王培育, 鄭世仲, 葉 煒, 江金蘭, 顏沛沛, 李永清, 林玉玲

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002；2.福建省三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 福建 沙縣365000；3.寧德師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352100)

石斛屬(Dendrobium)植物兼具觀賞和藥用價(jià)值[1]，其中鐵皮石斛(D.catenatum)和金釵石斛(D.nobile)是較為普遍推廣的2個(gè)種。鐵皮石斛是藥用植物中應(yīng)用最廣的石斛屬植物之一，具有多種生物活性物質(zhì)[2-4]；因其烘干呈螺旋“楓斗”狀而備受推崇[5-7]。金釵石斛以莖入藥，性寒、味甘，具益胃生津、滋陰清熱等功效，已被列為重點(diǎn)保護(hù)中藥材[8]。野生石斛自然繁殖率低，對生長環(huán)境要求極為嚴(yán)苛，長期的過度采挖使野生石斛資源逐漸枯竭[9]。目前，市場上石斛種質(zhì)資源豐富且缺乏有效的鑒定技術(shù)，導(dǎo)致石斛品種選育嚴(yán)重滯后，石斛產(chǎn)業(yè)發(fā)展遭遇瓶頸[10]。種質(zhì)資源是品種選育的基礎(chǔ)，鑒定和分析石斛種間尤其是人工雜交后代的遺傳背景成為必需步驟。DNA分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物遺傳關(guān)系多樣性的分析，ISSR、RAPD、AFLP和SRAP等分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛用于石斛分類和進(jìn)化分析[11-14]，但其應(yīng)用受到數(shù)量和多態(tài)性影響，在可用標(biāo)記的數(shù)量、基因組覆蓋、多態(tài)性區(qū)分和重復(fù)性等方面受到限制。

隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展，鐵皮石斛的全基因組序列測序已完成，簡單重復(fù)序列標(biāo)記(simple sequence repeat, SSR)在石斛上開發(fā)和應(yīng)用也逐漸增加[15-16]。SSR標(biāo)記多態(tài)性高、重復(fù)性好、呈共顯性遺傳模式、PCR檢測方便并且能夠良好覆蓋基因組，在種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性等研究中發(fā)揮重要作用[17-18]。SSR標(biāo)記已應(yīng)用于石斛屬不同種間、種內(nèi)親緣關(guān)系研究以及雜種鑒定[19]，但對鐵皮石斛與金釵石斛雜交及回交未見報(bào)道。本研究對鐵皮石斛與金釵石斛的雜交F1代植株及以鐵皮石斛為母本回交后代植株進(jìn)行鑒定，對于提高育種效率與豐富種質(zhì)資源具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以鐵皮石斛和金釵石斛為親本，通過人工授粉進(jìn)行雜交，建立無菌系進(jìn)行單株株系分離，獲得雜交后代植株。進(jìn)一步以鐵皮石斛為母本，選取1株雜交后代為父本，通過人工授粉進(jìn)行回交，建立無菌系獲得回交后代單株株系。隨機(jī)抽取14株雜交F1代(編號(hào)為1～14)和18株回交1代(編號(hào)為15～32)，植株的嫩葉樣品保存于-20 ℃冰箱備用。試驗(yàn)材料均取自福建省三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取與檢測 采用改良SDS方法提取葉片DNA[20]，用酶標(biāo)儀檢測DNA濃度，利用濃度為1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度，并將各樣品稀釋至10 ng·mL-1，保存于4 ℃冰箱待后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.2.2 SSR引物獲得 選取24對SSR引物(表1)，其中21對引物由李永清等[21]提供，其中3對參考劉玉洋等[9]的方法合成。以上引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系：總體積10 mL，2×Taq Master Mix 5 mL，無菌水3.2 mL，SSR上下游引物各0.5 mL，cDNA 0.8 mL。PCR擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，引物退火溫度下復(fù)性1 min，72 ℃延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物于4 ℃下保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠上恒壓電泳(120 V，70 min)，Ultra GelRed核酸染料染色20 min，取出凝膠拍照保存。

1.2.4 雜種SSR鑒定 從候選的24對SSR引物中篩選出親本均有明顯條帶的引物，用于雜交與回交后代的真假種鑒定。后代擴(kuò)增圖譜中具有父本特征的條帶為真雜種，只有母本特征條帶的為假雜種。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA檢測

石斛樣品DNA的D260/D280值在1.80～1.99之間，用1%瓊脂糖凝膠檢測其DNA純度(圖1)。從圖1可見，DNA完整性較好、純度高、無拖帶彌散現(xiàn)象，表明可以滿足石斛SSR分子標(biāo)記對DNA質(zhì)量的要求。

2.2 引物篩選

將24對SSR引物組合到父母本中進(jìn)行擴(kuò)增，篩選出13對特異性SSR引物(圖2)，分別為：DNtSSR013、DNtSSR147、DNtSSR150、OA12、OA15、OA18、DM81、DM88、S122、DM123、DM178、DM186、DM199。以上引物可用于石斛雜交后代及回交后代群體真雜交種的鑒定。

表1 24對SSR引物組合名稱和序列Table 1 The name and nucleotide sequences of 24 SSR primers

圖1 供試石斛總DNA檢測結(jié)果Figure 1 Test results of total Dendrobium DNA extracted from both parents, putative F1 hybrids and backcross progenies

圖2 13對特異性SSR引物的篩選電泳Figure 2 Electrophoregrams of amplified SSR products from 13 SSR primers screening experiments

2.3 石斛雜交及回交群體SSR鑒定結(jié)果

利用篩選的13對引物對鐵皮石斛和金釵石斛兩親本、14個(gè)雜交F1代及18個(gè)回交1代進(jìn)行鑒定，獲得DNtSSR013、DNtSSR150、OA15和DM199共4對能夠有效鑒定石斛后代群體的SSR特異性引物。通過電泳條帶，可將后代群體區(qū)分為母本型、父本型、真雜交種型和缺失型。(1)引物DNtSSR013在250 bp處分別有母本和父本特征條帶各1條(圖3)。在14個(gè)雜交后代中，編號(hào)1、5、7、8、11、12、14的7個(gè)單株同時(shí)具有母本和父本的特征條帶，真雜交種率達(dá)到50%；編號(hào)3、4、6、9、10、13的6個(gè)單株為母本型，2號(hào)單株表現(xiàn)為缺失型。18個(gè)回交后代中，編號(hào)15、17、19、22、23、24、25、27、28、29、31的11個(gè)單株同時(shí)具有母本和父本的特征條帶，其余7個(gè)單株均表現(xiàn)為父本型，真雜交種率達(dá)100%，能夠擴(kuò)增出母本特異條帶的一共有11株，占61.1%。

圖3 引物DNtSSR013對鐵皮石斛×金釵石斛雜交及回交后代的擴(kuò)增結(jié)果Figure 3 PCR amplification products from (D.catenatum×D.nobile) F1 hybrids and backcross progenies by DNtSSR013 primer pair

(2)引物DNtSSR150在220 bp處分別有1條母本特征條帶和1條父本特征條帶(圖4)。14個(gè)雜交后代中，編號(hào)2、4、9、10、11、13的6個(gè)單株為真雜交種，真雜交種率達(dá)42.9%；編號(hào)5、8單株為母本型；其余6個(gè)單株為父本型。18個(gè)回交后代中，編號(hào)21、25、26、27的4個(gè)單株為真雜交種，編號(hào)15、17、20、22、23、24、28、31的8個(gè)單株為父本型，真雜交種率達(dá)66.7%，能夠擴(kuò)增出母本特異條帶的一共有10株，占55.6%。

圖4 引物DNtSSR150對鐵皮石斛×金釵石斛雜交及回交后代的擴(kuò)增結(jié)果Figure 4 PCR amplification products from (D.catenatum×D.nobile) F1 hybrids and backcross progenies by DNtSSR150 primer pair

(3)引物OA15在221～277 bp之間分別有2條母本特征條帶和1條父本特征條帶(圖5)。14個(gè)雜交后代中，編號(hào)3、4、7、9、10、11、13的7個(gè)單株為母本型，其余7個(gè)單株為父本型。18個(gè)回交后代中，編號(hào)17、18、22、23、24、25、27、28、29、30、31的11個(gè)單株為真雜交種；編號(hào)19、26、32的3個(gè)單株為父本型，真雜交種率達(dá)到77.8%；20號(hào)單株為缺失型，能夠擴(kuò)增出母本特異條帶的一共有14株。

(4)引物DM199在216～235 bp處分別有2條母本特征條帶和1條父本特征條帶(圖6)。14個(gè)雜交后代中，編號(hào)2、3、4、8、11的5個(gè)單株同時(shí)具有母本和父本的特征條帶，真雜交種率達(dá)到35.7%，其余9個(gè)單株均為母本型。18個(gè)回交后代中，編號(hào)17、18、20、21、24、25、26、27、28、30、31的11個(gè)單株為真雜交種，真雜交種率達(dá)到61.1%，能夠擴(kuò)增出母本特異條帶的一共有18株，占100%。

圖5 引物OA15對鐵皮石斛×金釵石斛雜交及回交后代的擴(kuò)增結(jié)果Figure 5 PCR amplification products of (D.catenatum×D.nobile) F1 hybrids and backcross progenies by OA15 primer pair

圖6 引物DM199對鐵皮石斛×金釵石斛雜交及回交后代的擴(kuò)增結(jié)果Figure 6 PCR amplification products of (D.catenatum×D.nobile) F1 hybrids and backcross progenies by DM199 primer pair

利用DNtSSR013、DNtSSR150、OA15和DM199 這4對特異性SSR引物，均可從14個(gè)雜交群體和18個(gè)回交后代中鑒定出父本特異位點(diǎn)。其中，14個(gè)雜交群體中有6個(gè)單株能夠同時(shí)被3對引物檢測出父本特異性位點(diǎn)，11個(gè)單株能同時(shí)被2對引物檢測出父本特異性位點(diǎn)，2個(gè)單株能同時(shí)被1對引物檢測出父本特異位點(diǎn)。18個(gè)回交后代中，有7個(gè)單株能同時(shí)被4對引物檢測出父本特異性位點(diǎn)，13個(gè)單株能同時(shí)被3對引物檢測出父本特異性位點(diǎn)，17個(gè)單株能同時(shí)被2對引物檢測出父本特異性位點(diǎn)，只有1個(gè)單株只能被1對引物檢測出父本特異位點(diǎn)。綜合來看，通過不同引物標(biāo)記鑒定，32個(gè)后代單株群體中共有28個(gè)單株能夠被檢測出父本特異位點(diǎn)，占87.5%；回交后代中，被4對引物同時(shí)鑒定出真雜種率達(dá)到38.9%，以此認(rèn)定為真性植株。

3 小結(jié)

石斛種類多但遺傳背景復(fù)雜，由于表觀上極其相似，很難從表觀上進(jìn)行有效鑒別[22]。基因型豐富多樣易導(dǎo)致石斛品種混淆直至泛濫。植物新品種的不斷更替推廣以及種間存在不同水平的基因流，使種質(zhì)資源鑒定工作難以開展，而SSR標(biāo)記技術(shù)以其自身的開發(fā)優(yōu)勢在植物種質(zhì)鑒定方面頗見成效。SSR分子標(biāo)記已經(jīng)在諸多物種上進(jìn)行品種選育工作的研究，如賈春蘭等[23]利用設(shè)計(jì)引物開發(fā)了42對SSR引物對玉米品種真?zhèn)涡?、純度進(jìn)行了鑒定；Yue et al[24]從研究的42個(gè)石斛雜交品種中開發(fā)了14個(gè)SSR多態(tài)性標(biāo)記，并將其用于石斛品種的鑒定。

本研究選取24對特異性SSR引物對鐵皮石斛、金釵石斛2個(gè)親本進(jìn)行擴(kuò)增，篩選出13對特異性SSR引物用于14個(gè)雜交F1代植株和18個(gè)回交后代植株真假雜交種的鑒定，僅有4對SSR引物能夠有效對石斛后代群體進(jìn)行鑒定。從32個(gè)后代單株群體中鑒定出28個(gè)真雜交種，真雜交種占后代單株群體的87.5%，并且回交后代中多數(shù)能夠檢測到母本的特異性條帶，回交植株真雜交種率達(dá)到38.9%。以上表明，SSR分子標(biāo)記能夠有效對石斛后代群體進(jìn)行真雜交種的鑒定，通過多引物標(biāo)記的方式能夠提高鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。進(jìn)一步通過回交技術(shù)，能夠獲得回交真性植株，豐富石斛種質(zhì)資源。然而，有部分后代單株表現(xiàn)出缺失型，推測是由于配子形成過程中發(fā)生堿基突變所引起。