徐 芳,潘嬙微,鄭加永,夏淑琦,陳玄宇,沈曉露

0 引言

宮腔黏連(Intrauterine adhesions,IUA)是引起月經(jīng)稀少、閉經(jīng)、不孕及早期自然流產(chǎn)的重要原因之一，是不孕不育的首要宮腔病因[1-2]。子宮內(nèi)膜功能隨體內(nèi)激素水平及月經(jīng)周期發(fā)生周期性增生和脫落，其功能自主恢復(fù)主要依靠基底細(xì)胞轉(zhuǎn)化，一旦子宮內(nèi)膜基底發(fā)生損傷，造成腺體的大量丟失，刺激成纖維細(xì)胞的大量增殖，使大量膠原蛋白聚集形成瘢痕，最終形成宮腔黏連，對女性子宮會造成嚴(yán)重?fù)p傷[3-4]。抗宮腔黏連瘢痕生長的藥物能大幅度降低宮腔黏連的發(fā)生率，提高其治愈率，將是宮腔黏連治療方案中的突破點。絲裂霉素C(Mitomycin C,MMC)作為經(jīng)典抗瘢痕形成藥物，能有效抑制中外胚層細(xì)胞的異常增生，因此,MMC極可能抗宮腔黏連瘢痕形成[5]。本研究通過觀察宮腔黏連對SD雌性大鼠子宮內(nèi)膜的影響，以及MMC對其PI3K/AKT通道相關(guān)蛋白的作用機制，從而發(fā)現(xiàn)宮腔黏連的有效的治療方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 選用健康清潔級的雌性SD大鼠40只，9～10周齡，體重約220～240 g，適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、實驗組1、實驗組2，每組10只。

1.2 實驗儀器及試劑 ELx808IU酶聯(lián)免疫檢測儀(US,Bio-Tek)，蛋白電泳及轉(zhuǎn)印儀(US,Bio-Tek)，絲裂霉素C注射液(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H19999025)，IGF-I(長春金賽藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字S20050024)，石蠟切片機(Leica,型號2235)，體視學(xué)顯微鏡(Leica,型號m205FA)；圖像分析系統(tǒng)Image-Proplus5.1(Media Cybemetics Inc.USA,型號41N5100-44800)，投射顯微鏡(HITACHI,JAPAN,型號H-7500)，LAS1000 CCD曝光檢測系統(tǒng)(Fujifilm,Tokyo,Japan)，兔抗PI3K多克隆抗體(Abcam,ab32089)，兔抗AKT多克隆抗體(Abcam,ab179463)，兔抗Bcl-2多克隆抗體(Abcam,ab32124)，兔抗Bax多克隆抗體(Abcam,ab232479)，兔抗IGF-I多克隆抗體(Abcam,ab232479)，無水乙醇溶液(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，伊紅染液水溶性(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)，蘇木素染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)，中性樹膠(Solarbio)

1.3 模型制備 適應(yīng)飼養(yǎng)1周后開始對模型組、實驗組1、實驗組2大鼠制備宮腔黏連模型。宮腔黏連模型制備參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-8]：用陰道涂片法確定雌性SD大鼠動情期，腹腔注射水合氯醛，經(jīng)腹部中線切口暴露右側(cè)子宮，子宮中下段做3 mm的縱向切口，用21號刀片刮除子宮內(nèi)膜直至宮壁明顯粗糙，清洗后縫合切口，構(gòu)建宮腔黏連模型。術(shù)中及術(shù)后3、5 d，模型組大鼠不做任何處理。實驗組1大鼠在術(shù)中給予1 mg/ml絲裂霉素C敷刮傷區(qū)域5 min，術(shù)后3、5 d分別用1 mg/ml的絲裂霉素C 0.2 ml進行宮腔灌注。實驗組2大鼠在實驗組1的用藥基礎(chǔ)上，再給予雌激素口服進行治療。對照組為正常雌性SD大鼠，不做任何處理。各組大鼠均于術(shù)后21 d處死，取出子宮組織。

1.4 檢測方法 各組大鼠用2%戊巴比妥鈉腹腔深度麻醉(0.2 ml/10 g)，剪開腹腔，取出子宮組織剪碎，一部分子宮組織用0.1 mol/L的PBS(pH 7.4)液30 ml沖洗，經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h后常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片(厚約4 μm)貼附于防脫載玻片上，60 ℃烤箱過夜干燥備用。一部分子宮組織迅速放入凍存管，存于-80 ℃冰箱進行Western blot檢測。

1.4.1 HE染色 石蠟切片65 ℃烘烤2 h；二甲苯Ⅰ脫蠟15 min；二甲苯Ⅱ脫蠟15 min；二甲苯Ⅲ脫蠟15 min；無水乙醇Ⅰ10 min；無水乙醇Ⅱ10 min；95%乙醇Ⅰ8 min；95%乙醇Ⅱ8 min；85%乙醇7 min；75%乙醇6 min；65%乙醇5 min；蘇木素染色8 min，流水沖洗3 min；0.1%鹽酸酒精分化2 s，流水沖洗3 min；氨水反藍(lán)2 min，流水沖洗3 min；伊紅染色8 min，流水沖洗3 min；70%乙醇脫水2 s；80%乙醇脫水2 s；95%乙醇脫水2 s；無水乙醇脫水2 s；二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各10 min；中性樹膠封片。HE 染色通過普通光學(xué)顯微鏡于400×物鏡下采圖，以觀察子宮組織細(xì)胞纖維化程度。

1.4.2 Western blot檢測 從-80 ℃冰箱中取出子宮組織，加入蛋白裂解液提取總蛋白，Bradford蛋白定量法對蛋白濃度進行測定，取100 μg總蛋白進行SDS-PAGE檢測，電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入p-AKT、p-PI3K、Bcl-2、Bax抗體(濃度1∶1 000)，4 ℃搖床孵育過夜，洗膜，膜與HPR標(biāo)記的抗體孵育1 h，ECL顯色，X膠片顯影。以GAPDH為內(nèi)參，分析相關(guān)蛋白的光密度值。

2 實驗結(jié)果

2.1 MMC對各組宮腔黏連大鼠子宮內(nèi)膜組織形態(tài)的影響 對照組大鼠子宮組織HE染色可見子宮內(nèi)膜的黏膜層為單層柱狀上皮細(xì)胞，黏膜下層可見大量腺體和血管，以及少量成纖維細(xì)胞，未見明顯炎性細(xì)胞。模型組大鼠HE染色可見細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，大量單層柱狀上皮細(xì)胞被上皮細(xì)胞覆蓋，黏膜下層腺體數(shù)量減少，細(xì)胞成纖維化增生增加。實驗組1、實驗組2大鼠HE染色可見細(xì)胞結(jié)構(gòu)輕度紊亂，出現(xiàn)部分成纖維增生細(xì)胞，單層柱狀上皮細(xì)胞增生明顯，腺體數(shù)量有不同程度增加，與模型組比較，細(xì)胞胞漿及細(xì)胞核染色程度較淺，細(xì)胞成纖維化增生數(shù)量明顯減少，其中以實驗組2大鼠最為顯著。見圖1。

圖1 MMC對各組宮腔黏連大鼠子宮內(nèi)膜組織形態(tài)的影響

2.2 MMC對各組宮腔黏連大鼠子宮組織中PI3K/AKT通道相關(guān)蛋白的影響 與對照組比較，模型組大鼠子宮組織中p-AKT、PI3K、Bcl-2蛋白均顯著升高，Bax蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，各實驗組大鼠p-AKT、PI3K、Bcl-2蛋白均顯著降低，Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；且實驗組2大鼠p-AKT、PI3K、Bcl-2蛋白含量明顯低于實驗組1，Bax蛋白含量明顯高于實驗組1(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 MMC對各組宮腔黏連大鼠PI3K/AKT通道相關(guān)蛋白的影響

表1 MMC對各組宮腔黏連大鼠PI3K/AKT通道相關(guān)蛋白的影響

注：與對照組比較，*P<0.01;與模型組比較，#P<0.05;與實驗組1比較，△P<0.05

3 討論

宮腔黏連是宮腔損傷后繼發(fā)感染引起子宮內(nèi)膜基底層細(xì)胞損傷，成纖維細(xì)胞過度增殖，形成瘢痕，最終形成宮腔黏連。宮腔黏連會引起患者月經(jīng)周期紊亂，甚至閉經(jīng)，對患者受孕及孕期造成嚴(yán)重影響[9-10]。有研究認(rèn)為，減輕對子宮內(nèi)膜的損傷能有效降低宮腔黏連的發(fā)生率[11]。目前，臨床上常采用宮腔鏡下宮腔黏連分離術(shù)對黏連組織進行分離，并剝離增生瘢痕組織，暴露內(nèi)膜基底層及腺體[12-13]。術(shù)后可放置宮內(nèi)節(jié)育器、Foley導(dǎo)尿管、COOK球囊等將分離后的兩側(cè)宮壁病灶區(qū)隔開預(yù)防再次黏連[14]。研究發(fā)現(xiàn)，宮腔鏡宮腔黏連剝離術(shù)后給予激素治療，可刺激基底層細(xì)胞及腺體增生遷移，能有效降低宮腔黏連的發(fā)生率，改善患者月經(jīng)狀況[15-17]。目前，治療宮腔黏連主要通過促進子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖，但通過促進黏連使成纖維細(xì)胞凋亡抑制宮腔黏連的研究較少。PI3K/AKT通路參與多種生物信息的傳導(dǎo)，參與調(diào)控細(xì)胞周期、啟動凋亡和細(xì)胞侵襲性等。PI3K主要由p85和p110組成，受多種細(xì)胞分子和理化因子激活，從而激活下游因子AKT。AKT是PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心，下游因子有NF-κB、VEGF、FOXO、BAD、mTOR、Bcl-2等，參與多項生物學(xué)事件，調(diào)控細(xì)胞存活及凋亡等。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K/AKT信號通路可有效降低宮腔黏連的發(fā)生率，而MMC可通過抑制PI3K/AKT信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[18]。研究證實，MMC可誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞凋亡。MMC抗代謝、抗增殖，能有效抑制細(xì)胞增殖，尤其是抑制成纖維細(xì)胞增殖，可抑制成纖維細(xì)胞形成膠原蛋白，很大程度上降低了黏連的發(fā)生率[19-20]，其作用機制與通過抑制PI3K/AKT信號通路有關(guān)[21-22]。已有研究發(fā)現(xiàn)，雌激素可顯著降低卵巢早衰大鼠相關(guān)的ERβ、PI3K、AKT及mTOR、mRNA含量，這與上調(diào)PI3K/AKT和mTOR信號通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平有關(guān)；亦有研究發(fā)現(xiàn)，雌激素可直接激活信號通路,促進細(xì)胞增生，下調(diào)子宮內(nèi)膜癌組織中PR表達(dá)[23-25]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠子宮組織形態(tài)細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，大量單層柱狀上皮細(xì)胞被上皮細(xì)胞覆蓋，黏膜下層腺體數(shù)量減少，細(xì)胞成纖維化增生增加；兩個實驗組大鼠細(xì)胞結(jié)構(gòu)輕度紊亂，出現(xiàn)部分成纖維增生細(xì)胞，單層柱狀上皮細(xì)胞增生明顯，腺體數(shù)量具有不同程度增加，說明MMC可抑制成纖維細(xì)胞增生，促上皮細(xì)胞再生及腺體恢復(fù)。本研究通過Western blot檢測MMC對宮腔黏連大鼠子宮組織中p-AKT、PI3K、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組大鼠p-AKT、PI3K、Bcl-2蛋白均顯著升高，Bax蛋白表達(dá)顯著降低。實驗組2大鼠p-AKT、PI3K、Bcl-2蛋白含量明顯低于實驗組1，Bax蛋白含量明顯高于實驗組1。進一步說明MMC聯(lián)合雌激素通過誘導(dǎo)相關(guān)受體將酪氨酸蛋白酶激活，誘導(dǎo)PI3K活化，通過信號傳導(dǎo)至AKT，激活A(yù)KT，AKT中的PH結(jié)構(gòu)可以特異識別PI3K產(chǎn)物，二者的高親和力使AKT向細(xì)胞膜聚集，進一步激活。AKT進入胞質(zhì)胞核影響細(xì)胞因子如BAD、mTOR、Bcl-2等，引起后續(xù)的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究通過建立SD大鼠機械損傷宮腔黏連模型，在動物實體水平驗證MMC對宮腔黏連大鼠PI3K/AKT信號通路的調(diào)節(jié)作用，通過抑制PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜中成纖維細(xì)胞凋亡，降低膠原蛋白分泌，降低宮腔黏連的發(fā)生率，為后期在細(xì)胞水平分析MMC抗纖維化及評估藥物安全性提供支持。