李亞飛，陽文龍，顧晶晶，張愛民，，詹克慧

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心, 河南鄭州 450002；2.中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所/植物細(xì)胞與染色體工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100101)

GRAS基因是一類轉(zhuǎn)錄因子基因，參與調(diào)控植物的生長發(fā)育[1]，由GAI(gibberellic acid insensitive)、RGA(repressor of GAI-3 mutant)和SCR(scarecrow) 3個(gè)家族成員命名。早期認(rèn)為GRAS基因家族是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子基因家族，然而，近期一項(xiàng)研究表明該基因家族最早存在于細(xì)菌基因組中，并提出GRAS基因家族歸屬于Rossmann折疊甲基轉(zhuǎn)移酶超家族[2]。典型的GRAS蛋白至少含350個(gè)氨基酸殘基[1]，GRAS基因編碼的蛋白通常是由可變的N末端序列和高度保守的C末端組成，其C端包含LRⅠ(leucine-rich region Ⅰ)、VHⅡD、LRⅡ(leucine-rich region Ⅱ)、PFYRE和SAW共5個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域[3]。VHⅡD結(jié)構(gòu)域是GRAS蛋白的核心結(jié)構(gòu)域，存在于所有家族成員中，其中只有組氨酸和天冬氨酸是絕對(duì)保守的。目前，對(duì)該基因家族成員的鑒定工作相繼在擬南芥、水稻、楊樹和葡萄等幾個(gè)物種完成，在早期的擬南芥GRAS基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析中，將其分為8個(gè)亞家族，分別命名為DELLA、LS、SCR、SHR、PAT1、HAM、SCL9(LISCL)和SYN4/7[4]。隨后，GRAS基因家族被分為了10個(gè)亞家族，即：DELLA、AtLAS(LS)、AtSCR、AtSHR、AtPAT1、HAM、LISCL、AtSCL3、SCL4/7和DLT[5]，但是，在這些系統(tǒng)發(fā)育分析中，來自水稻的GRAS蛋白Os4和Os19未被分配到亞家族中去。近期，利用擬南芥、水稻、楊樹、桃樹、葡萄和番茄等物種的GRAS蛋白，通過序列分析構(gòu)建擬南芥、水稻和楊樹的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，將GRAS基因家族分為13個(gè)亞家族，分別為AtSHR、AtPAT1、AtSCR、AtSCL4/7、 AtLAS、Os19、HAM、Os4、Pt20、DLT、AtSCl3、DELLA和LISCL，其中，Os4、Os19和Pt20是新鑒定的亞家族，Pt20是楊樹特有的亞家族[1]。由于GRAS基因亞家族的多樣性，導(dǎo)致該基因家族功能的多樣性。研究表明，在植物的生長發(fā)育中，GRAS基因在植物激素、光、生物和非生物脅迫等多種生長調(diào)節(jié)和環(huán)境信號(hào)中發(fā)揮重要作用。例如，DELLA亞家族的AtGAI參與擬南芥中赤霉素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[6]。AtLAS控制擬南芥葉腋分生組織的形成[7]，番茄的Ls[8]和水稻的OsMOC1[9]也是AtLAS亞家族的一員，具有相同的功能。OsMOC1作為水稻分蘗的關(guān)鍵控制因子，在揭示水稻高產(chǎn)的分子機(jī)理上具有重要意義。SCL13參與光敏色素B(phyB)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在脫黃化過程中使胚軸拉長[10]。AtHAM1、AtHAM2和AtHAM3參與擬南芥頂端分生組織和葉腋分生組織的發(fā)育[11-13]。AtPAT1亞家族中的AtPAT1、AtSCL5、AtSCL21基因作為擬南芥光敏色素A信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的正向調(diào)控因子[14-15]。GRAS基因還參與植物對(duì)多種非生物脅迫的響應(yīng)，研究表明胡楊A(yù)tSCL4/7亞家族的PeSCL7過表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱和耐鹽性[16]；AtSCL14和TGA轉(zhuǎn)錄因子相互作用可促進(jìn)擬南芥逆境誘導(dǎo)基因的表達(dá)，增強(qiáng)其抗逆能力[17]。

總之，目前已經(jīng)對(duì)許多植物中的GRAS基因家族進(jìn)行了鑒定及系統(tǒng)分析，如擬南芥中鑒定出34個(gè)GRAS基因[1]，水稻60個(gè)[1]、楊樹106個(gè)[1]、番茄53個(gè)[18]。小麥作為世界上重要的糧食作物，對(duì)其生長發(fā)育起調(diào)控作用的GRAS基因是至關(guān)重要的。但由于小麥?zhǔn)钱愒戳扼w，基因組巨大且復(fù)雜，至今尚未見其GRAS基因家族的研究報(bào)道。因此，本研究利用小麥基因組信息通過生物信息學(xué)方法對(duì)小麥GRAS基因家族的組成在全基因組水平進(jìn)行鑒定，并進(jìn)一步對(duì)基因結(jié)構(gòu)、染色體分布、啟動(dòng)子順式作用元件、表達(dá)譜進(jìn)行分析，以期為后續(xù)小麥GRAS基因的功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 小麥GRAS基因的全基因組鑒定

參考邢光偉等對(duì)小麥LBD基因的全基因組鑒定方法[19]，從Ensembl Plants 數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/index.html)下載擬南芥、水稻和小麥蛋白序列數(shù)據(jù)庫并提取已報(bào)道的擬南芥34個(gè)GRAS蛋白序列和水稻的60個(gè)GRAS蛋白序列。通過BLAST構(gòu)建小麥蛋白序列本地?cái)?shù)據(jù)庫，將擬南芥和水稻的GRAS蛋白序列作為query序列進(jìn)行BLASTP比對(duì)(E-value<1E-5)，獲得這些序列的同源序列并刪除其中的重復(fù)序列。同時(shí)，在Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)下載GRAS保守結(jié)構(gòu)域(PF03514)作為模板序列，利用HMM3.0比對(duì)得到含有保守結(jié)構(gòu)域的蛋白序列。將上述兩種比對(duì)方法獲得的候選蛋白序列合并，去除重復(fù)序列。進(jìn)一步利用Pfam序列搜索(http://pfam.xfam.org/)、SMART序列分析(http://smart.embl-heidelberg.de/)和HMMER序列分析(https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscan)驗(yàn)證候選蛋白是否含有GRAS保守結(jié)構(gòu)域，刪除不含或者缺失GRAS結(jié)構(gòu)域的候選基因，最終獲得小麥GRAS基因。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建和基因結(jié)構(gòu)分析

利用Clustal_W工具將擬南芥、水稻和小麥GRAS蛋白序列進(jìn)行多重比對(duì)，將比對(duì)結(jié)果放入MEGA7.0軟件，在p-distance模型、Bootstrap參數(shù)1000和成對(duì)刪除選項(xiàng)下采用鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。從Ensembl Plants 數(shù)據(jù)庫下載的小麥基因組數(shù)據(jù)用于提取小麥GRAS基因的DNA query和CDS query，利用在線軟件GSDS2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析。

1.3 小麥GRAS基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析、二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和亞細(xì)胞定位

利用Expasy提供的Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)在線軟件計(jì)算小麥GRAS蛋白的氨基酸長度、分子量和等電點(diǎn)。利用SOPMA在線軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page= npsa_sopma.html)預(yù)測分析α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲。借助Cello軟件[20]，利用小麥GRAS基因或蛋白序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位。

1.4 小麥GRAS基因染色體定位和順式作用元件分析

根據(jù)IWGSC(https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/)公布的最新小麥基因組數(shù)據(jù)(CS1.0) BLASTN構(gòu)建本地?cái)?shù)據(jù)庫，通過比對(duì)獲得小麥GRAS基因在染色體上的物理位置。利用MG2C(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)在線軟件構(gòu)建小麥GRAS基因在染色體上的物理圖譜。利用Perl程序截取小麥各GRAS基因上游1.5 kb的DNA序列，并將其提交PlantCARE數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和NEWPLACE在線軟件(https://sogo.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/sogo.cgi?sid=&lang=en&pj=640&action=page&page =newplace)進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件的預(yù)測并手動(dòng)整理。

1.5 串聯(lián)重復(fù)和片段復(fù)制

小麥Rht-D1c(GRAS基因家族DELLA亞家族)的等位基因Rht-D1b是控制株高的關(guān)鍵基因，在其大于1 Mb區(qū)域發(fā)現(xiàn)該基因有兩個(gè)拷貝且為串聯(lián)重復(fù)(TSD)[21]。因此，在小麥GRAS基因大于1 Mb區(qū)域鑒定是否發(fā)生串聯(lián)重復(fù)事件。利用從Ensembl Plants同源基因數(shù)據(jù)庫下載的GRAS基因的共線性分析數(shù)據(jù)，鑒定小麥GRAS基因是否發(fā)生片段復(fù)制事件[22]。發(fā)生串聯(lián)重復(fù)和片段復(fù)制基因的非同義替換率(Ka)和同義替換率(Ks)的比值用軟件KaKs_Calculator2.0[23]進(jìn)行計(jì)算，預(yù)測分析基因CDS區(qū)的適應(yīng)性進(jìn)化。

1.6 小麥GRAS基因組織表達(dá)和逆境表達(dá)分析及部分GRAS基因的Real-time PCR驗(yàn)證

利用Wheat Exp數(shù)據(jù)庫(https://wheat.pw.usda.gov/WheatExp/)下載小麥5個(gè)組織或器官(根、莖、葉、穗和種子)、干旱脅迫(1 h、6 h)、熱脅迫(1 h、6 h)和干旱加熱脅迫(1 h、6 h)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)FPKM(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)值，作為表達(dá)分析數(shù)據(jù)。最后利用Morpheus(https://software.broadinstitute.org/morpheus/)在線軟件構(gòu)建基因表達(dá)熱圖。采用RNeasy Plant Mini Kit(QIANGEN，德國)提取小麥開花后15天的根、莖、葉、穗子和種子的RNA，使用FastQuant RT Kit(With g DNase)(QIANGEN，德國)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA第一條鏈合成，用于Real-time PCR 分析。Real-time PCR儀器型號(hào)為Roche LightCycler 480(Roche，瑞士)，使用試劑為Light Cycler 480 CYBR Green Mix(Roche，瑞士)，以Ta4045為內(nèi)參基因。PCR程序設(shè)置為：95 ℃ 5 min； 95 ℃ 10 s， 60 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，共45個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s，65 ℃ 1 min，40 ℃ 10 s。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥GRAS基因全基因組鑒定結(jié)果

根據(jù)擬南芥34個(gè)GRAS基因和水稻60個(gè)GRAS基因的蛋白序列，利用BLASTP和HMM比對(duì)搜索，在Ensembl Plants最新小麥基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定出169個(gè)GRAS候選基因。進(jìn)一步利用Pfam、SMART、HMMER結(jié)構(gòu)域搜索檢驗(yàn)GRAS候選基因是否含有完整結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)其中的16個(gè)GRAS基因有不完整的結(jié)構(gòu)域。例如在小麥GRAS候選基因(TRIAE_CS42_3B_TGACv1_223416_AA0781900)結(jié)構(gòu)域片段僅含有67個(gè)氨基酸，候選基因(TRIAE_CS42_5BL_TGACv1_408118_AA1361700) 結(jié)構(gòu)域只含有319個(gè)氨基酸，而其HMM模型顯示完整GRAS結(jié)構(gòu)域有374個(gè)氨基酸組成，認(rèn)為這些GRAS結(jié)構(gòu)域嚴(yán)重缺失的基因不屬于GRAS基因[24]，那些結(jié)構(gòu)域不完整的候選基因可能是假基因。最后，在小麥基因組中鑒定出153個(gè)GRAS基因，并根據(jù)基因在染色體上的位置命名。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建和基因結(jié)構(gòu)分析

為了構(gòu)建小麥GRAS基因家族的進(jìn)化樹，分別利用擬南芥、水稻和小麥34、60、153個(gè)GRAS基因蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分GRAS基因蛋白序列導(dǎo)致系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析的可靠性降低，因此我們刪除了導(dǎo)致可靠性降低的GRAS基因，最終利用擬南芥(33個(gè))、水稻(50個(gè))和小麥(134個(gè))GRAS基因進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析。結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可將GRAS蛋白分為12個(gè)亞家族，這些亞家族的命名參照前人的研究結(jié)果[25-26]進(jìn)行。小麥GRAS基因的12個(gè)亞家族分別為：AtSHR、AtPAT1、AtSCR、AtSCL4/7、AtLAS、Os19、HAM、Os4、DLT、AtSCL13、DELLA和LISCL。在12個(gè)亞家族中均包含擬南芥、水稻和小麥的GRAS基因，暗示GRAS基因的分化發(fā)生在單子葉和雙子葉分化之前。同時(shí)在進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)，小麥GRAS基因在亞家族中分布不均勻，亞家族LISCL中包含43個(gè)小麥GRAS基因，而亞家族DLT、Os19和AtSCL4/7中分別含有1、3、3個(gè)小麥GRAS基因。為了研究小麥GRAS基因結(jié)構(gòu)的多樣性和系統(tǒng)發(fā)生情況，僅對(duì)來自小麥的134個(gè)GRAS基因的蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果也分為12個(gè)亞家族(圖2)。在系統(tǒng)發(fā)育樹末端節(jié)點(diǎn)鑒定出45個(gè)同源基因?qū)虼?，例如Ta2BSGRAS37的同源基因Ta2DSGRAS45，Ta4ALGRAS77的同源基因Ta4BSGRAS93和Ta4DS111。這些同源基因在小麥GRAS基因中占到了75.8%。隨后，通過比較小麥GRAS基因結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)高達(dá)74.5%(114/153)的小麥GRAS基因沒有內(nèi)含子。此外，觀察發(fā)現(xiàn)，同一亞家族的小麥GRAS基因表現(xiàn)出相似的基因結(jié)構(gòu)。但也有例外，如Ta3ALGRAS51和Ta3BLGRAS55、Ta4ALGRAS72和Ta4BSGRAS94、Ta4DLGRAS98和Ta5ALGRAS116等具有不同的基因結(jié)構(gòu)，這可能是由于基因在進(jìn)化過程中內(nèi)含子的丟失或增加造成的。

小麥、擬南芥和水稻GRAS基因分別用黑色、紅色和藍(lán)色字體表示。

GRAS genes from wheat,Arabidopsisand rice are represented in black, red and blue fonts, respectively.

圖1 小麥、擬南芥和水稻GRAS基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹

Fig.1 Phylogenetic tree of GRAS genes in wheat,Arabidopsisand rice

圖2 小麥GRAS基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化和基因結(jié)構(gòu)

2.3 小麥GRAS基因編碼蛋白的理化性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析及亞細(xì)胞定位

蛋白序列一級(jí)結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)分析顯示，153個(gè)GRAS基因編碼區(qū)長度為1 083～5 130 bp，編碼含有361～1 710個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，分子量為39.9～192.9 kDa，等電點(diǎn)范圍為 4.73～ 9.33。不同亞家族間氨基酸數(shù)目和理化性質(zhì)存在一定的差異，如AtPAT1亞家族平均氨基酸殘基數(shù)目最多(803個(gè))，AtSCL3亞家族的氨基酸殘基數(shù)目最少(442個(gè))。除了少數(shù)幾個(gè)GARS基因氨基酸序列理論等電點(diǎn)在堿性范圍內(nèi)，其余都在酸性范圍內(nèi)，說明GRAS基因蛋白質(zhì)分子富含酸性氨基酸。SOPMA預(yù)測蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，小麥153個(gè)GRAS基因的氨基酸序列均含有α-螺旋、隨機(jī)卷曲、擴(kuò)展鏈和β-轉(zhuǎn)角，各GRAS基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量為31.1%～ 55.5%，隨機(jī)卷曲含量為27.4%～57.4%，擴(kuò)展鏈含量為7.1%～20.7%，β-轉(zhuǎn)角含量為2.8%～ 9.9%。同時(shí)，亞細(xì)胞定位顯示67個(gè)小麥GRAS基因定位在細(xì)胞核中，33個(gè)定位在細(xì)胞質(zhì)中，26個(gè)定位在葉綠體中，14個(gè)定位在線粒體中，12個(gè)定位在質(zhì)膜中，1個(gè)定位在過氧化物酶體中。

2.4 小麥GRAS基因染色體定位和順式作用元件分析

根據(jù)定位結(jié)果(圖3)，在小麥的A、B、D三個(gè)同源染色體組中，均含有51個(gè)GRAS基因，暗示小麥GRAS基因在小麥兩次自然雜交加倍過程中，同源染色體的保留和丟失在亞基因組間沒有明顯偏好性。GRAS基因在小麥A、B、D三個(gè)同源染色體組上分布是均勻的，而在不同染色體上分布不均勻，且與染色體長度無關(guān)。GRAS基因在1A、1B和1D，2A、2B和2D，3A、3B和3D，4A、4B和4D，5A、5B和5D，6A、6B和6D，7A、7B和7D的數(shù)目分別為9、6和8，8、9和8，6、5和5，16、18和16，7、8和7，2、2和3，3、3和4。其中，4A、4B和4D染色體上分布的GRAS基因最多(50個(gè))，在6A、6B和6D染色體上分布的GRAS基因最少(7個(gè))。

利用NEWPLACE在線軟件分析小麥GRAS基因啟動(dòng)子序列的順式作用元件，結(jié)果共鑒定到了56種267個(gè)順式作用元件，除了含有啟動(dòng)子基礎(chǔ)作用元件CAAT-Box、GATA-Box、TATA-Box等之外，還含有多種與激素應(yīng)答、組織特異性表達(dá)、脅迫誘導(dǎo)等相關(guān)的順式作用元件。其中，葉肉特異表達(dá)相關(guān)元件(CACTFTPPCA1)和細(xì)胞分裂素響應(yīng)元件(ARR1AT)在所有的小麥GRAS基因的啟動(dòng)子區(qū)域都檢測到，平均每個(gè)GRAS基因分別含有17.2和9.4個(gè)。小麥151個(gè)GRAS基因含有光照響應(yīng)元件GATA-Box，暗示小麥GRAS基因表達(dá)可能受光調(diào)節(jié)。

2.5 串聯(lián)重復(fù)和片段復(fù)制分析

分析發(fā)現(xiàn)小麥中含有13個(gè)串聯(lián)重復(fù)，例如Ta1ASGRAS7、Ta1ASGRAS8和Ta1ASGRAS9等基因簇存在串聯(lián)重復(fù)事件(圖3紅色字體為串聯(lián)重復(fù)基因)。每個(gè)串聯(lián)重復(fù)包含2～8個(gè)GRAS基因。其中4B染色體上有最大的串聯(lián)重復(fù)，包含8個(gè)GRAS基因。同時(shí)，在4D染色體上包含2個(gè)串聯(lián)重復(fù)?？傊?，小麥中有45個(gè)GRAS基因?yàn)榇?lián)重復(fù)，表明它們的起源涉及串聯(lián)重復(fù)事件。通過分析Ensembl Plants中小麥GRAS基因的同源基因，發(fā)現(xiàn)138個(gè)基因具有同源基因，表明GRAS基因起源于片段復(fù)制。利用KaKs_Calculator2.0 軟件，將發(fā)生串聯(lián)重復(fù)和片段復(fù)制的GRAS基因的CDS區(qū)進(jìn)行比對(duì)、YN法計(jì)算分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了Ta6DSGRAS136和Ta6DSGRAS137串聯(lián)重復(fù)基因簇的Ka和Ks均為0之外,其余的12個(gè)串聯(lián)重復(fù)GRAS基因簇和所有發(fā)生片段復(fù)制的同源基因簇的Ka均小于Ks。其中12個(gè)串聯(lián)重復(fù)的平均Ka/Ks為0.188～ 0.535，片段復(fù)制的平均Ka/Ks為0.037～0.523。根據(jù)串聯(lián)重復(fù)和片段復(fù)制的GRAS基因在密碼子水平上的Ka/Ks值，可以推測，除Ta6DSGRAS136和Ta6DSGRAS137串聯(lián)重復(fù)基因簇外，其余的GRAS基因受負(fù)選擇作用。

2.6 小麥GRAS基因組織表達(dá)和逆境表達(dá)分析及部分GRAS基因的Real-time PCR驗(yàn)證

利用Wheat Exp數(shù)據(jù)庫中小麥GRAS基因在種子、葉、根、穗和莖的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)小麥GRAS基因在不同的組織或器官的表達(dá)模式有明顯的差異(圖4a)。其中17個(gè)GRAS基因在種子中具有較高的表達(dá)量，41個(gè)GRAS基因在葉中高表達(dá)，53個(gè)GRAS基因在根中高表達(dá)，29個(gè)GRAS基因在穗子中高表達(dá)，21個(gè)GRAS基因在莖中表達(dá)量高。這些結(jié)果表明，在葉和根中高表達(dá)的GRAS基因多于穗和莖中表達(dá)的GRAS基因。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Ta2DSGRAS45和Ta2DSGRAS149在5個(gè)器官或組織中都是高表達(dá)；部分GRAS基因在某一組織或器官中明顯高表達(dá)，在其他4個(gè)器官或組織中低表達(dá)或無表達(dá)，例如Ta2ALGRAS25、Ta2ALGRAS26、Ta2BLGRAS32等在根中高表達(dá)，而在其他4個(gè)組織或器官中低表達(dá)，表明這些GRAS基因可能在小麥根部的形態(tài)建成中發(fā)揮重要作用。

圖3 小麥GRAS基因在染色體上的定位(紅色字體代表串聯(lián)基因簇)

a:熱圖表示小麥GRAS基因在不同組織中的表達(dá)；b:熱圖表示小麥GRAS基因在干旱及熱脅迫下的表達(dá)。D1和D6：干旱脅迫處理1 h和6 h；H1和H6：熱脅迫處理1 h和6 h；DH1和DH6：干旱加熱脅迫處理1 h和6 h。

a:Heatmap showing expression of wheat GRAS genes in different organs or tissues； b：Heatmap showing expression of wheat GRAS genes under drought and heat stress conditions. D1 and D6:Treatment for 1 h and 6 h under drought stress conditions; H1 and H6:Treatment for 1 h and 6 h under heat stress conditions; DH1 and DH6:Treatment for 1 h and 6 h under drought and heat stress conditions.

圖4 小麥GRAS基因在不同組織、干旱及熱脅迫下的表達(dá)

Fig.4 Expression profiles of wheat GRAS genes in different organs or tissues,

and under drought and heat stress conditions

圖5 根和種子發(fā)育相關(guān)的GRAS基因在不同組織或器官的相對(duì)表達(dá)量

同時(shí)，用RNA-seq數(shù)據(jù)分析小麥GRAS基因在熱和干旱脅迫下的表達(dá)情況。結(jié)果顯示(圖4b)，和對(duì)照相比，Ta3DSGRAS62、Ta1BSGRAS13、Ta1BSGRAS14、Ta1BSGRAS15、Ta5BLGRAS119、Ta5BLGRAS120和Ta5DLGR AS126在干旱處理1 h和6 h表達(dá)量沒有發(fā)生明顯變化，處于較低水平，當(dāng)熱處理1 h和6 h時(shí)表達(dá)量有所提高，當(dāng)干旱加熱處理6 h時(shí)，表現(xiàn)出明顯的上調(diào)表達(dá)。Ta4BSGRAS78、Ta6ASGRAS132、Ta6BSGRAS134、Ta6DSGRAS136、Ta6DSGRAS137、Ta7ASGRAS140在干旱6 h時(shí)表達(dá)量上調(diào)，表明它們?cè)诟珊得{迫響應(yīng)過程中可能發(fā)揮重要作用。此外，Ta4ALGRAS77、Ta4BLGRAS80、Ta2DSGRAS45、Ta2DSGRAS149、Ta4DLGRAS100與對(duì)照相比，干旱和熱脅迫處理前后表達(dá)量均未發(fā)生明顯變化，表明這些基因的表達(dá)可能不受干旱和熱脅迫的影響。

同時(shí)，用Real-time PCR技術(shù)對(duì)與根和種子發(fā)育相關(guān)的6個(gè)GRAS基因進(jìn)行了定量表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)。結(jié)果(圖5)表明，Ta1ALGRAS2、Ta1BLGRAS12、Ta1DLGRAS19、Ta2BLGRAS32和Ta5BLGRAS152在根中的表達(dá)量均高于莖、葉、穗和種子中的表達(dá)量，其結(jié)果和Wheat Exp數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)小麥GRAS基因在種子、葉、根、穗和莖中的表達(dá)一致。Ta4ALGRAS77在種子中的表達(dá)量高于根、莖、葉和穗中的表達(dá)量，其結(jié)果也驗(yàn)證了該基因在Wheat Exp數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)情況。

3 討 論

本研究首次對(duì)小麥的GRAS基因家族進(jìn)行了綜合分析，根據(jù)基因組注釋，在小麥中發(fā)現(xiàn)了153個(gè)GRAS基因，多于擬南芥(34個(gè))和水稻(60個(gè))GRAS基因家族成員的數(shù)目。這主要可能是因?yàn)樾←準(zhǔn)钱愒戳扼w，在A、B、D染色體組通常存在同源基因，同時(shí)，小麥GRAS基因家族發(fā)生了擴(kuò)張，最終導(dǎo)致小麥GRAS基因家族比擬南芥和水稻龐大。串聯(lián)重復(fù)和片段復(fù)制是植物基因家族擴(kuò)張的主要方式[22]，這些基因通過串聯(lián)重復(fù)和片段復(fù)制保留在植物基因組中，在對(duì)環(huán)境刺激的適應(yīng)性反應(yīng)中起重要作用[27-28]。早期主要是在擬南芥和水稻中對(duì)GRAS基因家族的擴(kuò)張方式進(jìn)行了分析[25]，本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)和片段復(fù)制是小麥GRAS基因家族主要的擴(kuò)張方式。

無內(nèi)含子或單個(gè)外顯子基因是原核生物基因的典型特征，然而它們?cè)谡婧松锘蚪M中也占很大的比例，例如無內(nèi)含子基因在擬南芥、水稻和扁豆基因中分別占21.7%、19.9%和18.9%[29]。真核生物基因組中的無內(nèi)含子基因可能來自古老原核生物基因水平轉(zhuǎn)移或已存在無內(nèi)含子基因的復(fù)制[30]。植物GRAS基因家族中的無內(nèi)含子成員可能起源于原核生物，然后在植物中廣泛復(fù)制?；騿?dòng)子區(qū)域的順式作用元件通過響應(yīng)不同外界環(huán)境信號(hào)來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄過程，進(jìn)而影響植物的生長發(fā)育[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，小麥GRAS基因啟動(dòng)子區(qū)域有56種267個(gè)順式作用元件，主要包括葉肉特異表達(dá)相關(guān)元件CACTFTPPCA1、光響應(yīng)元件GATABOX和干旱脅迫響應(yīng)元件MYB2CONSENSUSAT等，表明小麥GRAS基因在調(diào)節(jié)小麥生長發(fā)育、參與光及逆境脅迫等環(huán)境調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

Peng等[32]對(duì)擬南芥和水稻等的研究表明，DELLA亞家族的AtGAI基因參與擬南芥中赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究中的DELLA亞家族基因Ta4DSGRAS150和Ta4BSGRAS89在小麥的莖中高表達(dá)，而葉、穗、根和種子中表達(dá)量相對(duì)較低，暗示這兩個(gè)基因在小麥莖的伸長中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Ls是AtLAS亞家族的成員，在番茄的腋生分生組織中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。本研究中，Ta6ASGRAS132、Ta6DSGRAS136、Ta6DSGRAS137、Ta7ALGRAS138和Ta7BLGRAS141屬于AtLAS亞家族成員，它們?cè)诟械谋磉_(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在其他組織或器官中的表達(dá)量，暗示這些基因在小麥分蘗上具有重要作用，但是具體的功能還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。