孫豪嫻，孫貴香，肖 丹，鄧琳蓉，張 婷，厲佳俊

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

顆粒膏是以新型配方顆粒為原材料，運(yùn)用現(xiàn)代科技工藝制作而成。不僅療疾以緩，功效滋補(bǔ)，而且攜帶方便，口感較好。顆粒膏的產(chǎn)生不僅解決了傳統(tǒng)膏劑制作繁瑣的問(wèn)題，還節(jié)約了人力、物力資源。然而關(guān)于顆粒膏的功效一直是患者心中的困惑，且目前研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)復(fù)制脾氣虛模型大鼠來(lái)研究顆粒劑四君子膏對(duì)大鼠心肌結(jié)構(gòu)、SOD、MDA的影響，并對(duì)四君子膏于大鼠心肌的保護(hù)作用進(jìn)行探討。旨在以四君子膏為參考，對(duì)顆粒劑運(yùn)用于膏劑制作上的功效做出評(píng)價(jià)，為臨床上顆粒劑膏的運(yùn)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物、藥物、試劑與儀器 SPF級(jí)SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量180±20 g，購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)，合格證號(hào)：SYXK（湘）2013-0005。在湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度控制在18～22℃，相對(duì)濕度維持在40%～70%。

顆粒劑四君子膏溶液：顆粒劑四君子膏由人參、茯苓、白術(shù)、炙甘草等組成，由深圳華潤(rùn)三九醫(yī)藥有限公司提供配方顆粒，以《太平惠民和劑局方》為依據(jù)，四種藥物以3∶3∶3∶2的比例溶解濃縮，加入煉蜜收膏而成。再參照《人與動(dòng)物用藥量換算表》70 kg成人的體表面積是200 g大鼠的56倍，按照正常成人一日服用膏滋40 g計(jì)算，3組大鼠服用的膏劑量分別為1.8、3.6、5.4 g/kg，將膏劑加蒸餾水分別制成含膏量為180、360、540 g/L的溶液，并放入冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。四君子湯溶液：同顆粒劑四君子膏藥物組成比例，按書中原方劑量，采用傳統(tǒng)中藥煎煮方法煎煮至含生藥量為295 g/L的溶液保存。大黃制劑液：由大黃煎煮濃縮至生藥濃度為54 g/L而成。實(shí)驗(yàn)中所用的中藥飲片亦由深圳華潤(rùn)三九醫(yī)藥有限公司提供。大鼠超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒購(gòu)自長(zhǎng)沙鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)：INS20180187）。

JE1002電子天平：上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；WMY-01數(shù)字溫度計(jì)：上海醫(yī)用儀表廠；低溫高速離心機(jī)：美國(guó)sigma公司；EL34oi型全自動(dòng)酶標(biāo)儀：Molecular Devices公司。

1.2 動(dòng)物模型復(fù)制 參考文獻(xiàn)[1-4]，采用飲食失節(jié)+耗氣破氣+勞倦過(guò)度的方法建立脾氣虛動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采取隔日進(jìn)食的方法控制大鼠進(jìn)食量；每日上午按10 mL/kg灌服大黃制劑；在水溫為（22±2）℃的室內(nèi)游泳槽中，每天下午強(qiáng)迫負(fù)重（按大鼠自身體重的10%計(jì)）游泳至力竭為止——大鼠鼻尖沒入水面大于10 s。

1.3 動(dòng)物分組與給藥 SD大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后依次編號(hào)，采用國(guó)際上通用的編號(hào)表計(jì)，隨機(jī)分為正常組、模型組、四君子湯組、四君子膏低、中、高劑量組。正常組自由飲食，除同時(shí)灌服等量生理鹽水外不做特殊處理；實(shí)驗(yàn)組在隔日進(jìn)食、灌胃大黃制劑、負(fù)重游泳的基礎(chǔ)上，于每日下午各組分別灌服2 mL等量生理鹽水、四君子湯（2.95 g/kg）及顆粒劑四君子膏低、中、高劑量（1.8、3.6、5.4 g/kg）溶液，連續(xù)給藥28 d。

1.4 指標(biāo)檢測(cè) 大鼠腹主動(dòng)脈取血后開胸，夾取心臟，立即用低溫生理鹽水洗去殘留血液，濾紙吸干后于心尖處切取約1 mm×1 mm×1 mm的心肌組織，用多聚甲醛溶液固定，經(jīng)酒精脫水處理后石蠟包埋，制備顯微鏡切片，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察心肌組織結(jié)構(gòu)變化并攝影。剩余心肌組織準(zhǔn)確稱重后低溫離心，制成心肌勻漿液，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性，均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”表示。運(yùn)用單因素方差分析法進(jìn)行組間比較，采用LSD法和Dunnett法進(jìn)行兩兩比較，取α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 正常組大鼠活動(dòng)靈敏，毛發(fā)有光澤，肛溫正常，體重逐日增加；模型組大鼠造模1周后出現(xiàn)稀便，便次增多，繼而出現(xiàn)體形瘦弱，蜷縮不好動(dòng)，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)蓬松無(wú)光澤，體重、肛溫均明顯低于正常組（P＜0.05），符合脾氣虛證的癥狀，參照田茸等[5]制訂的脾氣虛證模型大鼠的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：倦縮扎堆1分；瞇眼弓背1分；食量減少1分；體質(zhì)量減輕1分；便形質(zhì)軟1分；便形溏稀2分；肛溫下降2分；游泳耐力下降1分。模型組大鼠得分為7分，大于5分，提示造模成功；四君子湯組、四君子膏低、中、高劑量組大鼠癥狀較模型組均有所減輕（P＜0.05），四君子膏組呈現(xiàn)出劑量趨勢(shì)；四君子湯組大鼠肛溫及體重變化與四君子膏中、高組存在差異（P＜0.05），見表 1。

表1 各組大鼠肛溫、體重情況（±s，n=10）

表1 各組大鼠肛溫、體重情況（±s，n=10）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與四君子湯組比較，▲P＜0.05

▲四君子膏高劑量組 5.4 37.92±0.24△▲ 254.47±6.01△▲

2.2 各組大鼠心肌組織SOD、MDA水平 相較于正常組，模型組大鼠心肌組織SOD活力水平顯著降低，MDA含量顯著升高（P＜0.05）；4組給藥組較模型組大鼠心肌SOD活力均升高，心肌MDA含量均降低（P＜0.05），并以四君子膏高劑量組最明顯；四君子膏中、高劑量組對(duì)提高大鼠心肌組織的SOD活力、降低MDA含量的作用強(qiáng)于四君子湯（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠心肌組織SOD、MDA水平（±s，n=10）

表2 各組大鼠心肌組織SOD、MDA水平（±s，n=10）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與四君子湯組比較，▲P＜0.05

MDA/（nmol·mg-1）正常組 - 69.57±2.20 0.79±0.11組別 劑量/（g·kg-1）SOD/（U·mg-1）模型組 - 41.17±1.50* 1.42±0.06*四君子湯組 2.95 51.27±5.80*△ 1.19±0.13*△四君子膏低劑量組 1.8 51.42±4.59*△ 1.07±0.07*△四君子膏中劑量組 3.6 54.32±2.20*△▲ 1.03±0.07*△▲四君子膏高劑量組 5.4 65.53±3.15△▲ 0.85±0.10△▲

2.3 各組大鼠心肌結(jié)構(gòu)比較 在400倍光鏡下觀察各組大鼠心肌組織HE切片，其中正常組大鼠心肌組織纖維排列整齊有序，心肌細(xì)胞大小、形態(tài)正常，染色均勻，周圍未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠心肌組織纖維排列紊亂，部分組織正常結(jié)構(gòu)消失，心肌細(xì)胞肥大、壞死，細(xì)胞間質(zhì)增寬，間質(zhì)細(xì)胞增多，水腫嚴(yán)重，周圍可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；給藥組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)損傷均較模型組輕，其中四君子湯組及四君子膏低劑量組心肌組織間質(zhì)增寬，存在輕度水腫、排列紊亂；四君子膏中劑量組心肌組織染色均勻，排列較整齊，存在輕度水腫；四君子膏高劑量組心肌組織與正常組相近，見圖1。

3 討論

3.1 脾氣虛證大鼠模型的建立和評(píng)價(jià) 動(dòng)物造模的成功與否是決定實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，在近幾十年的研究過(guò)程中，脾氣虛證動(dòng)物模型的建立從單因素造模的方法發(fā)展到現(xiàn)在普遍的復(fù)合因素造模的方法[6]。本實(shí)驗(yàn)采用飲食失節(jié)、耗氣破氣結(jié)合勞倦過(guò)度的復(fù)合因素造模。脾胃為水谷之海，后天之本，脾胃功能的正常有賴于飲食規(guī)律節(jié)制，飲食失節(jié)，饑飽失常，則脾胃損傷。大黃味苦性寒，具有瀉下攻積，清熱瀉火之效，而《本草經(jīng)疏》云：“脾虛忌下、降泄、破氣”，采用灌服大黃制劑液耗氣破氣后，大鼠可出現(xiàn)明顯脾氣虛癥狀[7]。張景岳云：“脾胃之傷于外者，惟勞倦最能傷脾”，脾胃為氣血生化之源，而勞倦易散氣耗氣，因此采取力竭游泳的方法使大鼠勞倦過(guò)度，可以較好建立脾氣虛證的動(dòng)物模型[8]。實(shí)驗(yàn)證明，采用上述3種因素聯(lián)合進(jìn)行造模后，大鼠出現(xiàn)肛溫下降、體重減輕、飲食量減少、大便偏稀、蜷縮畏寒等癥狀，符合脾氣虛證的表現(xiàn)。四君子湯出自《太平惠民和劑局方》具有益氣健脾的功效，是治療脾氣虛證的基礎(chǔ)方[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠灌服四君子湯后一般情況較模型組大鼠好，脾氣虛癥狀得以改善，有是證用是方，根據(jù)“方證對(duì)應(yīng)”的邏輯理論[10-11]，說(shuō)明所造模型為脾氣虛證模型。

3.2 四君子膏對(duì)脾氣虛模型大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)及SOD、MDA的影響 心肌組織結(jié)構(gòu)的改變可以很直觀的反映心肌細(xì)胞的損傷程度，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)脾氣虛大鼠心肌細(xì)胞存在不同程度的壞死[12]。SOD是生物體內(nèi)存在的一種抗氧化酶，具有清除自由基，防止自由基損傷的作用，有研究表明SOD可以減輕組織的氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)心肌缺血再灌注損傷[13]。MDA是體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化作用的代謝產(chǎn)物，其含量的多少可以反映脂質(zhì)過(guò)氧化的程度[14]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌損傷明顯，心肌組織SOD活力水平顯著降低，MDA含量顯著升高，說(shuō)明大鼠經(jīng)脾氣虛造模后清除自由基能力減弱，心肌組織產(chǎn)生較多氧自由基受到損傷。經(jīng)四君子制劑治療后各組大鼠情況均有所改善，其中四君子膏的效果在低濃度時(shí)與四君子湯相同，在中、高濃度時(shí)優(yōu)于四君子湯，在高濃度時(shí)效果最好，說(shuō)明四君子膏的功效值得肯定，顆粒劑四君子膏可以提高脾氣虛證大鼠心肌組織SOD活力，降低MDA含量，增強(qiáng)大鼠心肌組織抗氧化能力及自由基清除能力，減輕脾氣虛證大鼠心肌組織損傷。

圖1 各組大鼠心肌組織（HE 400×）

3.3 探討四君子膏對(duì)脾氣虛模型大鼠心肌的保護(hù)作用 心者，君主之官，神明出焉；脾胃者，倉(cāng)廩之官，五味出焉?！秲?nèi)經(jīng)》書中載：“五臟相通，移皆有次”，心與脾之間存在著密切聯(lián)系，后世醫(yī)家對(duì)其進(jìn)行了總結(jié)與延展，認(rèn)為二者的關(guān)系主要體現(xiàn)在：母子相依：在五行上心屬火，脾屬土，二臟存在著母子相生、母子互病的關(guān)系；氣血互濟(jì)：“食氣入胃，濁氣歸心，淫精于脈”《素問(wèn)·經(jīng)脈別論》），心主血脈，脾胃為氣血生化之源，心與脾在氣血上存在互濟(jì)的關(guān)系；經(jīng)脈相貫：“脾足太陰之脈也……其支者，復(fù)從胃，別上膈，注心中”，心脾二臟通過(guò)經(jīng)脈相貫，聯(lián)系互通；病理互制：基于心脾二臟間上述關(guān)系的特殊性，因此在病理上相互影響[15]。

四君子湯是治療脾氣虛證的一首基礎(chǔ)方，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，方中的有效成分主要為多糖、皂苷、黃酮及揮發(fā)油類物質(zhì)[16]，具有促進(jìn)消化吸收、增強(qiáng)機(jī)體免疫、促進(jìn)內(nèi)分泌腺功能、延緩衰老等作用[17-19]。顆粒劑四君子膏則是以四君子湯為依據(jù)，由配方顆粒藥材以最新工藝熬制而成，既保留了四君子湯健脾益氣之功，又具備了膏劑滋補(bǔ)保健之效[20-21]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，脾氣虛證大鼠在出現(xiàn)脾氣虛癥狀的同時(shí)，其心肌組織亦存在較明顯損傷。而四君子膏可以通過(guò)提高心肌組織SOD活力，降低MDA含量，減少心肌損傷，從而達(dá)到對(duì)心肌組織的保護(hù)作用?！镀⑽刚摗份d“內(nèi)傷脾胃，百病由生”，脾病及心，子病及母。實(shí)驗(yàn)結(jié)果從另一方面說(shuō)明了心脾二臟之間的關(guān)系性，同時(shí)為臨床“從脾論治”心系疾病提供了理論依據(jù)。

綜上可知，采用飲食失節(jié)+耗氣破氣+勞倦過(guò)度復(fù)合因素的方法可以建立良好穩(wěn)定的脾氣虛大鼠模型。基于心脾二臟之間的生理、病理聯(lián)系，脾氣虛證模型大鼠心肌細(xì)胞存在損傷，心肌組織中的SOD活力水平下降，MDA含量升高。四君子制劑可以保護(hù)脾氣虛證大鼠的心肌組織結(jié)構(gòu)，其中顆粒劑四君子膏的療效值得肯定，并在一定濃度上優(yōu)于四君子湯。臨床上顆粒劑不僅可以運(yùn)用于湯劑，亦可運(yùn)用于膏劑的制作。