李 剛，鄭君華，徐 斌，凌 杰，邱 偉，王永兵

0 引言

結(jié)直腸癌(CRC)是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一[1]，早期診斷發(fā)現(xiàn)，大約有25%的CRC患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，另有50%的患者會(huì)發(fā)展為轉(zhuǎn)移[2]。雖然新的細(xì)胞毒性和分子靶向試劑可以改善CRC患者的整體存活率，但是復(fù)發(fā)和失敗的速率仍然很高。

血管生成不僅為腫瘤的生長(zhǎng)提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，其對(duì)于轉(zhuǎn)移、腫瘤細(xì)胞向附近組織或遠(yuǎn)處器官的遷移也是必需的[3]?？寡苌傻闹委煵呗砸呀?jīng)成為重要的抗腫瘤(尤其是轉(zhuǎn)移性腫瘤)治療方法之一。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在大多數(shù)癌細(xì)胞中過度表達(dá)，已成為抗血管生成治療的主要靶點(diǎn)[4]。人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(HER2)是表皮生長(zhǎng)因子受體家族的一員，與VEGF誘導(dǎo)的實(shí)體腫瘤血管形成呈正相關(guān)[5]。血管生成生長(zhǎng)因子HER2-VEGF在許多不同類型的惡性腫瘤中過表達(dá)，促進(jìn)了多種類型細(xì)胞的腫瘤血管生成[6-7]。

他汀類藥物是3-羥基-3-甲基戊二醛輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，通過阻止HMG-CoA轉(zhuǎn)化為甲戊二酸酯來降低膽固醇合成。他汀類藥物主要用于治療高脂血癥，以減少心血管疾病，但近年研究表明，他汀類藥物對(duì)包括癌癥在內(nèi)的多種疾病都有治療作用，通過參與血管生成、增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移相關(guān)途徑發(fā)揮抗癌作用。有報(bào)道，辛伐他汀通過抑制NF-κB調(diào)控胃癌血管生成和轉(zhuǎn)移，強(qiáng)化卡培他濱對(duì)胃癌的治療效果[8]；通過阻止HIF-1誘導(dǎo)的血管生成因子抑制乳腺癌的血管生成[9]。然而，辛伐他汀是否會(huì)影響CRC的血管生成未見相關(guān)研究。本研究旨在探討辛伐他汀對(duì)CRC細(xì)胞血管生成的影響，并初步探討其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 CRC細(xì)胞株(HCT116、HT-29、LoVo、SW480、Caco-2)以及人類臍帶內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)均購(gòu)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)。HCT-116和HT-29細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中；SW480、LoVo和Caco-2細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；HUVECs在內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基2中培養(yǎng)。所有細(xì)胞株都在37 ℃、5% CO2的恒溫箱中培養(yǎng)。

1.2 裸鼠移植瘤模型 本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)上海健康醫(yī)學(xué)院附屬上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院批準(zhǔn)。將2.0×106HCT-116和LoVo細(xì)胞通過皮下注入BALB/c小鼠左后側(cè)。9 d后，將小鼠隨機(jī)分為2組(每組8只)，治療組小鼠注射辛伐他汀50 mg/(kg·d)，對(duì)照組每日注射0.1 ml磷酸鹽緩沖鹽水。每4 d用卡尺監(jiān)測(cè)腫瘤體積，根據(jù)下列公式計(jì)算：體積=長(zhǎng)度×寬度2×0.5。4周后處死小鼠，對(duì)腫瘤組織進(jìn)行免疫組化分析。

1.3 收集腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基(TCM) 1.0×106個(gè)HCT-116或LoVo細(xì)胞接種于6孔板中，采用0.2 μg辛伐他汀或HRG-β1(50 ng/ml)或辛伐他汀+HRG-β1共同預(yù)處理72 h。孵育后，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基在2 000 r/min下離心10 min，去除細(xì)胞碎片，-80 ℃儲(chǔ)存用于實(shí)驗(yàn)分析。

1.4 Matrigel小管形成實(shí)驗(yàn) Matrigel基質(zhì)膠在96孔板上涂覆30 min。將含12 000個(gè)HUVECs的無血清培養(yǎng)基或75% TCM加入到各個(gè)小室中孵育12 h。采用垂直顯微鏡記錄小管圖像，使用ImageJ 2x軟件測(cè)量血管網(wǎng)絡(luò)的長(zhǎng)度。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn) HUVECs接種于含有200 μl TCM的96孔小室中。過夜孵育后，每個(gè)小室加入20 μl MTT試劑。4 h后移除培養(yǎng)基，并加入150 μl二甲基亞砜，使紫色沉淀物完全溶解。輕輕搖動(dòng)10 min后，使用微板讀出器測(cè)定每個(gè)孔490 nm處的光學(xué)密度值。

1.6 遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 采用傷口愈合試驗(yàn)來評(píng)估細(xì)胞遷移。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%匯合時(shí)，用無菌移液管尖端在細(xì)胞單層上建立一個(gè)傷口。細(xì)胞洗2次后，用含有50 μg辛伐他汀的無血清培養(yǎng)基，或者含有50 ng/ml HRG-β1的無血清培養(yǎng)基，或者含有辛伐他汀和HRG-β1的無血清培養(yǎng)基重新培養(yǎng)，預(yù)處理12 h。最后用光學(xué)顯微鏡觀察傷口閉合情況并拍照。

Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。稀釋Matrigel基質(zhì)膠添加到小室中孵化。然后將懸浮在150 μl無血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞添加到上室中，將含50 μm辛伐他汀的無血清培養(yǎng)基，或50 ng/ml HRG-β1的無血清培養(yǎng)基，或其混合物添加到下室。24 h后，用棉簽刮掉上室中的非侵入細(xì)胞。侵入細(xì)胞用4%的聚氧甲基苯乙烯固定15 min，然后用晶體紫色染色10 min。最后，6個(gè)隨機(jī)區(qū)域的染色細(xì)胞在顯微鏡下計(jì)數(shù)并拍照。

1.7 Western blot 腫瘤組織或細(xì)胞在液氮中粉碎，RIPA裂解液裂解蛋白提取上清液。提取蛋白質(zhì)并使用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)膜后孵育抗體，ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)抗體。

1.8 免疫組織化學(xué)分析 將腫瘤標(biāo)本嵌在石蠟中，隨后切成4 μm厚的切片，用內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31對(duì)腫瘤切片進(jìn)行免疫標(biāo)記，觀察腫瘤組織中的血管形成情況。

2 結(jié)果

2.1 HER2和VEGF蛋白在CRC細(xì)胞株中的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，p-HER2、VEGF在LoVo、SW480、HCT116細(xì)胞中表達(dá)升高，在HT-29和Caco-2細(xì)胞中表達(dá)降低。見圖1。結(jié)果表明，致癌因子HER2表達(dá)與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)，提示HER2參與CRC血管生成可能與VEGF相關(guān)。

2.2 辛伐他汀抑制CRC血管生成 TCM中培養(yǎng)的HUVECs比在無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)具有更長(zhǎng)的管狀結(jié)構(gòu)(圖2A)。然而，辛伐他汀預(yù)處理的TCM培養(yǎng)的HUVECs小管的長(zhǎng)度較未處理的小管產(chǎn)生明顯減少，但比在無血清培養(yǎng)基中產(chǎn)生的小管稍長(zhǎng)。HUVEC的增殖是血管生成的一個(gè)關(guān)鍵因素，通過MTT法檢測(cè)HUVEs活力，結(jié)果顯示，辛伐他汀能夠顯著阻斷CRC細(xì)胞培養(yǎng)基，促進(jìn)HUVECs增殖(圖2B)。結(jié)果提示，辛伐他汀可能抑制HER2+CRC細(xì)胞中血管生成信號(hào)的分泌。

2.3 辛伐他汀對(duì)腫瘤血管生成和HER2活性的抑制作用 與對(duì)照組相比，辛伐他汀治療組中CD31染色明顯降低(圖3A)。辛伐他汀治療可以抑制腫瘤的血管生成，降低微血管密度。辛伐他汀明顯降低p-HER2在腫瘤組織中表達(dá)水平(圖3B)。Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)辛伐他汀能夠降低p-HER2在細(xì)胞中蛋白表達(dá)(圖3C)。然而，HER2 mRNA分子水平?jīng)]有受到影響(圖3D)。此外，辛伐他汀治療后，腫瘤重量和腫瘤體積明顯低于對(duì)照組(圖3E、圖3F)。結(jié)果表明，HER2參與了辛伐他汀抑制腫瘤生長(zhǎng)和血管生成過程。

2.4 辛伐他汀體外阻斷HRG-β1/HER2-誘導(dǎo)的血管生成 辛伐他汀顯著抑制HUVECs遷移、侵襲、血管生成和增殖能力，而HRG-β1處理HCT-116細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)HUVECs遷移、侵襲、血管生成和增殖能力。辛伐他汀明顯阻止了HRG-β1對(duì)細(xì)胞遷移、侵襲、血管生成和增殖能力的影響。結(jié)果表明,辛伐他汀能夠阻斷HRG-β1/HER2-誘導(dǎo)的體外血管生成。見圖4。

2.5 VEGF抑制劑參與辛伐他汀誘導(dǎo)減少血管生成過程 圖5A、圖5B結(jié)果顯示，VEGF在辛伐他汀處理組的表達(dá)較對(duì)照組明顯降低；VEGF在HRG-β1處理組的表達(dá)較對(duì)照組升高，而辛伐他汀降低了HRG-β1誘導(dǎo)的VEGF表達(dá)。貝伐單抗(BEV)、HRG-β1或者兩者共同處理CRC細(xì)胞，其細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVECs，即使HG-β1存在，BEV也能夠顯著抑制HUVECs增殖(圖5C)。此外，辛伐他汀可以阻斷VEGF誘導(dǎo)的HUVECs增殖(圖5D)。

3 討論

近年來，有學(xué)者認(rèn)為，他汀類藥物是潛在的癌癥治療藥物。多項(xiàng)研究表明，他汀類藥物的抗癌活性是通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。例如，洛伐他汀降低胰腺癌的腫瘤生長(zhǎng)以及抑制胃癌細(xì)胞增殖[10-11]；甲伐他汀抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[12]；辛伐他汀抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖和遷移[13]。辛伐他汀通過上調(diào)PEA3、降低HER2表達(dá)而誘導(dǎo)HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞凋亡[14]。辛伐他汀可能通過激活HIF-1缺氧的上游調(diào)控者，促進(jìn)或抑制血管生成，其還會(huì)干擾炎癥下游的血管生成信號(hào)[15]。

圖1 HER2和VEGF蛋白在CRC細(xì)胞中的表達(dá)

圖2 辛伐他汀抑制CRC血管生成

圖3 辛伐他汀對(duì)腫瘤血管生成及HER2活性的影響

注：A.免疫組化染色CD31+在腫瘤組織中表達(dá)，定量腫瘤切片微血管密度；B、C.p-HER2在腫瘤組織(B)和腫瘤細(xì)胞(C)中蛋白表達(dá)；D.檢測(cè)p-HER2 mRNA在腫瘤組織中表達(dá)；E.腫瘤重量；F.腫瘤體積

HER2屬于EGFR家族的一員，在CRC細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，與腫瘤內(nèi)VEGF相關(guān)的血管形成呈正相關(guān)。VEGF是一種生理和病理上的新血管化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，參與HER2引起的腫瘤細(xì)胞血管生成[16]。在本研究中，我們首先檢測(cè)了HER2和VEGF在CRC細(xì)胞系中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HER2和VEGF在這些細(xì)胞中表達(dá)均上調(diào)，特別是在HCT-116和LoVo細(xì)胞中。此外，本研究顯示辛伐他汀在體內(nèi)和體外抑制HER2信號(hào)通路以及腫瘤血管生成。結(jié)果表明，辛伐他汀抑制血管生成可能是通過抑制HER2的表達(dá)而發(fā)生。

HRG-β1是表皮生長(zhǎng)因子家族中的一員，由間充質(zhì)細(xì)胞分泌，并能通過轉(zhuǎn)運(yùn)和磷酸化促進(jìn)HER3或HER4形成異二聚體來間接激活HER2[17]。HER2過表達(dá)通過降低配體分離率大大增強(qiáng)了HRG與受體的結(jié)合親和力，而HER2降低則減弱了配體結(jié)合親和力與HER2信號(hào)。本研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀通過抑制高水平p-HER2腫瘤細(xì)胞的血管生成細(xì)胞因子的分泌，顯著損害了HRG-β1誘發(fā)的血管生成。即使在低HER2水平下，HRG-β1也可以通過上調(diào)VEGF表達(dá)促進(jìn)腫瘤血管生成。此外，在HRG-β1的孵育下，BEV可以顯著抑制CRC細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞增殖。在腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中加入辛伐他汀，可以阻斷VEGF對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。研究表明，VEGF參與了HER2誘導(dǎo)的CRC細(xì)胞血管生成過程，這可能使其成為辛伐他汀抑制腫瘤血管生成的重要靶點(diǎn)。

圖4 辛伐他汀體外阻斷HRG-β1/HER2-誘導(dǎo)的血管生成

圖5 VEGF抑制劑參與辛伐他汀誘導(dǎo)減少血管生成過程

總之，本研究結(jié)果表明，辛伐他汀通過調(diào)節(jié)HER2/VEGF軸來抑制腫瘤的血管再生。抗血管生成可以通過阻礙血管生成過程以及使腫瘤血管正?；鼓[瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感，提示辛伐他汀對(duì)異常腫瘤血管的重塑可增強(qiáng)許多現(xiàn)有治療方法的效果。