葸 瑋，蔣 進(jìn)，唐宗祥，王淑榮

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)植物遺傳育種省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川成都 611130；2.四川省南充市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川南充 637000)

評(píng)價(jià)親本對(duì)其后代衍生品種的遺傳貢獻(xiàn)有利于小麥育種過程中的親本選擇。在這一類遺傳分析中，分子標(biāo)記是常用的工具。比如，DArT、SSR和Illumina 90KiSelect SNP等標(biāo)記被廣泛用來分析小麥骨干親本對(duì)其衍生品種的遺傳貢獻(xiàn)[1-8]。這些分子標(biāo)記能較好地追蹤骨干親本傳遞給后代的重要染色體區(qū)段，有利于這些區(qū)段的分子標(biāo)記輔助選擇。但分子標(biāo)記不能反映染色體區(qū)段的具體結(jié)構(gòu)變異，尤其是對(duì)于小麥背景中的外源染色體的存在狀況，以上提到的分子標(biāo)記方法不能很好地鑒定。因此，利用熒光原位雜交(FISH)技術(shù)，從染色體結(jié)構(gòu)變異方面研究小麥親本及其衍生系的基因組變異，會(huì)對(duì)分子標(biāo)記分析結(jié)果起到很好的補(bǔ)充作用。近年來發(fā)展起來的非變性熒光原位雜交(nondenaturing fluorescenceinsituhybridization,ND-FISH)技術(shù)對(duì)這方面的研究具有促進(jìn)作用。依賴于寡核苷酸探針的ND-FISH技術(shù)，具有方便、快捷和經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)[9-11]。利用寡核苷酸探針和ND-FISH 技術(shù)，可以反映不同小麥品種(系)的染色體結(jié)構(gòu)差異[12-15]，同時(shí)還可以體現(xiàn)同一串聯(lián)重復(fù)序列的不同區(qū)段在不同染色體上的分布差異[12-13]。因此，利用基于寡核苷酸探針的ND-FISH技術(shù)，可以快速、方便地分析小麥親本及其衍生系的染色體結(jié)構(gòu)差異，從而跟蹤親本材料染色體在衍生系中的變異情況，這有助于小麥育種理論的完善和加強(qiáng)。本研究擬利用南麥號(hào)系列品種及其親本，研究小麥親本與其后代衍生品種的染色體結(jié)構(gòu)變異情況，以期為小麥育種提供更直觀的遺傳變異參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

小麥親本材料攀早抗及其衍生品種南麥302、南麥618、特研麥南88和榮春南麥1號(hào)用于本研究，南麥302、南麥618、特研麥南88的系譜均為16-1/攀早抗，榮春南麥1號(hào)的系譜為2001-43-1/攀早抗。由于16-1和2001-43-1的種子遺失，沒有用于本研究。

1.2 方 法

1.2.1 根尖細(xì)胞有絲分裂中期染色體制片

供試小麥材料的根尖細(xì)胞有絲分裂中期染色體制備參照Han等描述的方法[16]。每份材料至少取5粒種子。

1.2.2 非變性熒光原位雜交(ND-FISH)

寡核苷酸探針Oligo-275.1、Oligo-275.2、Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1用于ND-FISH分析。其中Oligo-275.1和 Oligo-275.2根據(jù)已公布的串聯(lián)重復(fù)序列pTa-275設(shè)計(jì)而得[12,17]，Oligo-pSc119.2-1根據(jù)已公布的pSc119.2家族串聯(lián)重復(fù)序列設(shè)計(jì)[10]，Oligo-pTa535-1根據(jù)已公布的串聯(lián)重復(fù)序列pTa-535設(shè)計(jì)而得[10,17]。ND-FISH分析參照Fu等[11]和Tang等[12]的方法。對(duì)于每一粒種子的根尖，至少觀察5個(gè)細(xì)胞。

2 結(jié)果與分析

2.1 2A、6A、7A、5B、1D和2D染色體結(jié)構(gòu)變異

從Oligo-pSc119.2-1的FISH帶型看，小麥親本攀早抗含1對(duì)1RS/1BL易位染色體(圖1、圖2)，其衍生品種南麥302、特研麥南88和南麥618都含1RS/1BL易位染色體(圖1、圖2)，僅榮春麥南麥1號(hào)是非1RS/1BL易位系品種(圖1、圖2)。寡核苷酸探針Oligo-275.1、 Oligo-275.2、 Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1反映出了2A、4A、5A、6A、7A、3B、5B、6B、1D和2D染色體在攀早抗及其衍生品種中的結(jié)構(gòu)差異(圖1、圖2、圖3)。

對(duì)于2A、6A、7A、5B、1D和2D染色體，品種間的結(jié)構(gòu)差異主要由探針Oligo-275.1和 Oligo-275.2體現(xiàn)。攀早抗和南麥302的2A染色體無Oligo-275.1信號(hào)，其余品種的2A染色體都有該探針信號(hào)(圖1、圖3)。僅特研南麥88和榮春南麥1號(hào)的6A染色體帶有Oligo-275.1的信號(hào)(圖1、圖3)。攀早抗的7A染色體不含Oligo-275.1和 Oligo-275.2信號(hào)，Oligo-275.1和Oligo-275.2信號(hào)在南麥302的7AL臂出現(xiàn)，但在特研麥南88、榮春南麥1號(hào)和南麥618的7AS和7AL臂都出現(xiàn)；Oligo-275.2的信號(hào)出現(xiàn)在特研麥南88的7AS和7AL臂以及南麥618的7AL臂，而榮春南麥1號(hào)7A染色體不含Oligo-275.2信號(hào)(圖1、圖2、圖3)。除南麥618的5B染色體外，其余品種的5B染色體都帶有Oligo-275.2信號(hào)(圖2、圖3)。攀早抗和南麥618的1D染色體無Oligo-275.1信號(hào)，其余品種的1D染色體都有該探針信號(hào)(圖1、圖3)。除特研麥南88的2D染色體外，其余品種的2D染色體都不帶有Oligo-275.2信號(hào)(圖2、圖3)。

2.2 4A、5A、3B和6B染色體結(jié)構(gòu)變異

攀早抗、南麥302、特研南麥88和榮春南麥1號(hào)的4AL臂都帶有Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1的信號(hào)，以及較弱的Oligo-275.1信號(hào)，而南麥618的4AL臂不含Oligo-pSc119.2-1和Oligo-275.1信號(hào)(圖1、圖3)。攀早抗的5AS端部含Oligo-pSc119.2-1信號(hào)，5AL含Oligo-pTa535-1、Oligo-275.1和 Oligo-275.2信號(hào)；南麥302、特研南麥88和榮春南麥1號(hào)的5AS臂都不含Oligo-pSc119.2-1信號(hào)，而這3個(gè)品種的5AL臂都含Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa535-1、Oligo-275.1和 Oligo-275.2信號(hào)；南麥618的5A染色體除了在5AS端部含Oligo-pSc119.2-1信號(hào)外，其余探針信號(hào)都不存在(圖1、圖2、圖3)。幾個(gè)品種的3B和6B染色體的結(jié)構(gòu)差異主要由Oligo-pSc119.2-1信號(hào)體現(xiàn)。Oligo-pSc119.2-1在5個(gè)品種的3BS端部和亞端部都產(chǎn)生3個(gè)信號(hào)位點(diǎn)，攀早抗和南麥618的3BS端部Oligo-pSc119.2-1信號(hào)弱，而其余3個(gè)品種的該位置信號(hào)強(qiáng)(圖1、圖2、圖3)。南麥618的6BS端部無Oligo-pSc119.2-1信號(hào)，其余4個(gè)品種的6BS端部都含有該信號(hào)(圖1、圖2、圖3)。

A、C、E、G和I用寡核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1(綠)和Oligo-pTa535-1(紅)進(jìn)行分析；B、D、F、H和J 用寡核苷酸探針Oligo-275.1(綠)進(jìn)行分析。A和 B:攀早抗同一細(xì)胞；C和D:南麥302同一細(xì)胞；E和F:特研麥南88同一細(xì)胞；G和 H:榮春南麥1號(hào)同一細(xì)胞；I和 J:南麥618同一細(xì)胞。Oligo-pSc119.2-1主要在染色體的端部、亞端部和臂間產(chǎn)生信號(hào)(A、C、E、G和I)，Oligo-275.1主要在著絲粒、近著絲粒和亞端部產(chǎn)生信號(hào)(B、D、F、H和J)。

A,C,E,G and I:Oligo probes Oligo-pSc119.2-1(green) and Oligo-pTa535-1(red) were used for ND-FISH; B,D,F,H and J:Oligo probe Oligo-275.1(green) was used for ND-FISH. A and B:The same cell of Panzaokang; C and D:The same cell of Nanmai302; E and F:The same cell of Teyanmai Nan 88; G and H:The same cell of Rongchun Nanmai 1; I and J:The same cell of Nanmai 618. Signals of Oligo-pSc119.2-1 mainly appeared on the telomeric,subtelomeric and intercalary regions of chromosomes(A,C,E,G and I). Oligo-275.1 mainly produced signals on the centromeric,pericentromeric and subtelomeric regions(B D,F,H and J).

圖1 攀早抗及其衍生品種的ND-FISH分析結(jié)果

Fig.1 ND-FISH analysis of Panzaokang and its derived wheat varieties.

A、C、E、G和I用寡核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1(綠)和Oligo-pTa535-1(紅)進(jìn)行分析；B、D、F、H和J 用寡核苷酸探針Oligo-275.2(綠)進(jìn)行分析。A和B:攀早抗同一細(xì)胞；C和 D:南麥302同一細(xì)胞；E和 F:特研麥南88同一細(xì)胞；G和 H:榮春南麥1號(hào)同一細(xì)胞；I和J:南麥618同一細(xì)胞。Oligo-pSc119.2-1主要在染色體的端部、亞端部和臂間產(chǎn)生信號(hào)(A、C、E、G和I)，Oligo-275.2主要在著絲粒、近著絲粒和亞端部產(chǎn)生信號(hào)(B、D、F、H和J)。

A,C,E,G and I:Oligo probes Oligo-pSc119.2-1(green) and Oligo-pTa535-1(red) were used for ND-FISH;B,D,F,H and J:Oligo probe Oligo-275.2(green) was used for ND-FISH. A and B:The same cell of Panzaokang; C and D:The same cell of Nanmai 302; E and F:The same cell of Teyanmai Nan 88; G and H:The same cell of Rongchun Nanmai 1; I and J:The same cell of Nanmai 618. Signals of Oligo-pSc119.2-1 mainly appeared on the telomeric,subtelomeric and intercalary regions of chromosomes(A,C,E,G and I). Oligo-275.2 mainly produced signals on the centromeric,pericentromeric and subtelomeric regions(B,D,F,H and J).

圖2 攀早抗及其衍生品種的另一ND-FISH分析結(jié)果

Fig.2 Another ND-FISH analysis of Panzaokang and its derived wheat varieties

535 表示寡核苷酸探針Oligo-pTa535-1(紅)；119.2表示寡核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1(綠)；275.1表示寡核苷酸探針Oligo-275.1(綠)；275.2表示寡核苷酸探針Oligo-275.2(綠)。

535 represents oligo probe Oligo-pTa535-1(red); 119.2 represents oligo probe Oligo-pSc119.2-1(green); 275.1 represents oligo probe oligo-275.1(green); 275.2 represents oligo probe oligo-275.2(green).

圖3 攀早抗及其衍生品種中有結(jié)構(gòu)變異染色體的截圖對(duì)比

Fig.3The chromosomes for comparison among the structural alteration chromosomes of Panzaokang and its derived varieties

3 討 論

3.1 FISH核型分析能夠跟蹤小麥品種的系譜

寡核苷酸探針Oligo-275.1和 Oligo-275.2能夠反映出小麥A組染色體和部分B、D組染色體的結(jié)構(gòu)差異[12]。本研究中，所用材料的2A、6A、7A、5B、1D和2D染色體的結(jié)構(gòu)差異主要由這兩個(gè)探針體現(xiàn)。結(jié)合Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1的信號(hào)模式，4A、5A、3B和6B染色體的結(jié)構(gòu)差異也被檢測(cè)到。盡管與攀早抗組合的另兩個(gè)親本16-1和2001-43-1沒有用于本實(shí)驗(yàn)，但可以推測(cè)：特研麥南88、榮春南麥1號(hào)和南麥618的2A，南麥618的4A、5B和6B，4個(gè)衍生品種的5A和7A，特研南麥88和榮春南麥1號(hào)的6A，南麥302、特研南麥88和榮春南麥1號(hào)的3B和1D以及特研南麥88的2D，這些染色體的主要區(qū)段可能不是來自攀早抗，而是另一個(gè)親本。這一結(jié)果為進(jìn)一步對(duì)這些材料進(jìn)行分子標(biāo)記分析提供了細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

3.2 FISH核型可以反映品種間染色體的不同重組情況

本研究所用材料中，南麥302、特研麥南88和榮春南麥1號(hào)都來自同一組合16-1/攀早抗。但這3個(gè)品種的2A、6A、7A和2D染色體結(jié)構(gòu)不同。南麥302的2A和6A、南麥302和榮春南麥1號(hào)的2D染色體與攀早抗的相應(yīng)染色體結(jié)構(gòu)相同，對(duì)于這3對(duì)染色體的重組情況不好推測(cè)。而這3個(gè)品種中的7A染色體的結(jié)構(gòu)變異卻比較復(fù)雜。根據(jù)Oligo-275.1和 Oligo-275.2的信號(hào)模式，可以作如下推測(cè)：親本16-1的7A染色體兩個(gè)臂的亞端部都帶有 Oligo-275.1和 Oligo-275.2的信號(hào)，南麥302中的7A可能在兩親本的短臂發(fā)生了重組，特研麥南88的7A可能在短臂和長(zhǎng)臂都發(fā)生了重組，榮春南麥1號(hào)的7A也在短臂和長(zhǎng)臂發(fā)生了重組，但重組位點(diǎn)與特研麥南88的7A不同。

3.3 FISH技術(shù)在研究小麥品種(系)染色體結(jié)構(gòu)演變中的作用

有不少研究表明，以串聯(lián)重復(fù)序列為探針的FISH技術(shù)可以反映小麥品種(系)之間的染色體結(jié)構(gòu)變異[14-15,18-20]。Jiang等[14]利用Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa535-1和(AAG)6三種寡核苷酸探針對(duì)85個(gè)小麥品種(系)的染色體進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，每一個(gè)小麥品種(系)都有自己獨(dú)特的FISH核型。Huang等[15]對(duì)2000多份來自中國的小麥材料進(jìn)行了基于寡核苷酸探針的高分辨率的FISH分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些小麥材料的染色體存在易位、近著絲粒倒位和缺失等結(jié)構(gòu)變異，根據(jù)FISH核型，這些小麥材料可以分為4大類。本研究結(jié)果也表明，基于寡核苷酸探針的ND-FISH技術(shù)可以用來推測(cè)小麥品種系譜，反映染色體之間的交換重組關(guān)系。因此，可以建立小麥染色體FISH核型，從染色體結(jié)構(gòu)水平來反映小麥品種(系)間的遺傳多樣性，從而推斷小麥品種(系)的系譜及演變過程。FISH技術(shù)能夠真實(shí)地反映染色體的結(jié)構(gòu)變異，可以為分子標(biāo)記技術(shù)提供更直觀的參考。此外，基于寡核苷酸探針的ND-FISH技術(shù)具有方便、快捷和經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)[11]，可以用來規(guī)?；治鲂←溣H本及其衍生后代。隨著適宜于ND-FISH分析的新型寡核苷酸探針的不斷開發(fā)，該技術(shù)在小麥品種(系)染色體結(jié)構(gòu)演變研究中的作用將更加突出。

綜上所述，利用ND-FISH技術(shù)可以檢測(cè)小麥染色體的結(jié)構(gòu)差異，反映染色體的重組情況，進(jìn)行小麥品種系譜跟蹤，明確小麥染色體組成及遺傳背景，為進(jìn)一步的分子標(biāo)記分析提供可靠的參考。