王 林 ,孫 丹 ,韋海濤 ,宋彥軍 ,周德剛 ,高曉龍 ,梅 力,馮小宇

(1.北京市動物疫病預(yù)防控制中心,北京大興102600 ;2.北京市獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京大興 102600)

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS),俗稱“豬藍(lán)耳病”,是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的病毒性傳染病[1]。2006 年,我國出現(xiàn)高致病性PRRSV 毒株,導(dǎo)致嚴(yán)重型PRRS 的暴發(fā),給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。

目前實(shí)驗(yàn)室用于檢測高致病性PRRSV 的分子生物學(xué)方法主要有RT-PCR 和熒光定量PCR,RTPCR 產(chǎn)物容易污染且只能定性檢測,熒光定量PCR做定量檢測時(shí)需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。微滴式數(shù)字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)作為第3 代PCR技術(shù),具有檢測復(fù)雜來源樣品中極低含量核酸分子和無須標(biāo)準(zhǔn)曲線直接絕對定量的檢測技術(shù)[4]。目前廣泛應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因作物成分檢測[5]和臨床抗病毒治療效果的評估[6]的研究領(lǐng)域中。本試驗(yàn)通過對微滴式數(shù)字PCR 檢測高致病性PRRSV 毒株的退火溫度、引物和探針濃度等反應(yīng)條件的優(yōu)化,以及特異性、敏感性、重復(fù)性和臨床樣本檢測的研究,建立了基于ddPCR 技術(shù)的高致病性PRRSV 的絕對定量檢測技術(shù),為高致病性PRRSV 的早期快速檢測提供了新的技術(shù)手段,也為北京市高致病性PRRS 的防控提供了技術(shù)支持。

1 材料

1.1 病毒 滅活的PRRSV 高致病性病毒和PRRSV 低致病性病毒由中國動物疫病預(yù)防控制中心提供。

1.2 臨床樣本 10 份臨床樣本為2016 年采集的北京豬場高致病性PRRS 病料。

1.3 儀器與試劑 QX100 微滴式數(shù)字PCR 儀、QX100 Droplet Generator、PX1 Plate Sealer、QX100 Droplet Reader、CFX96 Touch 熒光定量PCR 儀,均購自美國伯樂公司;NanoDrop 紫外分光光度計(jì),購自美國賽默飛公司;RNA 提取試劑盒,購自北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司;TaKaRa One-step primescript RT-PCR Kit,購自寶生物工程(大連)有限公司;One-step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes、Droplet generation oil for probe 和Droplet reader oil均,購自美國伯樂公司。pMD19-T 載體、TaqDNA聚合酶、DL-2000 DNA Marker、DNA 提取試劑盒、凝膠回收試劑盒,均購自寶生物工程(大連)有限公司。

2 方法

2.1 引物和探針 根據(jù)GenBank 已發(fā)表的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2(NSP2)基因序列,用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物和探針(表1),引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物和探針序列

2.2 病毒DNA/RNA 的提取 各取相應(yīng)的病毒液100 μL,根據(jù)北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司病毒RNA 提取試劑盒說明書操作步驟提取高致病性PRRSV 的總RNA,置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 微滴式數(shù)字PCR 微滴式數(shù)字PCR 試驗(yàn)使用的是伯樂公司的QX100 微滴式數(shù)字PCR 儀,主要包括微滴生成、PCR 擴(kuò)增和微滴讀取3 個主要試驗(yàn)步驟。

2.3.1 微滴生成 采用ddPCR Supermix for Probe試劑推薦的20 μL 體系,以相同濃度的病毒RNA 為模板,選用優(yōu)化好的上游、下游引物濃度和探針濃度,加入2 × One-step RT-ddPCR supermix 10 μL,25 mM Manganese acetate solution 0.8 μL(1 mM),加無RNA 酶水補(bǔ)齊至20 μL,在微滴生成卡中加入70 μL微滴生成油,將生成卡放入微滴生成儀,生成微滴。

2.3.2 PCR 擴(kuò)增 將生成的微滴轉(zhuǎn)移至96 孔板內(nèi),用PX1 熱封儀進(jìn)行封膜。將封好膜的96 孔板放在伯樂PCR 儀器上進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 的擴(kuò)增程序?yàn)?0 ℃反轉(zhuǎn)錄10 min; 95 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性10 s,退火50～60 ℃60 s,共40 個循環(huán);98 ℃10 min 結(jié)束反應(yīng)。

2.3.3 微滴讀取 將擴(kuò)增完的96 板放入QX100微滴讀取儀上,運(yùn)行QuantSoft 軟件,進(jìn)行微滴結(jié)果讀取。

2.4 微滴式數(shù)字PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化

2.4.1 退火溫度的優(yōu)化提取高致病性PRRSV RNA 為模板。然后在QX100 ddPCR 平臺上,ddPCR體系配方:4 × One-step RT-ddPCR Supermix 5 μL,RE 2 μL,DT 1 μL,上下游引物各1 μL,探針0.5 μL,RNase Free dH2O 7.5 μL,陽性模板2 μL,總體積20 μL(引物和探針的濃度均為10 μM)。做8個復(fù)孔,然后生成微滴,轉(zhuǎn)移到96 孔板內(nèi),封鋁膜。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?50 ℃反轉(zhuǎn)錄10 min;95 ℃預(yù)變性10 min;94 ℃變性30 s,50～60 ℃(儀器自動分布8 個溫度梯度)退火60 s,共40 個循環(huán);98 ℃10 min,升降溫速度都設(shè)2.5 ℃/s,結(jié)束反應(yīng)。上微滴數(shù)字PCR 檢測儀檢測。

2.4.2 引物和探針濃度的優(yōu)化 采用ddPCR Supermix for Probe 試劑推薦的20 μL 體系,以相同濃度的病毒RNA 為模板,分別對引物濃度和探針濃度組合(650 nM +150 nM、900 nM +250 nM 和1 150 nM +350 nM)和退火溫度(50 ℃、51 ℃、52 ℃、54 ℃、56 ℃、58 ℃、59 ℃、60 ℃)進(jìn)行優(yōu)化,重復(fù)進(jìn)行3 次試驗(yàn),求平均值,確定最佳的引物濃度、探針濃度和退火溫度。

2.5 微滴式數(shù)字PCR 特異性、重復(fù)性和敏感性試驗(yàn)

2.5.1 特異性試驗(yàn) 用建立的數(shù)字PCR 方法分別對PRRSV 高致病性毒株,PRRSV 低致病性毒株,豬圓環(huán)病毒2 型,豬傳染性胃腸炎病毒,豬流行性腹瀉病毒,豬瘟病毒和口蹄疫病毒進(jìn)行檢測,驗(yàn)證該方法的特異性。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 選取3 份高致病性PRRSV 陽性樣本與2 份陰性樣本,分別進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)與批間重復(fù)試驗(yàn),每份樣本重復(fù)檢測8 次,并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差及變異系數(shù)。

2.5.3 靈敏性試驗(yàn)及與熒光定量PCR(qPCR)比對試驗(yàn) 將0.8 ng/μL 的質(zhì)粒DNA 進(jìn)行10 倍稀釋,連續(xù)稀釋7 個梯度,編號1～7,分別在QX100 的平臺上進(jìn)行ddPCR 試驗(yàn)和熒光定量儀做熒光定量試驗(yàn),比較檢測方法的靈敏性。

2.6 臨床樣本的檢測 利用本試驗(yàn)建立的ddPCR方法對臨床上感染HP-PRRSV 的10 份樣本進(jìn)行檢測,同時(shí)設(shè)立陰性、陽性對照。

3 結(jié)果

3.1 退火溫度的優(yōu)化 分別計(jì)算溫度在50 ℃、51 ℃、52 ℃、54 ℃、56 ℃、58 ℃、59 ℃、60 ℃共8 個梯度,3 次重復(fù)試驗(yàn)測得標(biāo)準(zhǔn)樣品的平均值,結(jié)果分別為84.9、80.9、82.7、82.7、88.1、82.3、81.4、82.5拷貝/μL(圖1),在退火溫度為56 ℃時(shí),檢測樣品的拷貝數(shù)最多,所以確定最佳的退火溫度為56 ℃。

圖1 不同退火溫度檢測的拷貝數(shù)

3.2 引物和探針濃度的優(yōu)化引物和探針濃度的優(yōu)化采用3 組不同濃度的組合進(jìn)行篩選最佳反應(yīng)濃度,分別為第1 組(引物濃度650 nM+探針濃度150 nM)、第2 組(引物濃度900 nM+探針濃度250 nM)、第3 組(引物濃度1 150 nM+探針濃度350 nM)。結(jié)果顯示,第1 組、第2 組和第3 組檢測病毒拷貝數(shù)分別為0 拷貝/μL、13.8 拷貝/μL 和13.4 拷貝/μL,第2 組引物和探針濃度組合檢測的病毒拷貝數(shù)最多,所以確定最佳的引物和探針濃度分別900 nM 和250 nM(圖2)。

3.3 微滴式數(shù)字PCR 特異性和重復(fù)性試驗(yàn) 本試驗(yàn)建立的高致病性PRRSV 數(shù)字PCR 檢測方法分別檢測PRRSV 美洲型高致病性毒株,PRRSV 美洲型經(jīng)典株,豬圓環(huán)病毒2 型,豬傳染性胃腸炎病毒,豬流行性腹瀉病毒,豬瘟病毒,口蹄疫病毒,結(jié)果顯示,PRRSV 美洲型高致病性毒株檢測結(jié)果為129 拷貝/μL,其他均為0 拷貝/μL(圖3)。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示,3 次重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)小于5%,表明具有良好的重復(fù)性(表2)。

圖2 不同引物和探針濃度檢測的拷貝數(shù)圖

圖3 ddPCR 特異性驗(yàn)證拷貝數(shù)圖

表2 重復(fù)性試驗(yàn)

3.4 微滴式數(shù)字PCR 靈敏性試驗(yàn) 將連續(xù)倍比稀釋好的陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分別進(jìn)行qPCR 和ddPCR 試驗(yàn)。結(jié)果顯示,數(shù)字PCR 的R2值為0.999 1(圖4),線性關(guān)系良好,表明檢測方法可靠。ddPCR 靈敏度比qPCR 高10 倍,且能實(shí)現(xiàn)核酸含量的絕對定量(表3)。

表3 熒光定量PCR CT 值與數(shù)字PCR 拷貝數(shù)值比較

圖4 ddPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3.5 微滴式數(shù)字PCR 對臨床樣本中拷貝數(shù)的定量檢測應(yīng)用 對臨床上感染高致病性PRRSV 的10 份樣本,進(jìn)行微滴式數(shù)字PCR 定量檢測檢測結(jié)果分別為1 980、97 000、4 200、203、104 000、823、197、822、2 150和202 拷貝/μL,表明建立好的ddPCR 方法能對臨床樣本進(jìn)行絕對定量。

4 討論

更準(zhǔn)確和更靈敏的檢測技術(shù)是分子生物學(xué)的發(fā)展方向,而微滴式數(shù)字PCR 作為第3 代PCR,與第1 代普通PCR 和第2 代熒光定量PCR 相比,具有靈敏性更高和直接絕對定量的檢測優(yōu)勢。其主要原理是通過DNA 有限稀釋法和泊松分布的統(tǒng)計(jì)原則來準(zhǔn)確計(jì)算DNA 的濃度,能夠在復(fù)雜背景條件下檢測靶基因序列[7]。數(shù)字PCR 作為新一代分子診斷工具,已經(jīng)越來越廣泛應(yīng)用到產(chǎn)前診斷[8]、癌癥檢測[9]、病原檢測[4,10-11]、基因突變檢測[12]和轉(zhuǎn)基因研究[13]等。而利用ddPCR 對高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的研究和應(yīng)用相對較少。

本試驗(yàn)針對高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP2 基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針,并進(jìn)行了最佳反應(yīng)退火溫度、最佳引物濃度、最佳探針濃度、特異性試驗(yàn)、靈敏性試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)等一系列試驗(yàn),建立了高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒ddPCR 檢測方法。試驗(yàn)表明最佳的退火溫度為56 ℃,最佳引物濃度和探針濃度分別為900 nM 和250 nM。微滴式數(shù)字PCR 的檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 1,表明該方法檢測結(jié)果具有良好的線性關(guān)系和可信度。將建立的ddPCR方法與qPCR 方法進(jìn)行比較和分析,試驗(yàn)表明,ddPCR 最低檢測限度為3.5 拷貝/μL,靈敏度比qPCR 高10 倍,因此具有較高的靈敏度,在早期感染或潛伏感染診斷中具有巨大的潛力。特異性和重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明,ddPCR 具有良好的特異性,與其他豬常見病毒不發(fā)生交叉反應(yīng),且重復(fù)性較好。對10 份臨床樣品的檢測結(jié)果表明,ddPCR 可以對臨床樣品的病毒含量進(jìn)行絕對定量。因此,本試驗(yàn)建立的ddPCR 檢測方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、能夠快速檢測到極低的HP-PRRSV,適用于HP-PRRSV 的早期檢測和流行病學(xué)調(diào)查,為PRRSV 的防控和科學(xué)研究提供了有力的技術(shù)儲備。