張切片于100倍光鏡下觀察其形態(tài)數(shù)量，并進行拍照。

2 結(jié) 果

2.1 實驗動物一般情況 與Sham組比較，2-VO組大鼠精神狀態(tài)明顯萎靡不振，毛色無光澤而枯槁豎毛，活動度及體質(zhì)量明顯下降。給藥后，各組大鼠狀態(tài)較2-VO組有明顯改善；其中灌胃參麻益智方后大鼠精神狀態(tài)較好，體質(zhì)量恢復(fù)，Sham組輕，毛發(fā)略散亂有光澤，未見毛色枯槁或散亂豎毛，活動增多。

2.2 參麻益智方對雙側(cè)頸動脈結(jié)扎大鼠行為學(xué)的影響 與Sham組比較，2-VO組大鼠在水迷宮實驗到達安全平臺游泳時間(逃避潛伏期，escape latency)明顯延長(P<0.05)，提示雙側(cè)頸動脈結(jié)扎能明顯降低大鼠空間記憶能力。經(jīng)過參麻益智方中劑量(6.6 mg/kg)、高劑量(16.5 mg/kg)及多奈哌齊(0.5 mg/kg)干預(yù)后，從第3天開始逃避潛伏期均較2-VO組顯著降低(P<0.05)。撤去安全平臺后，SMYZ-M組、SMYZ-H組及Donepezil組大鼠目標象限停留時間百分比明顯提高(P<0.05)，說明參麻益智方和多奈哌齊可恢復(fù)大鼠記憶能力。詳見圖1。

與2-VO組比較，*P<0.05

2.3 參麻益智方對星形膠質(zhì)細胞的影響 100倍顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細胞形態(tài)，2-VO組星形膠質(zhì)細胞增生，表現(xiàn)為細胞數(shù)量增多，胞體變大，突起增多、變長并交織成網(wǎng)狀；給藥后，Donepezil組與SMYZ-H組、SMYZ-M組GFAP陽性細胞數(shù)量較2-VO組減少，突起變短、變細，胞體變小。詳見圖2。

圖2 大鼠海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細胞(×100)

2.4 參麻益智方對小膠質(zhì)細胞的影響 100倍顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細胞形態(tài)，相較于Sham組，2-VO組小膠質(zhì)細胞胞體變大，由分支狀變?yōu)橥黄鹕俣痰墓嗄緲蛹毎?，甚至進一步轉(zhuǎn)化為“阿米巴樣”圓形細胞。Donepezil組與SMYZ-H組、SMYZ-M組均有散在的小膠質(zhì)細胞激活，較2-VO組數(shù)量減少。詳見圖3。

圖3 大鼠海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細胞(×100)

3 討 論

星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)中的豐富細胞，為神經(jīng)元提供營養(yǎng)支持，促進突觸形成和功能，通過吞噬作用修剪突觸，并實現(xiàn)一系列其他穩(wěn)態(tài)維持功能。星形膠質(zhì)細胞在腦損傷和疾病后發(fā)生顯著轉(zhuǎn)化，稱作“反應(yīng)性星形細胞增生(reactive astrocytosis)”，相關(guān)研究表明，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞阻礙CNS恢復(fù)[11-12]。

小膠質(zhì)細胞是CNS中固有的免疫細胞，是促炎細胞因子的主要來源，能調(diào)節(jié)大腦發(fā)育，維持神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)和損傷修復(fù)[13]。正常情況下小膠質(zhì)細胞處于相對靜息狀態(tài)，表現(xiàn)為胞體較小，突起細且長滿分支；CNS損傷或衰老過程，小膠質(zhì)細胞激活，突起回縮變短，胞體變大，呈現(xiàn)阿米巴樣形態(tài)[14]。過度激活的小膠質(zhì)細胞分泌促炎性因子，產(chǎn)生自由基，引起神經(jīng)元繼發(fā)性損傷，從而抑制小膠質(zhì)細胞激活，緩解神經(jīng)炎癥反應(yīng)，進而減輕CNS損傷[15-17]。

VaD是導(dǎo)致癡呆疾病的第二種常見類型，僅次于AD，因其具有可防治性，也稱作“可逆性癡呆”，藥物及非藥物療法在改善VaD病人癥狀和減輕家庭照料負擔方面起到積極作用，目前尚缺乏根本有效的早期診斷與防治措施[18-19]。隨著中醫(yī)藥對VaD研究深入，中藥因其多靶點、多途徑作用機制在改善VaD方面有突出優(yōu)勢。中醫(yī)認為癡呆發(fā)生與年老體衰、氣虛血瘀有關(guān)。如《千金翼方》曰：“人年五十以上，陽氣日衰，損與日至，心力漸退，忘前失后，興居怠惰，計授皆不稱心?！薄秲?nèi)經(jīng)》曰“蓄血在上，善忘”；王清任亦曰：“瘀血也令人善忘”。卒中后認知障礙(post-stroke cognitive impairment，PSCI)是臨床VaD的常見亞型[20]。古籍中亦有相關(guān)記載，清朝葉天士《臨證指南醫(yī)案》中記載有：“中風初起，神呆遺尿，老人厥中顯然”；《雜病源流犀燭·中風》有“中風后善忘”之論。由此可見肝陽上亢，化火生風，風陽上擾清竅，可發(fā)為癡呆。參麻益智方針對VaD氣虛血瘀、肝風內(nèi)動病理特點而設(shè)，由人參、天麻、鬼箭羽、川芎組成，具有補虛增智、活血平肝之功。方中以人參為君，具有大補元氣、安神增智之效；天麻為臣，具有平肝息風，滋陰潛陽，君臣相合，共奏活血通經(jīng)之效；鬼箭羽為佐，以行血通絡(luò)散瘀，可助推陳致新，恢復(fù)水精平衡，并以川芎為使，兼引經(jīng)藥，載諸藥直入血分達腦竅。諸藥合用，共奏補虛益智，平肝潛陽，化瘀通絡(luò)之功。本研究結(jié)果顯示，高劑量及中劑量參麻益智方干預(yù)2-VO大鼠，4周后可縮短大鼠逃避潛伏期，提高大鼠停留在目標象限時間，說明參麻益智方能提高VaD模型大鼠的空間記憶能力。進一步研究顯示參麻益智方能抑制海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的激活和增生，這可能是參麻益智方提高慢性低灌注大鼠認知功能的機制之一。