楊菊鳳 ,劉琴華 ,杜迎春 ,李秀麗 ,田慧麗 ,郭瑞萍 ,溫青娜

(1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院動(dòng)物科技系,山東濰坊261061 ;2.河南科技學(xué)院高等職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453646 ;3.北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心,北京延慶 102100)

立克次氏體(Rickettsia)是一類大小介于細(xì)菌和病毒之間,且更接近于細(xì)菌的一類原核微生物,該類微生物革蘭染色陰性,專性寄生于真核細(xì)胞的原核單細(xì)胞微生物,為紀(jì)念發(fā)現(xiàn)洛杉磯斑點(diǎn)熱病原體的美國醫(yī)生Howard Taylor Ricketts 而命名[1]。立克次體屬(Rickettsia)的立克次體分為2 個(gè)群,即斑疹傷寒群立克次體(Typhus GroupRickettsiae)和斑點(diǎn)熱群立克次體(Spotted Fever GroupRickettsiae,SFGR)[1-3]。我國于1958 年首次在血清學(xué)上證實(shí)了斑點(diǎn)熱群立克次體的存在;并于1962 年從黑龍江虎饒地區(qū)東方田鼠(Microtus fortis)體內(nèi)首次分離到了斑點(diǎn)熱群西伯利亞立克次體(R.siberian)[1]。蜱是一類重要的醫(yī)學(xué)節(jié)肢動(dòng)物,專性寄生于哺乳類、爬行類、鳥類等動(dòng)物的體表。蜱傳斑點(diǎn)熱群立克次體疾病是一類由蜱傳播的自然疫源性疾病,由于動(dòng)物宿主的存在,它們在某一地區(qū)長期存在和流行,人進(jìn)入疫源地就可能被蜱叮咬而感染發(fā)病[4-5]。目前我國西北部省區(qū)優(yōu)勢媒介蜱種傳斑點(diǎn)熱立克次體的遺傳變異及其多樣性研究較少,是否存在新的SFGR 變種尚需詳實(shí)的分子流行病學(xué)資料。在此我們采用PCR 方法擴(kuò)增青海省優(yōu)勢蜱種青海血蜱(Haemaphysalis qinghaiensis)攜帶斑點(diǎn)熱群立克次體的外膜蛋白A(outer membrane protein A,OmpA)基因,并構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行斑點(diǎn)熱群立克次體的遺傳進(jìn)化分析,以明確青海血蜱斑點(diǎn)熱群立克次體帶菌率及遺傳進(jìn)化規(guī)律,為制定蜱傳斑點(diǎn)熱的有效防治措施提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 青海血蜱標(biāo)本采集及種類鑒定 我們于2013年5 月-2014 年10 月,在青海省天峻縣的新源鎮(zhèn)、陽康鄉(xiāng)、龍門鄉(xiāng)、快爾瑪鄉(xiāng)和舟群鄉(xiāng)等5 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的放牧牛、羊體表及野外生境中進(jìn)行青海血蜱標(biāo)本采集。在進(jìn)行放牧牛、羊體表蜱標(biāo)本采集的時(shí)候用鑷子輕輕夾取蜱蟲,小心拔下,防止蜱蟲頭節(jié)斷裂在動(dòng)物皮膚內(nèi),或用點(diǎn)燃的香煙頭灼燙蜱蟲臀部,待其自行從動(dòng)物體表離開,用鑷子夾取,放進(jìn)裝有昆蟲保存液的青霉素小瓶。我們采用布旗法進(jìn)行野外生境中青海血蜱標(biāo)本的采集。手持布旗在野外生態(tài)環(huán)境中拖拽布旗,行走50 m 左右時(shí),翻轉(zhuǎn)布旗,查找布旗表面的爬行蜱蟲,用鑷子夾取,放進(jìn)裝有昆蟲保存液的青霉素小瓶夾取蜱標(biāo)本放入盛有昆蟲保存液的采集瓶中[6-7]。

1.2 青海血蜱基因組DNA 提取 先將采集到的青海血蜱標(biāo)本進(jìn)行75%酒精消毒,然后無菌PBS 洗滌3 次,濾紙吸干。將采集的3～8 只未飽血或1～3只飽血的蜱標(biāo)本作為一個(gè)樣品池于白色乳缽內(nèi),加液氮研磨至粉末后移入1.5 mL 離心管中。采用商業(yè)化的基因組提取試劑盒提取基因組(北京元和醫(yī)療科技有限公司),-20 ℃保存?zhèn)溆肹5]。

1.3 SFGROmpA基因PCR 擴(kuò)增 根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)SFGR 190 kDOmpA基因合成引物序列。引物序列為:SFGR-F:5′-ATG GCG AAT ATT TCT CCA AAA-3′;SFGR-R:5′-GTT CCG TTA ATG GCA GCA TCT-3′,目的片段長度約為631 bp (Rr190.70 p/Rr190.701 n),上述引物序列由英濰捷基公司合成[5-6]。PCR 反應(yīng)體系(50 μL):SFGR-F(10 pmol/mL)和SFGR-R(10 pmol/mL)引物各1 μL;DNA 模板1 μL;2×TaqPCR Master Mix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)25 μL;無RNA 酶H2O 22 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s;72 ℃終延伸10 min。在本PCR反應(yīng)中我們同時(shí)設(shè)置陰性及陽性PCR 對(duì)照反應(yīng),以無菌PBS 為陰性對(duì)照,以感染SFGR 的蜱標(biāo)本DNA(來源于中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所)為陽性對(duì)照。

1.4 序列測定及分子系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 取SFGROmp A基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL 進(jìn)行瓊脂糖電泳;取經(jīng)電泳檢測陽性PCR 產(chǎn)物50 μL 送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測序;雙向測序結(jié)果經(jīng)DNA STAR 軟件包EDIT 程序編輯拼裝后,與GenBank 中發(fā)表的SFGROmp A基因序列進(jìn)行序列一致性比對(duì)分析,然后利用DNA MAN 及MEGA 6.06 進(jìn)行SFGR 同源性及遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR 電泳結(jié)果 我們于2013 年5 月-2014年10 月在青海省天峻縣的5 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的放牧牛、羊體表及野外生境中進(jìn)行青海血蜱標(biāo)本采集。在本次調(diào)查中我們共采集了5 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的23 個(gè)牛、羊養(yǎng)殖場及牛、羊放牧的野外生境蜱標(biāo)本,經(jīng)蜱形態(tài)學(xué)鑒定共收集青海血蜱(Haemaphysalis qinghaiensis)1 548只,分為316 個(gè)青海血蜱標(biāo)本樣品池。經(jīng)SFGROmpA基因PCR 檢測,在316 個(gè)青海血蜱標(biāo)本樣品池中共檢測到31 個(gè)樣品的陽性電泳條帶,與預(yù)期SFGROmpA基因電泳條帶位置一致,青海省天峻地區(qū)青海血蜱SFGR 帶菌率為9.8%。見圖1。

圖1 PCR 擴(kuò)增SFGR ompA 基因(約631 bp)

2.2 序列測定與結(jié)果分析 我們對(duì)本試驗(yàn)檢測到的31 個(gè)陽性SFGR 樣品的OmpA基因進(jìn)行雙向測序,序列一致性比對(duì)分析結(jié)果顯示,本試驗(yàn)獲得的31 個(gè)SFGROmpA基因序列一致性為100%。我們選取樣品編號(hào)為TJ013 的陽性樣品SFGROmpA基因序列進(jìn)行GenBank Blast 分析,并選取GenBank 中的SFGROmpA基因序列建立分子遺傳進(jìn)化樹進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析,結(jié)果顯示,TJ013 與立克次體福建分離株FUJ98(AF169629)處于同一分支;黑龍江立克次體HL-93(AF179364)及HL-054(AF179362)與日本立克次體YM(U43795)處于一個(gè)分支;且上述兩個(gè)分支又處于一個(gè)較大的分支。SFGROmpA基因序列同源性分析結(jié)果顯示,TJ013 與立克次體福建分離株FUJ98(AF169629)同源性最高,為95.49%;與其他斑點(diǎn)熱群立克次體的同源性小于95%,其中與黑龍江立克次體綏芬分離株HLJ-054 和虎林分離株HL-93 的同源性均為91.44%;和日本立克次體YM 同源性為90.24%,同一分支中同源性最低。

圖2 斑點(diǎn)熱群立克次體OmpA 基因遺傳進(jìn)化分析

3 討論

2006 年我國首次報(bào)道了安徽省蕪湖10 例無形體病確診病例,其中1 例死亡[8-9]。2007 年5 月-2010 年9 月期間,河南省共監(jiān)測和報(bào)告蜱蟲叮咬后出現(xiàn)發(fā)熱伴血小板減少綜合征、疑似無形體病病例557 例,其中18 例死亡。2011 年通過序列非依賴核酸擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合電子顯微鏡形態(tài)學(xué)分析,初步確定通過蜱蟲導(dǎo)致18 人死亡的病原為布尼亞病毒科白嶺病毒屬的一種新病毒,命名為發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV),本病毒由蜱進(jìn)行傳播,但其媒介蜱種范圍還不十分明確,導(dǎo)致了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[10]。蜱傳斑點(diǎn)熱群立克次體(SFGR)疾病是一類由蜱傳播的斑點(diǎn)熱群立克次體中病原性立克次體引起的[11],以急性發(fā)熱和皮疹為主要癥狀的自然疫源性疾病。該群立克次體為專性細(xì)胞內(nèi)寄生微生物,蜱、螨為其保存宿主,可經(jīng)期、經(jīng)卵垂直傳遞立克次體,保持其種群的連續(xù)性。此外,由于動(dòng)物宿主的廣泛存在,它們在某一地區(qū)長期存在和流行,人進(jìn)入疫源地就可能被蜱叮咬而感染發(fā)病。青海血蜱作為我國西北部地區(qū)特有的、優(yōu)勢的蜱種,探究青海血蜱SFGR 帶菌率具有十分重要的公共衛(wèi)生意義。

本試驗(yàn)通過分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的方法,對(duì)青海省天峻地區(qū)青海血蜱斑點(diǎn)熱群立克次體帶菌率進(jìn)行分子流行病毒調(diào)查及流行菌株的遺傳進(jìn)化分析和鑒定。結(jié)果顯示,在316 個(gè)青海血蜱標(biāo)本樣品池中共檢測到31 個(gè)樣品的陽性電泳條帶,與預(yù)期SFGROmpA基因電泳條帶位置一致,青海省天峻地區(qū)青海血蜱SFGR 帶菌率為9.8%。與以往的研究相比,青海血蜱SFGR 帶菌率高于河北省長角血蜱SFGR 的帶菌率(6.9%～7.42%),寄生蜱種的差異可能是SFGR 帶菌率差異的主要原因[4-5,11]。

OmpA和OmpB基因是編碼SFGR 外膜蛋白的基因,其中OmpA基因是SFGR 的特異性外膜蛋白基因,不同種SFGR 的外膜蛋白編碼基因OmpA表現(xiàn)出種的差異性,對(duì)斑點(diǎn)熱群立克次體的基因型或其亞型鑒定及分類具有重要意義。此外,OmpA基因還可以準(zhǔn)確把握SFGR 的遺傳變異特征。在本試驗(yàn)中我們通過構(gòu)建SFGROmpA基因分子系統(tǒng)進(jìn)化樹及基因序列一致性分析,獲得的31 個(gè)SFGROmpA基因序列一致性為100%,因此我們選取TJ013 作為代表菌株進(jìn)行后續(xù)的遺傳進(jìn)化分析;遺傳進(jìn)化分析表明,TJ013 與立克次體福建分離株FUJ98(AF169629)處于同一分支;黑龍江立克次體HL-93(AF179364)及HL-054(AF179362)與日本立克次體YM(U43795)處于一個(gè)分支;且上述兩個(gè)分支又處于一個(gè)較大的分支。提示東亞地區(qū)斑點(diǎn)熱群立克次體的外膜蛋白OmpA基因變異不大,親緣關(guān)系較近。但是SFGROmpA基因序列同源性分析結(jié)果顯示,TJ013 與立克次體福建分離株FUJ98(AF169629)同源性最高,為95.49%;與其他斑點(diǎn)熱群立克次體的同源性小于95%,其中與黑龍江立克次體綏芬分離株HLJ-054 和虎林分離株HL-93 的同源性均為91.44%;和日本立克次體YM 同源性為90.24%,同一分支中同源性最低。提示我們本次檢測到的斑點(diǎn)熱群立克次體可能是一個(gè)新種,且與福建立克次體具有較高的淵源,可能因?yàn)槭侨驓夂蜃兣沟脽釒У貐^(qū)范圍擴(kuò)大,一些原先僅限于該地區(qū)的病毒、細(xì)菌、寄生蟲等也出現(xiàn)在溫帶甚至寒帶。也有可能隨著人口的快速增長,人類活動(dòng)區(qū)域不斷向蜱蟲棲息地?cái)U(kuò)展,逼迫蜱蟲遷移,將“毒”帶入新的區(qū)域環(huán)境,在氣候和地理生態(tài)環(huán)境的雙重作用下引起核酸序列部分堿基的變異,導(dǎo)致斑點(diǎn)熱群立克次體新種的形成。

通過本次對(duì)青海省天峻地區(qū)青海血蜱SFGR 帶菌率的分子流行病學(xué)調(diào)查,明確了青海血蜱SFGR的帶菌率;遺傳進(jìn)化分析顯示本次檢測到的SFGR可能為一新種立克次體,為蜱傳斑點(diǎn)熱的防控提供基礎(chǔ)科學(xué)依據(jù)。