溫峰琴 ,項(xiàng)海濤 ,郝寶成 ,邢小勇 ,包世俊 ,胡永浩

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州730070 ;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所,甘肅蘭州 730050)

犬細(xì)小病毒感染是由犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起的犬的一種急性傳染病,特征為出血性腸炎或非化膿性心肌炎,多發(fā)生于幼犬,病死率10%～50%[1]。

CPV 屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒亞科的Protopar-vovirus屬,與貓細(xì)小病毒(FPV),水貂腸炎病毒(MEV)和浣熊細(xì)小病毒(RaPV)均為食肉動(dòng)物原細(xì)小病毒1 的變種[2]。CPV 是一類結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的單鏈線狀DNA 病毒,病毒顆粒直徑約為25 nm,無囊膜,呈二十面體[3]。病毒基因組全長(zhǎng)為5 323 nt,含有2個(gè)ORF,5′端主要編碼早期轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)蛋白NS1 和NS2,3′端編碼晚期轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)蛋白,即病毒衣殼蛋白VP1 和VP2,VP2 是衣殼蛋白的主要成分,具有較強(qiáng)的免疫原性,可用于制備亞單位疫苗或DNA疫苗[4]。

由于犬細(xì)小病毒,尤其是VP2 基因容易發(fā)生變異,且在同一動(dòng)物體有時(shí)能夠檢測(cè)到幾種病毒變體,即共同感染[2],對(duì)VP2 序列的擴(kuò)增和分析有助于了解流行毒株的抗原和基因變異情況。由于VP2的突變和重組影響宿主范圍和受體結(jié)合的親和力,因此對(duì)毒株VP2 基因的監(jiān)測(cè)有助于了解流行株與疫苗株的關(guān)系及CPV 的進(jìn)化模式,本試驗(yàn)對(duì)蘭州分離的2 例犬細(xì)小病毒VP2 進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析及氨基酸變異分析,為犬細(xì)小病毒病的分子流行病學(xué)調(diào)查及防控提供了數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料 2 例犬細(xì)小病毒病患病犬糞便均來自蘭州某寵物醫(yī)院,采集時(shí)間分別為2017 年4 月和2017 年6 月。

1.2 試劑 2 ×TaqPCR Master Mix、病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒,購(gòu)自TIANGEN 公司;膠回收試劑盒,購(gòu)自O(shè)MEGA 公司;DL-2 000 DNA Marker,購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;pMD19-T Vector,購(gòu)自TaKaRa 公司;IPTG、X-gal、DH5α,購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 參照NCBI 數(shù)據(jù)庫犬細(xì)小病毒VP2 基因保守區(qū)設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長(zhǎng)的引物,引物序列包含酶切位點(diǎn),由金唯智生物科技有限公司合成。引物序列如下:

VP2-forward:5′ATACATATGAGTGATGGAGCAGTTCAACC 3′

VP2-reverse:5′TATGGATCCTTAATATAATTTTCTAGGTG 3′

1.3.2 病毒基因組DNA 提取 2017 年4 月分離的病毒株命名為CPV/canine/LZ/1/2017,2017 年7 月分離的病毒命名為CPV/canine/LZ/2/2017,按照TIANGEN 病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3VP2 基因的擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)體系:2 ×TaqPCR Master Mix 25 μL,ddH2O 23 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,模板1 μL,總體積50 μL。PCR 反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃1 min,53 ℃40 s,72 ℃90 s,30 次循環(huán);72 ℃10 min。擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳后切取目的條帶,用膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收。

1.3.4 連接與轉(zhuǎn)化 膠回收產(chǎn)物與pMD19-T 載體連接。連接體系為10 μL,其中SolutionI 5 μL;pMD19-T 載體2 μL;膠回收產(chǎn)物3 μL;16 ℃連接30 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100 μL 感受態(tài)大腸桿菌DH5α。冰浴30 min,42 ℃熱激45 s,冰浴2 min。在上述感受態(tài)細(xì)胞中加入950 μL 不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基37 ℃震蕩培養(yǎng)1 h。用移液器吸取100 μL培養(yǎng)液涂布含有IPTG、X-gal 和氨芐青霉素的LB 平板培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)12 -16 h。

1.3.5 陽性重組質(zhì)粒的鑒定 挑取平板中的白斑(陽性)于含氨芐青霉素的LB 肉湯中37 ℃搖床中培養(yǎng)8 h 至菌液渾濁;吸取少量菌液進(jìn)行菌液PCR 擴(kuò)增,PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)電泳,觀察是否出現(xiàn)目的條帶。取出現(xiàn)目的條帶的菌液1 mL,離心,棄上清,送金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

1.3.6 序列測(cè)定與分析:將臨床分離株VP2 基因序列與NCBI 中的24 株犬細(xì)小病毒及3 株貓細(xì)小病毒VP2 基因序列用MEGA7.0 進(jìn)行比對(duì)分析,并繪制遺傳進(jìn)化樹。用MegAlign 軟件分析核苷酸同源性,同時(shí)分析氨基酸變異情況。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1 700 bp,與預(yù)期一致,如圖1 所示。

圖1 犬細(xì)小病毒VP2 基因PCR 產(chǎn)物電泳

2.2 核苷酸遺傳進(jìn)化及同源性分析 測(cè)序結(jié)果顯示,2 株病毒VP2 基因大小為1 755 bp,CPV/canine/LZ/1/2017VP2 基因 NCBI 登錄號(hào)分別為MH155192,CPV/canine/LZ/2/2017VP2 基 因MH155193。遺傳進(jìn)化分析顯示,貓細(xì)小病毒和犬細(xì)小病毒明顯位于不同的進(jìn)化分支上,MH155192 與MF467233.1、JQ743891.1 和KY937659 進(jìn)化關(guān)系較近,位于同一進(jìn)化分支。MH155193 與KY937651.1、KP260509.1、KY937641.1 進(jìn)化關(guān)系較近,位于另一獨(dú)立的進(jìn)化分支上,如圖2 所示。核苷酸同源性分析顯示,MH155192 與MF467233.1 和JQ743891.1 的核苷酸同源性最高,均為99.9%,與MG264078.1 同源性較低(99%)。MH155193 與KY937651.1、KP260509.1、KY937641.1 核苷酸同源性均為99.8%,與KF149967.1 同源性較低(99.1%),MH155192 和MH155193 同源性為99.3%,如表1所示。

圖2 犬細(xì)小病毒臨床分離株VP2 基因系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 氨基酸變異分析 MH155192 在易發(fā)生變異的位點(diǎn)氨基酸分別為5A,80R,87 L,93 N,101T,103A,178D,212F,232I,267Y,297A,300G,305Y,322T,323N,324I,370R,373D,426D,440A,564S,568G。各毒株之間氨基酸差異明顯的位點(diǎn)主要在267、324、370、426、440 位,如表2 所示。MH155192 和MH155193 共有13 個(gè)核苷酸差異,其中的10 個(gè)核苷酸的變化僅造成同義突變,而3個(gè)核苷酸突變導(dǎo)致氨基酸改變,分別位于370、426 和440 位殘基?？傮w來看,在24 株犬細(xì)小病毒中,中國(guó)分離株267 位均為Y,324 位均為I,與美國(guó)、厄瓜多爾分離株差異明顯,370 位中國(guó)分離株為Q 或R。CPV-2c分離株440 位均為T。

表1 犬細(xì)小病毒臨床分離株VP2 基因同源性分析

表2 VP2 蛋白氨基酸變異情況

3 討論

犬細(xì)小病毒,為將其與抗原無關(guān)的犬科動(dòng)物微小病毒(MVC 或CPV1) 區(qū)分開來,也稱為CPV2,1978 年出現(xiàn)在美國(guó),并迅速蔓延在世界各地的狗群中引起居高不下發(fā)病率[5]。在1979 年和1984 年,CPV-2a 和2b 兩種新抗原類型分別取代了原來的CPV-2,獲得了在貓中高效復(fù)制的能力。CPV-2a 和CPV-2b 至少在VP2 衣殼蛋白上有5 個(gè)或6 個(gè)氨基酸與最初的CPV2 不同。在CPV-2a 和CPV-2b 中VP2 第297 位(Ser→Ala)的額外氨基酸改變產(chǎn)生了“新CPV-2a”和“新CPV-2b”。此外,在2000 年報(bào)道了另一種抗原變體,其特征在于氨基酸替代426-Asp→Glu。這種CPV-2c 隨后在全球范圍內(nèi)被報(bào)道,并與嚴(yán)重的臨床病程相關(guān),死亡率較高[6]。CPV-2a (Met87Leu,Ile101Thr,Ala300Gly,Asp305Tyr,Asn375Asp,和Val555Ile 氨基酸變體) 和 CPV-2b (Asn426Asp),CPV-2c(Asp426Glu)僅有1 個(gè)氨基酸位置不同(VP2 426 殘基)[7]。VP2 的426 和297 位氨基酸在空間上分別接近衣殼表面上三倍體突起的殘基97 和300 。結(jié)構(gòu)研究表明,該區(qū)域與宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TFR)相互作用以介導(dǎo)感染,限制宿主范圍,并且具有很高的抗原性[6]。近年來中國(guó)分離株CPV-2a,CPV-2b,CPV-2c 三種類型都有。在本文氨基酸分析的24 株病毒中,除KJ813835.1 第297 位為Ser外,其余菌株都為Ala,故認(rèn)為CPV/canine/LZ/1/2017 和CPV/canine/LZ/2/2017 分別是新CPV-2b和CPV-2c。尤其CPV-2c 甚至能引起成年犬的嚴(yán)重疾病,應(yīng)引起重視。

一般氨基酸替換發(fā)生于K80R,K93 N,V103A,D323N,N564S 和A568G,在本文的氨基酸序列分析中發(fā)現(xiàn),不同毒株之間的主要突變發(fā)生在F267Y,Y324I,Q370R,N426D 或D426E,T440A。這些突變可能會(huì)導(dǎo)致病毒通過抗原漂移免疫逃避和隨之而來的疫苗失敗。在非同義突變中,氨基酸殘基267 未暴露于衣殼表面,因此在這個(gè)位置的替代可能不會(huì)影響病毒的抗原性。Y324I 突變常見于亞洲國(guó)家特別是中國(guó)和南美。該突變可能對(duì)細(xì)小病毒宿主范圍有影響,且由于Y324I 突變發(fā)生在潛在的重要的抗原表位區(qū)域,這個(gè)替代可能對(duì)病毒生物學(xué)有直接影響。T440A 突變對(duì)于CPV 也很重要,因?yàn)闅埢?40 位于衣殼表面VP2 的3 倍體突起的頂部,主要的病毒抗原位點(diǎn)。因此導(dǎo)致其他抗原性變體出現(xiàn)[8]。臺(tái)灣CPV-2c 毒株VP2 蛋白也存在Q370R 的替代,突變Q370R 在中國(guó)的大熊貓和中國(guó)的CPV-2c 株中觀察到。370 殘基位于殘基359 和375 之間(它是衣殼蛋白的表面環(huán)),毗鄰雙Ca2+結(jié)合位點(diǎn),這些對(duì)于病毒感染性是必不可少的,這些位點(diǎn)的改變與病毒凝集紅細(xì)胞的能力相關(guān)[9]。因此,Q370R 變異是否導(dǎo)致抗原變化仍有待調(diào)查。總的來說,進(jìn)一步研究犬細(xì)小病毒流行毒株的基因變異情況,以及變異引起的生物學(xué)特性的變化對(duì)于該病的防控有重要意義。