吳 翔，甘炳成，謝麗源，譚 昊，黃忠乾，彭衛(wèi)紅，唐 杰

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南區(qū)域農(nóng)業(yè)微生物資源利用科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南山地農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066）

青枯病是由青枯勞爾氏菌（Ralstonias olanacearum）引起的細(xì)菌性枯萎病，該病原菌可以侵染50多個(gè)科近200多種植物［1］，是一種在世界范圍內(nèi)危害大、分布廣、造成損失極其嚴(yán)重的植物病害之一。如今，青枯病的侵染影響范圍越來越廣，其感染的植物種屬也在不斷增加。就農(nóng)業(yè)栽培作物而言，茄科類作物受R.solanacearum的影響最為嚴(yán)重，其中以煙草、番茄、辣椒等作物更為突出。煙草青枯病于1908年被Smith［2］發(fā)現(xiàn)，它是一種土傳病害，目前煙草青枯病在我國(guó)大部分煙草種植區(qū)大面積發(fā)病，造成的損失已居煙草病害的第4位［3］，引起廣大科學(xué)工作者的重視。目前有化學(xué)防治、選育抗病煙草品種、改善耕作制度管理、生物防治等方法應(yīng)用于煙草青枯病的防治，與常用的化學(xué)防治方法相比，生物防治方法具有成本低、無二次污染和效果持久等優(yōu)點(diǎn)，而相對(duì)于選育抗病煙草品種和耕作制度管理兩種方法，生物防治方法分別具有研發(fā)周期相對(duì)短以及節(jié)約勞力等優(yōu)點(diǎn)，因此生物防治是目前煙草青枯病防治中最熱門的研究方向，而篩選更多效果好、易培養(yǎng)的拮抗菌是煙草青枯病生物防治的基礎(chǔ)工作，具有重要意義。本研究從高粱根際土中分離獲得的一株細(xì)菌MT-002-B-7對(duì)煙草青枯病原菌具有良好的拮抗效果，對(duì)該菌進(jìn)行了鑒定，并對(duì)其拮抗菌液的發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，以期為該菌用于煙草青枯病防治的生物有機(jī)肥研制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

煙草青枯病病原菌：由云南省煙草科學(xué)研究院惠贈(zèng)。

TM培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，葡萄糖5.0 g，酪素水解物（Trypticase）1.0 g，瓊脂粉18.0 g，蒸餾水1 000 mL；

NA 培 養(yǎng) 基： 牛 肉 浸 膏 3.0 g， 蛋 白 胨 5.0 g，葡 萄 糖 20.0 g， 瓊 脂 20.0 g， 蒸 餾 水 1 000 mL，pH值6.8～7.2；

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值 7.4；

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂 20.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值6.8～7.2；

碳氮源篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基∶氮源10.0 g（蛋白胨5.0 g，硫酸銨5.0 g），碳源（葡萄糖）10.0 g，Na2HPO4·12H2O 4.0 g，NaH2PO4·2H2O 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.2 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值7.0～7.5。

生理生化指標(biāo)檢測(cè)試劑和培養(yǎng)基參照趙斌等［4］的《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的初篩

初篩采用噴霧法和雙層平板法［4-6］，將病原菌接種于液體TM培養(yǎng)基，30℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)36 h，離心收集菌體并用無菌水重懸，放置于經(jīng)70%酒精和10%雙氧水消毒的無菌噴瓶里，然后均勻地噴灑在TM平板上，每皿噴霧約0.2 mL，制成含菌平板。晾干后再倒上一層薄薄的NA培養(yǎng)基，制成雙層平板。將純培養(yǎng)微生物點(diǎn)接于上層培養(yǎng)基，30℃倒置培養(yǎng)，通過觀察菌株是否產(chǎn)生拮抗透明圈判斷該菌是否具有拮抗煙草青枯病原菌的能力。

1.2.2 拮抗菌的復(fù)篩

在直徑9 cm培養(yǎng)皿中準(zhǔn)確倒入20 mL TM培養(yǎng)基，用與初篩相同方法制成含病原菌的平板，在離平板中心距離相等的3個(gè)方向分別用6 mm無菌打孔器打孔備用。將初篩所得菌株于液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中30℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，每孔中注入30 μ L發(fā)酵液，于30℃正置培養(yǎng)36 h后，記錄孔周圍的抑菌圈直徑，抑菌圈直徑大小代表各菌株對(duì)病原菌抑制能力的大小。

1.2.3 盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證拮抗菌對(duì)煙草青枯病的抑制效果

處理設(shè)置：CK：不施菌液；菌液：MT-002-B-7發(fā)酵液。各處理5個(gè)重復(fù)。病原菌及供試處理菌液的施用方法：兩個(gè)處理的青枯病原菌的接入方法采用莖基部穿刺接種法，每個(gè)植株注入1 mL病原菌菌懸液。將菌株MT-002-B-7在LB培養(yǎng)液中發(fā)酵，28℃、180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)24～ 56 h，獲得濃度為108cfu/mL的菌液。施用時(shí)采取灌根的方法，吸取5 mL原液，將其用水稀釋至100 mL，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。分別在移栽當(dāng)天、移栽第25 d、40 d各施用1次，盆栽試驗(yàn)共進(jìn)行65 d。病情調(diào)查方法參考煙草病蟲害分級(jí)及調(diào)查方法進(jìn)行［7］。

1.2.4 菌株拮抗條件優(yōu)化

1.2.4.1 培養(yǎng)基礎(chǔ)條件 菌株特性研究以LB培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，特性研究和碳氮源篩選的基礎(chǔ)培養(yǎng)條件：接種量為1%、裝液量40%、初始pH值7.0、溫度 28℃、轉(zhuǎn)速 170 r/min、培養(yǎng) 24 h 為基礎(chǔ)培養(yǎng)條件。

1.2.4.2 菌株培養(yǎng)特性研究 培養(yǎng)時(shí)間：分別在培養(yǎng) 5、10、16、21、25、30、40 和 45 h 時(shí)取樣檢測(cè)；裝液量：10%、20%、30%、40%、60%（v/v）LB液體培養(yǎng)液；培養(yǎng)溫度：分別設(shè)置培養(yǎng)溫度為20、25、30、35和40℃；初始pH值：用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)節(jié)LB液體培養(yǎng)基的初始pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0；搖床轉(zhuǎn)速：將搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為100、120、150、180、200 r/min；菌種接種量：分別設(shè)置菌液接種量為1%、2%、3%、5%、10%。將各處理于基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，用復(fù)篩方法測(cè)定各種條件下待測(cè)菌株對(duì)煙草青枯病的拮抗效果，同時(shí)測(cè)定菌株在600 nm處的吸光度了解菌株生長(zhǎng)情況，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，計(jì)算其平均值。

1.2.4.3 不同碳源和氮源對(duì)菌株拮抗效果的影響固定碳氮源篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基中其它元素，分別將10 g/L碳源和10 g/L氮源的備選碳源、氮源加入至基礎(chǔ)培養(yǎng)基，測(cè)定菌株的拮抗效果，在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，用復(fù)篩方法測(cè)定各發(fā)酵液對(duì)煙草青枯病的拮抗效果，同時(shí)測(cè)定菌株在600 nm處的吸光度了解菌株生長(zhǎng)情況，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，計(jì)算其平均值。

1.2.5 菌株的鑒定

1.2.5.1 顯微形態(tài)、培養(yǎng)形態(tài)和生理生化特征分析將菌株于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，于培養(yǎng)箱適溫、適時(shí)培養(yǎng)，對(duì)菌落形態(tài)拍照，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并于光學(xué)顯微鏡下觀察其顯微形態(tài)。菌株大部分生理生化特征利用BiologGenⅢ型細(xì)菌鑒定儀的微孔板檢測(cè)，具體按照Biolog-GenⅢMicroPlateTM使用說明書步驟操作，其微孔板布局如圖1所示。其它生理生化試驗(yàn)檢測(cè)內(nèi)容參照趙斌等［4］的《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》進(jìn)行操作。將培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)為5、6、7、8、9、10、11，NaCl含量調(diào)節(jié)為1%、4%、8%和10%（w/v）檢測(cè)菌株生長(zhǎng)pH值范圍和NaCl耐受情況，檢測(cè)菌株在7、15、25、30、40、45和50℃條件下的生長(zhǎng)情況。

1.2.5.2 細(xì)菌總DNA提取與PCR擴(kuò)增 細(xì)菌基因組DNA的提取采用杭州博日科技有限公司的試劑盒進(jìn)行，按廠商說明書操作。用細(xì)菌通用引物對(duì)（正向引物 27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物 1492R 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）擴(kuò)增菌株16S rDNA基因。PCR反應(yīng)體系為20 μ L，所用程序?yàn)椋?5℃ 3 min，95℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃90 s，共 25 個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。由上海生工生物工程有限公司對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序。

圖1 Biolog GEN Ⅲ MicroPlate微孔板測(cè)試布局

1.2.5.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 得到DNA序列后，首先利用計(jì)算機(jī)對(duì)其序列進(jìn)行分析處理并進(jìn)行排序，如果是反向引物得到的序列，還要將之轉(zhuǎn)化成互補(bǔ)鏈的序列；利用Blast軟件在GenBank、NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性搜索；選取同源性比較高的典型菌株的16S rDNA序列作為參比對(duì)象；用CLUSTALW 1.8軟件進(jìn)行多序列比對(duì)并計(jì)算供試菌株與參比菌株之間的序列相似性；應(yīng)用MEGA5.0軟件，將測(cè)序獲得各菌株的16S rDNA序列進(jìn)行多序列完全比對(duì)，去掉兩端差異序列后，利用Neighbor-Joining法根據(jù)Kimura-2法計(jì)算各類群間的核苷酸差異值，運(yùn)行1 000次bootstrap構(gòu)建獲得系統(tǒng)發(fā)育。將測(cè)得的16S rDNA序列提交GenBank，獲得各菌株核酸登錄號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌篩選

通過判斷菌株在檢測(cè)培養(yǎng)基上的透明圈，初步篩選出對(duì)煙草青枯病具有拮抗作用的微生物菌株28株；再通過判斷28株初篩菌株發(fā)酵液在復(fù)篩培養(yǎng)基上的抑菌圈大小，復(fù)篩出1株拮抗效果較好的細(xì)菌MT-002-B-7，該菌的發(fā)酵液在培養(yǎng)基上的抑菌圈明顯，抑菌圈直徑達(dá)到28.67 mm，如圖2所示。

圖2 MT-002-B-7發(fā)酵液打孔拮抗病原菌情況

2.2 盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證拮抗菌對(duì)煙草青枯病的抑制效果

在盆栽試驗(yàn)期間，共進(jìn)行3次病情調(diào)查，調(diào)查結(jié)果如表1所示。菌液處理在盆栽的整個(gè)試驗(yàn)期都無煙草青枯病的發(fā)病現(xiàn)象，而對(duì)照在第25 d的發(fā)病率達(dá)到100%，在3次病情調(diào)查中其病情指數(shù)逐漸升高。試驗(yàn)結(jié)果證明菌株MT-002-B-7對(duì)煙草青枯病具有良好的抑制效果。

表1 各處理菌液施用后對(duì)煙草青枯病的防治效果（%）

2.3 MT-002-B-7液體發(fā)酵條件優(yōu)化

從圖3的8種因素對(duì)菌株MT-002-B-7拮抗煙草青枯病的影響結(jié)果中可以看出，當(dāng)發(fā)酵液以葡萄糖為碳源時(shí)和以谷氨酸為氮源時(shí)最利于該菌抑制煙草青枯病原菌，同時(shí)分別以這兩種物質(zhì)為碳、氮源時(shí)菌液的濃度亦是最大。以促進(jìn)MT-002-B-7抑制煙草青枯病的效果排序，則供試6種碳源的順序如下：葡萄糖＞麥芽糖＞乳糖＞甘露醇＞蔗糖＞木糖，供試6種氮源的順序如下：谷氨酸＞酵母粉 ＞ 蛋白胨 ＞（NH4）2SO4＞NH4NO3＞KNO3；以促進(jìn)MT-002-B-7生長(zhǎng)的效果排序，則供試6種碳源的順序如下：葡萄糖＞乳糖＞甘露醇＞麥芽糖＞蔗糖＞木糖，供試6種氮源的順序如下：谷氨酸＞酵母粉 ＞ 蛋白胨 ＞NH4NO3＞（NH4）2SO4＞KNO3。由4項(xiàng)排序結(jié)果可以看出，最利于該菌抑制煙草青枯病原菌和促進(jìn)菌株生長(zhǎng)的葡萄糖和谷氨酸以及最不利于該菌抑制煙草青枯病原菌和促進(jìn)菌株生長(zhǎng)的木糖和KNO3在各自組的排序相同，而其它10種碳、氮源在對(duì)該菌抑制煙草青枯病原菌和促進(jìn)菌株生長(zhǎng)的時(shí)候有些許變化，如碳源中的麥芽糖和氮源中的NH4NO3，可能是因?yàn)樗鼈兊陌l(fā)酵產(chǎn)物僅僅利于促進(jìn)拮抗物質(zhì)的分泌，卻對(duì)菌株的生長(zhǎng)幫助不大。

圖3 8種因素對(duì)菌株MT-002-B-7拮抗煙草青枯病的影響

從圖3中也可以看出，就利于菌株MT-002-B-7產(chǎn)生拮抗物質(zhì)的最優(yōu)水平而言，培養(yǎng)溫度呈現(xiàn)不規(guī)律的變化，在5～16 h拮抗物質(zhì)活性出現(xiàn)下降后再上升的情況，直到培養(yǎng)25 h最利于其產(chǎn)生拮抗物質(zhì)，之后逐漸下降，而隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加菌液濃度逐漸升高，仍然在第25 h達(dá)到最高的菌液濃度，之后逐漸下降；隨著裝液量的增加，菌株MT-002-B-7產(chǎn)生拮抗物質(zhì)的量逐漸降低，菌株生長(zhǎng)濃度亦是逐漸降低。

另外，將培養(yǎng)液的初始pH值調(diào)節(jié)為7.0的情況下，裝液量10%，接種3 mL（即接種量3%）的菌株母液，并將搖床溫度控制在35℃，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為150 r/min的條件下培養(yǎng)25 h，該菌株對(duì)煙草青枯病原菌的抑制效果最好。而與以上條件不同的是，將pH值調(diào)節(jié)為8.0、搖床轉(zhuǎn)速調(diào)為180 r/min以及接種量控制在5%，其它條件不變則最利于該菌株的生長(zhǎng)。

2.4 菌株MT-002-B-7的鑒定結(jié)果

2.4.1 菌株MT-002-B-7的形態(tài)特征

菌株MT-002-B-7在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上微隆起，邊緣整齊，呈藍(lán)綠色，培養(yǎng)基在其生長(zhǎng)過程中顏色變化較大，起初為黃綠色，之后逐漸加深，在培養(yǎng)基加深的過程中，菌落表面出現(xiàn)金屬光澤。該菌是革蘭氏陰性的好氧細(xì)菌，其光學(xué)顯微形態(tài)呈短桿狀，如圖4所示。

圖4 菌株MT-002-B-7在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及其光學(xué)顯微形態(tài)（×1 000）

2.4.2 菌株MT-002-B-7的生理生化檢測(cè)結(jié)果

菌株MT-002-B-7的pH值生長(zhǎng)范圍是5～9，最適生長(zhǎng)pH值為6和7，耐受NaCl的能力一般，能在含4% NaCl的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，生長(zhǎng)溫度為15～45℃，溫度在30～40℃時(shí)，菌株長(zhǎng)勢(shì)都好。油脂水解，甲基紅反應(yīng)、明膠液化、牛奶凝固、產(chǎn)硫化氫反應(yīng)、硝酸鹽還原反應(yīng)和過氧化氫酶反應(yīng)為陽(yáng)性，水解淀粉、纖維素水解反應(yīng)呈陰性，如表2所示，位置對(duì)應(yīng)內(nèi)容如圖5。

從菌株MT-002-B-7培養(yǎng)22 h后在Biolog鑒定板上的鑒定結(jié)果可知，該菌與Pseudomonas aeruginosa相似形最高，其中二甲胺四環(huán)素反應(yīng)、L-組胺利用、葡糖醛酰胺利用和γ-氨基-丁酸的反應(yīng)結(jié)果有所不同，其余的反應(yīng)結(jié)果相同，如圖5所示。它們的相似度（SIM）為0.595，距離（DIST）為4.031，匹配的可能性（PROB）為82.8%，根據(jù)SIM＞0.5，DIST＜5表示匹配良好的原則，從鑒定板結(jié)果初步判定菌株MT-002-B-7為Pseudomonas aeruginosa。

表2 菌株MT-002-B-7的部分生理生化特征

圖5 MT-002-B-7和Pseudomonas aeruginosa在微孔板上的反應(yīng)結(jié)果對(duì)比

2.4.3 菌株 MT-002-B-7 16S rRNA 基因部分序列分析

圖6 通過鄰接法構(gòu)建的基于菌株MT-002-B-7及相關(guān)菌株16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

菌株MT-002-B-7的16S rRNA基因部分序列 長(zhǎng) 度 為 1 461 bp， 在 GenBank 核 酸 登 錄 號(hào) 為KR136350。根據(jù)菌株MT-002-B-7系統(tǒng)發(fā)育分析，菌株MT-002-B-7屬于假單胞菌（Pseudomonas）細(xì)菌，與其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近的典型菌株（銅綠假 單 胞 菌 ）Pseudomonas aeruginosa JCM 5962T聚為一簇，其16S rRNA基因相似性為99.4%，其次 是 典 型 菌 株 Pseudomonas otitidis MCC10330T和Pseudomonas alcaligenes NBRC 14159T，其 16S rRNA基因相似性分別為98.0%和97.0%。菌株與假單胞菌（Pseudomonas）其它典型菌株的相似性＜97.0%。通過鄰接法構(gòu)建的基于菌株MT-002-B-7及相關(guān)菌株16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖6所示。結(jié)合其形態(tài)特征、生理生化特征和16S rRNA基因部分序列分析結(jié)果［8-9］，判定菌株MT-002-B-7屬于假單胞菌屬的銅綠假單胞菌。

3 討論與結(jié)論

從高粱根際土中分離獲得一株對(duì)煙草青枯病原菌具有較好拮抗效果的細(xì)菌MT-002-B-7，基于形態(tài)、培養(yǎng)和生理特征，結(jié)合16S rDNA序列分析，初步鑒定為銅綠假單胞菌。該菌對(duì)煙草青枯病原菌的抑菌圈直徑可以達(dá)到28.67 mm，和易有金等［10］篩選的拮抗菌B-001的抑菌圈直徑為25 mm、繆莉等［11］篩選獲得的真菌抑菌圈直徑為2.6 cm、董夏偉等［12］分離所得的拮抗菌對(duì)病原菌的抑菌圈為28.9 mm等研究效果相比，該菌抑菌效果較好。

關(guān)于銅綠假單胞菌拮抗煙草青枯病的特性已有不少報(bào)道［12-15］，結(jié)合已有報(bào)道中的研究方法，本研究經(jīng)過單因素優(yōu)化后，獲得利于菌株MT-002-B-7抑制煙草青枯病原菌的最佳培養(yǎng)基碳氮源和培養(yǎng)條件為：以葡萄糖為碳源，以谷氨酸為氮源，裝液量10%，培養(yǎng)基初始pH值7.0，接種量3%，溫度35℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)25 h。該優(yōu)化結(jié)果為工業(yè)生產(chǎn)該菌株提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)也根據(jù)菌株MT-002-B-7能在常規(guī)條件下進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)、對(duì)發(fā)酵條件無苛刻要求的情況，可以初步判斷該菌具有一定的環(huán)境適應(yīng)能力。

關(guān)于銅綠假單胞菌最多的研究集中在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，它是傷口感染較常見的一種細(xì)菌，被醫(yī)學(xué)界廣泛、深入地進(jìn)行了多方面的研究。盡管如此，由于銅綠假單胞菌的次生代謝產(chǎn)物種類極其豐富，就已被研究鑒定的就有24種［16］，這些次生代謝產(chǎn)物在抑制作物病原菌生長(zhǎng)和促進(jìn)作物生長(zhǎng)等方面的作用顯著，不僅對(duì)青枯病具有抑制作用，也能夠抑制除了青枯病外的腐霉菌、灰葡萄孢菌、稻瘟菌、尖鐮刀菌、鏈格孢菌、黑曲霉、紋枯病等眾多植物病原菌［17-23］，因此該類菌在農(nóng)業(yè)生物防治方面的作用不容忽視。本研究說明銅綠假單胞菌對(duì)煙草青枯病具有防治效果，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。