周好好 黃翠萍

1湖北醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院,十堰442000;2湖北科技學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院,咸寧437100

支氣管哮喘(哮喘)是一種以嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和氣道黏膜下層CD4+T 淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主的免疫功能異常的慢性氣道炎癥性疾病。microRNA-155(miR-155)是位于人類第21號(hào)染色體的BIC基因外顯子3編碼的一種多功能RNA,其與癌癥以及先天和獲得性免疫疾病相關(guān)[1],被證實(shí)與哮喘氣道炎癥關(guān)系密切。環(huán)氧合酶-2/前列腺素E2(cyclo-oxygen-ase-2/prostaglandin E2,COX-2/PGE2)參與驅(qū)動(dòng)氣道重塑的細(xì)胞反應(yīng),長(zhǎng)期以來被認(rèn)為在哮喘氣道炎癥的發(fā)病中起關(guān)鍵作用,可以快速而強(qiáng)烈地表達(dá)以響應(yīng)各種促炎細(xì)胞因子和介質(zhì)[2],通過這些介質(zhì)和化學(xué)引誘物引起細(xì)胞浸潤(rùn)并因此延長(zhǎng)炎癥反應(yīng),有助于哮喘氣道炎癥環(huán)境[3]。研究證實(shí),COX-2 表達(dá)的調(diào)節(jié)與組蛋白翻譯后修飾和miRNAs等有關(guān)[4-5],但 miR-155-5p 是否能夠調(diào)控COX-2的表達(dá)尚未報(bào)道。本研究通過觀察哮喘小鼠肺組織中miR-155-5p的變化及其拮抗劑對(duì)COX-2表達(dá)的影響,以探討miR-155在哮喘中的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)健康雌性BALB/c小鼠(由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,許可證號(hào)：11400700254656)28只,6～8 周齡,體質(zhì)量(20±2)g。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 卵清蛋白(ovalbumin,OVA)(美國(guó)sigma,純度62%～88%),4%氫氧化鋁凝膠(中國(guó)西安赫特,500 ml),mmu-mir-155-5p antagomir(中 國(guó) GenePharma,2OD),MircroRNA inhibitor NC(中 國(guó) GenePharma,1OD),Mmu-miR-155-5p探針法RT-PCR 試劑盒(中 國(guó) GenePharma),M-COX-2 RT-PCR 試 劑 盒(中國(guó)GenePharma),PGE2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(中國(guó)上海酶聯(lián)生物科技),兔抗COX-2(美國(guó)CST)。402A I超聲霧化器(中國(guó)上海魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司),多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司),熒光定量PCR 儀(美國(guó)Bio-Tek 公司),3-18K高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組 適應(yīng)環(huán)境7 d,28只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、哮喘模型組、antagomir陰性對(duì)照組、antagomir干預(yù)組,每組7只。

1.3.2 模型制備 根據(jù)文獻(xiàn)分致敏和激發(fā)兩個(gè)階段[6]。第0、7、15天三次致敏,正常對(duì)照組腹腔注射0.2 ml生理鹽水,其余各組腹腔注射0.2 ml致敏液(含4 mg OVA+150μl氫氧化鋁)。第22～27天為激發(fā)階段,將小鼠置于霧化箱內(nèi)(20 cm×20 cm×30 cm),每天霧化40 min,正常對(duì)照組霧化溶液為生理鹽水,其余各組使用10% OVA 生理鹽水作為激發(fā)液。第23、25、27天激發(fā)前6 h,正常對(duì)照組和哮喘模型組尾靜脈注射0.3 ml生理鹽水,antagomir陰性對(duì)照組與antagomir干預(yù)組分別尾靜脈注射0.3 ml MircroRNA inhibitor NC和0.3 ml mmu-miR-155-5p antagomir。

1.3.3 標(biāo)本采集及處理 各組小鼠末次激發(fā)24 h后,腹腔注射10%水合氯醛0.1 ml(400 mg/kg)麻醉,摘眼球取眼球血,4 ℃冰箱血液自然凝固,過夜,4 ℃,3 000 r/min,離心20 min,離心半徑15 cm,取血清,保存-20 ℃冰箱,參照試劑盒做ELISA 檢測(cè)PGE2。小鼠處死后,取右肺門中葉,生理鹽水沖洗后,10%多聚甲醛固定24 h,做3μm 切片,用于HE 染色,觀察形態(tài)學(xué)變化,其余肺組織生理鹽水沖洗后,液氮速凍,保存于-80 ℃冰箱。

1.3.4 肺組織miR-155-5p和COX-2 m RNA 的檢測(cè) 采用 RT-PCR 檢測(cè) miR-155-5p 及 COX-2 m RNA 的表達(dá)。檢測(cè)試劑盒購(gòu)自GenePharma,按說明書進(jìn)行操作。

Trizol法提取RNA：取-80 ℃冰箱中保存的新鮮冰凍肺組織,質(zhì)量約為100 mg,加入1 ml Trizol試劑,研磨成漿,移至無RNase EP 管中,裂解10 min；加入200μl氯仿,顛倒混勻數(shù)次,室溫放置5 min；4 ℃,12 000 r/min,離心15 min,離心半徑15 cm,可見分成上層、中層、下層三相；轉(zhuǎn)移上層水相(約400μl)于1.5 ml新EP管中,加入400μl異丙醇,混勻后室溫靜置10 min；4 ℃,12 000 r/min,離心10 min,離心半徑15 cm；棄上清,加入無RNase的75%乙醇1 ml,渦旋混勻后,4 ℃,10 000 r/min,離心5 min,離心半徑15 cm；棄上清,加入無RNase的75%乙醇1 ml,渦旋混勻后,4℃,10 000 r/min,離心5 min,離心半徑15 cm；棄上清,空氣中干燥RNA 沉淀5～10 min,將沉淀溶于20μl DEPC水中；取溶解后的RNA 2μl測(cè)定OD260、OD280以及 OD260/OD280 值,計(jì)算 RNA 的純度和濃度。

逆轉(zhuǎn)錄：按反應(yīng)體系[RNA 2μl+Random N6(100μmol/L)5μl]加熱70 ℃5 min后,馬上放于冰盒上,反應(yīng)物按20μl體系進(jìn)行,反應(yīng)條件：37 ℃60 min,85 ℃5 min。

聚合酶鏈反應(yīng)：miR-155-5p和COX-2 m RNA引物序列購(gòu)自吉瑪基因。M-COX-2引物序列(上游： 5'-CAAGCACAATAGATGCACAAGAAG-3',下游：5'-ATATAGAATGCGTAGAGAGGGGAG-3'),GAPDH 引物序列(上游：5'-ATGGGTGTGAACCACGAGA-3',下 游：5'-CAGGGATGATGTTCTGGGCA-3'),COX-2和GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物分別為98 bp和229 bp。miR-155-5p按20μl體系進(jìn)行,反應(yīng)條件：95 ℃3 min；95 ℃12 s,62 ℃ 40 s,40 個(gè) 循 環(huán)。COX-2 mRNA 按20μl體系進(jìn)行,反應(yīng)條件：95 ℃3 min；95 ℃12 s,62 ℃40 s,40個(gè)循環(huán)。繪制溶解曲線,最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進(jìn)行分析。

1.3.5 肺組織COX-2蛋白的檢測(cè) 取凍存的肺組織50 mg,放入勻漿器中進(jìn)行冰上碾壓,然后加入400μl裂解液(RIPA 1 ml+10μl PMSF+10μl磷酸酶抑制劑)冰上裂解30 min,用移液器將裂解液移至1.5 ml 離心管中,然后在4 ℃下12 000 r/min離心5 min,離心半徑15 cm,取上清即為總蛋白,-20 ℃保存?zhèn)溆?BCA 法測(cè)蛋白濃度。將提取的蛋白加入蛋白上樣緩沖液,放入沸水中進(jìn)行沸水浴10 min,變性完后冷卻至室溫再放入-20 ℃保存。上樣蛋白量40μg,5%濃縮膠,12%分離膠進(jìn)行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)膜(PVDF膜),用含5%脫脂奶粉的TBST 浸泡PVDF膜,室溫?fù)u床封閉2 h。敷一抗COX-2(1∶1 000),于4℃搖床孵育過夜,次日室溫下洗膜,敷HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(1∶50 000),37 ℃搖床孵育2 h。TBST洗膜,DAB顯色。用圖象分析儀測(cè)定各條帶的吸光度值定量分析。

1.3.6 血清PGE2的測(cè)定 取出-20 ℃凍存的血清,參照ELISA 試劑盒說明書,平行重復(fù)試驗(yàn)并記錄結(jié)果。

1.3.7 肺組織病理學(xué)觀察 HE 染色觀察支氣管壁及血管壁周圍有無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件及GraphPadPrism 5.0軟件進(jìn)行分析。進(jìn)行單因素方差分析(oneway-ANOVA),全部數(shù)據(jù)以表示,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的活動(dòng)表現(xiàn) 致敏階段,各組小鼠表現(xiàn)均正常,各組間無差異；激發(fā)階段,哮喘模型組和antagomir陰性對(duì)照組小鼠出現(xiàn)打噴嚏、搔鼻、安靜少動(dòng)、點(diǎn)頭樣喘息等典型的哮喘癥狀,而antagomir干預(yù)組小鼠的哮喘癥狀不典型,正常對(duì)照組小鼠表現(xiàn)正常。

2.2 各組小鼠肺組織miR-155-5p 和COX-2 mRNA表達(dá)變化 哮喘模型組miR-155-5p、COX-2 m RNA 的表達(dá)均較正常對(duì)照組顯著升高(t=-21.420、-15.270、-9.613,P值均＜0.01)；antagomir干預(yù)組miR-155、COX-2較哮喘模型組顯著降低(t=-15.273、-12.421,P值均＜0.01)。miR-155-5p和COX-2 mRNA 的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.977,P＜0.01)。見圖1,表1。

圖1 各組小鼠肺組織 miR-155-5p 和COX-2 mRNA 的表達(dá)

表1 各組小鼠肺組織miR-155-5p和COX-2 m RNA 的表達(dá)()

表1 各組小鼠肺組織miR-155-5p和COX-2 m RNA 的表達(dá)()

注：COX-2為環(huán)氧合酶2；與正常對(duì)照組相比,a P ＜0.01；與哮喘模型組相比,b P ＜0.01

組別 鼠數(shù) miR-155-5p COX-2 mRNA正常對(duì)照組 7 1.07±0.07 1.01±0.08哮喘模型組 7 1.99±0.03a 2.04±0.09a antagomir陰性對(duì)照組 7 2.09±0.07a 2.10±0.06a antagomir干預(yù)組 7 1.40±0.02b 1.40±0.02b

各組目的基因miR-155-5p、COX-2 m RNA 和內(nèi)參基因U6、GAPDH 擴(kuò)增曲線圖和融解曲線圖。見圖2～9。

圖2 各組目的基因miR-155-5p擴(kuò)增曲線圖

圖3 各組內(nèi)參基因U6擴(kuò)增曲線圖

圖4 各組目的基因COX-2 m RNA 擴(kuò)增曲線圖

圖5 各組內(nèi)參基因GAPDH 擴(kuò)增曲線圖

從以上各組目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線圖和融解曲線圖可以看出(圖2～9),各標(biāo)本均有擴(kuò)增,且擴(kuò)增效率高。各標(biāo)本融解曲線無二聚體及非特異性擴(kuò)增,相同目的基因各峰值基本一致,說明引物設(shè)計(jì)合理,特異性高。Ct值采用2-△△Ct進(jìn)行相對(duì)定量。

圖6 各組目的基因miR-155-5p融解曲線圖

圖7 各組內(nèi)參基因U6融解曲線圖

圖8 各組目的基因COX-2 m RNA 融解曲線圖

圖9 各組內(nèi)參基因GAPDH 融解曲線圖

2.3 各組小鼠肺組織COX-2蛋白的變化 哮喘模型組和antagomir陰性對(duì)照組COX-2 蛋白的表達(dá)較正常對(duì)照組和antagomir干預(yù)組顯著升高(P＜0.01)。見圖10,表2。

2.4 各組小鼠血清PGE2 的表達(dá) 哮喘模型組PGE2的表達(dá)較antagomir干預(yù)組顯著升高(t=6.025,P＜0.01)。COX-2蛋白和血清PGE2的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.931,P＜0.01)。見圖10,表2。

圖10 各組小鼠肺組織COX-2蛋白變化

表2 各組小鼠肺組織COX-2表達(dá)和血清PGE2的表達(dá)的變化()

表2 各組小鼠肺組織COX-2表達(dá)和血清PGE2的表達(dá)的變化()

注：COX-2為環(huán)氧合酶2；PGE2為前列腺素E2；與正常對(duì)照組相比,a P ＜0.01；與哮喘模型組相比,b P ＜0.01

組別 鼠數(shù) COX-2(OD值)PGE2(μg/L)正常對(duì)照組 7 0.26±0.01 84.34±9.69哮喘模型組 7 0.61±0.05a 174.71±13.09a antagomir陰性對(duì)照組 7 0.64±0.02a 166.96±9.23a antagomir干預(yù)組 7 0.36±0.03b 115.14±11.05b

2.5 肺組織病理學(xué)變化 哮喘模型組小鼠較正常對(duì)照組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；antagomir干預(yù)組與哮喘模型組相比,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕；antagomir陰性對(duì)照組與哮喘模型組相當(dāng)。見圖11。

3 討論

微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長(zhǎng)度為19～24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA 分子,主要存在于真核生物中,具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性。miRNA 最早在1993 年由Lee等在秀麗新小桿線蟲中發(fā)現(xiàn),隨后對(duì)其研究越來越廣泛,并確定了上千種miRNAs。miRNA 通過與靶基因的3'UTR 區(qū)完全或不完全配對(duì)結(jié)合,誘導(dǎo)靶m RNA 降解或翻譯抑制,實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的調(diào)控,在各種生物過程中發(fā)揮重要作用,包括細(xì)胞凋亡、癌癥的發(fā)生和炎癥的形成。一個(gè)單獨(dú)的miRNA 可以作用于多個(gè)靶位基因,同樣一個(gè)靶位基因也可以由多個(gè)miRNAs來調(diào)控,對(duì)疾病具有網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的作用[7],是免疫系統(tǒng)中基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子。miRNA 表達(dá)失調(diào)與人類疾病密切相關(guān),最近的研究證實(shí)了miRNA 在過敏性氣道炎癥中發(fā)揮重要作用[8-9]。最近的一份報(bào)告證明HLA-G(一種哮喘易感基因)的3'-UTR 上的單核苷酸多態(tài)性影響三種miRNA 與該基因的結(jié)合[10]。由于哮喘肺組織中基因和蛋白表達(dá)顯著變化的特征,過敏性氣道炎癥可能對(duì)miRNA 的調(diào)節(jié)特別敏感。在過敏性氣道炎癥模型中：miR-21通過IL-12p35的負(fù)調(diào)控在Th2 細(xì)胞的極化中起作用；miR-126 與變應(yīng)性氣道炎癥的房塵螨小鼠模型中的天然和適應(yīng)性免疫應(yīng)答相關(guān),其拮抗作用顯著抑制Th2細(xì)胞的效應(yīng)功能和嗜酸粒細(xì)胞氣道炎癥的發(fā)生；miR-145的拮抗作用表現(xiàn)出對(duì)嗜酸性氣道炎癥、Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生、黏液分泌過多和氣道高反應(yīng)性的抑制作用。已有研究推測(cè)[11],miRNA-126下調(diào)可能通過調(diào)節(jié)Th平衡,造成Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答,使B淋巴細(xì)胞增殖分泌IgE,導(dǎo)致嗜酸粒細(xì)胞及炎癥介質(zhì)IL-6增高。有文獻(xiàn)報(bào)道,過表達(dá)miRNA-26a能使氣道平滑肌細(xì)胞增生肥厚,導(dǎo)致氣道重塑增加[12]。Kumar等[13]證實(shí)Let-7緩解過敏性哮喘氣道炎癥,降低氣道高反應(yīng)性,防止黏膜上皮細(xì)胞化生及上皮細(xì)胞纖維化的作用。上述研究突出了miRNA 對(duì)過敏性疾病發(fā)病機(jī)制的調(diào)控作用及其作為抗炎靶標(biāo)在治療過敏性疾病中的潛在作用,由此,為針對(duì)miR-155的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

圖11 肺組織病理學(xué)變化 HE ×400 A：正常對(duì)照組；B：哮喘模型組；C：antagomir陰性對(duì)照組；D：antagomir干預(yù)組

miR-155在活化的B細(xì)胞、T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中的表達(dá)均顯著增加,這與免疫細(xì)胞的活化、增殖、分化和免疫應(yīng)答密切相關(guān),被認(rèn)為在維持人類免疫系統(tǒng)功能中發(fā)揮重要作用[14]。Calame[15]認(rèn)為,在免疫應(yīng)答的效應(yīng)階段,miR-155是清除病原體和凋亡細(xì)胞免疫效應(yīng)階段的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑,為B 細(xì)胞抗原特異性抗體的產(chǎn)生和生發(fā)中心反應(yīng)所必需,參與B 細(xì)胞成熟、分化和感染反應(yīng)期間的抗體類轉(zhuǎn)換。miRNA-155具有數(shù)百個(gè)可調(diào)節(jié)的潛在靶向基因,在T 輔助細(xì)胞分化和生化中心反應(yīng)的調(diào)解中具有重要作用,可導(dǎo)致最優(yōu)的T 細(xì)胞依賴的抗體反應(yīng),部分是由于細(xì)胞因子產(chǎn)物的調(diào)節(jié)[16],其表達(dá)與前炎癥轉(zhuǎn)錄程序密切相關(guān),數(shù)小時(shí)內(nèi)即可對(duì)合適的刺激做出反應(yīng)[17]。Malmh?ll等[18]研究表明,缺乏miR-155的表達(dá)導(dǎo)致抗原刺激的小鼠肺內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞炎癥、黏液分泌、Th2 細(xì)胞數(shù)及其細(xì)胞因子明顯減少,提示miR-155在Th2介導(dǎo)的過敏性嗜酸粒細(xì)胞炎癥發(fā)生發(fā)展過程中必不可少。據(jù)報(bào)道,糖皮質(zhì)激素通過下調(diào)miR-155的表達(dá)來減弱脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和敗血癥。實(shí)際上,糖皮質(zhì)激素的抗炎作用可以通過抑制miR-155 的表達(dá)來逆轉(zhuǎn),因此miR-155的類固醇抑制可能是免疫反應(yīng)中的一種新功能途徑[8],為miR-155參與哮喘發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究提供新的依據(jù)。

COX 又稱前列腺素內(nèi)氧化酶還原酶,是一種具有環(huán)氧化酶和過氧化氫酶活性的雙功能酶,通過調(diào)節(jié)花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的代謝過程直接參與哮喘氣道炎癥。OVA 刺激 COX-2 缺陷(COX-2-/-)小鼠的肺、淋巴結(jié)和支氣管肺泡灌洗液中 Th17 細(xì)胞分化明顯下降,提示COX-2 是Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子,參與過敏性肺部炎癥[19]。炎癥介質(zhì)刺激人氣道平滑肌細(xì)胞COX-2表達(dá)上調(diào),PGE2 分泌增多,激活環(huán)磷酸腺苷/激酶A 途徑,破壞β2腎上腺素能受體G 蛋白α亞單位的結(jié)合,降低β2 腎上腺素能受體激動(dòng)劑反應(yīng)性,是導(dǎo)致哮喘患者癥狀不能有效控制的重要原因[20]。

COX-2表達(dá)的調(diào)節(jié)與組蛋白翻譯后修飾和miRNAs等有關(guān),本研究通過real-time PCR 和western-blot方法檢測(cè)各組小鼠肺組織中miR-155-5p、COX-2 m RNA 及 COX-2 蛋白的表達(dá),通過ELISA 方法檢測(cè)各組小鼠血清PGE2 的水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),哮喘模型組小鼠肺組織miR-155-5p 和COX-2/PGE2的表達(dá)均較正常對(duì)照組顯著升高；antagomir 干預(yù)組小 鼠 肺組織 miR-155-5p 和COX-2/PGE2的表達(dá)明顯低于哮喘模型組；此外,miR-155-5p和COX-2的表達(dá)呈正相關(guān),COX-2和血清 PGE2 的表達(dá)呈正相關(guān)。 結(jié)果提示,miR-155-5p很可能在哮喘發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用,可能是通過COX-2/PGE2途徑調(diào)控哮喘。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),miR-155-5p在哮喘小鼠肺組織中表達(dá)上調(diào),可能參與哮喘發(fā)病機(jī)制,可能通過COX-2/PGE2途徑調(diào)控哮喘。抑制miR-155-5p表達(dá)有助于改善哮喘癥狀,減輕炎癥因子表達(dá),有望成為哮喘治療的新策略。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突